一种牛大力细胞水的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种牛大力细胞水的制备方法及其应用 (Preparation method and application of beautiful millettia root cell water ) 是由 张兵 朱思阳 张炽坚 何廷刚 艾勇 张文环 于 2020-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种牛大力细胞水的制备方法,采用低温真空提取技术与酶解技术的结合,不需要添加任何溶剂,在较低的温度下能得到纯天然的牛大力细胞水,水中含有大量的芳类物质(芳香酮、芳香醇),香气宜人。并且,牛大力残渣中保持有大量的多糖、黄酮、生物碱、甾醇类等物质,芳香性会降低,具有更好的药用价值,适于不喜欢牛大力芳香气味的人服用。(The invention discloses a preparation method of beautiful millettia root cell water, which adopts the combination of a low-temperature vacuum extraction technology and an enzymolysis technology, does not need to add any solvent, can obtain pure natural beautiful millettia root cell water at a lower temperature, contains a large amount of aromatic substances (aromatic ketone and aromatic alcohol) in the water, and has pleasant fragrance. In addition, the millettia speciosa champ residue contains a large amount of polysaccharide, flavone, alkaloid, sterol and other substances, the aromaticity is reduced, the medicinal value is better, and the millettia speciosa champ residue is suitable for people who dislike the aromatic smell of the millettia speciosa champ.)
技术领域
本发明涉及农产品处理
技术领域
，特别是涉及一种牛大力细胞水的制备方法及其应用。背景技术
牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤Millettia specisoa Champ的根，别名猪脚笠、山莲藕、金钟根、倒吊金钟、大力薯等，生长于山坡草丛中，分布于海南、福建、台湾、广西、广东、湖北、湖南，贵州、江西等地。化学成分研究表明，根中含多种黄酮类化合物，已确定结构有：蔓性千斤拔素(flemiphilippinin)C、D。牛大力还含有生物碱、香豆素类、多糖类、三萜类及植物甾醇等多种活性成分，牛大力气味甘香，性温和，具有壮阳，养肾补虚，强筋活络，平肝润肺之功效，用于肾虚、血气不旺、风湿骨痛等患者。
牛大力中含有大量的芳类物质、多糖、黄酮、生物碱、甾醇类，但是现有技术只限于多糖、黄酮、生物碱、甾醇类的提取，这是因为现有技术的方法主要是溶剂萃取法、冷榨法提取法(冷榨法是提取植物细胞液的常用手段，但是没有发现在牛大力根部细胞液提取的报道)。通过溶剂萃取法萃取后需要将溶液进行减压蒸馏，在蒸馏的过程中即使控制温度低于60℃，也会造成沸点交底的芳类物质大量蒸发，得到的产品几乎没有清香。并且，萃取法需要针对目标物质选用不同的溶解：如水、乙醇、石油醚等，乙醇和石油醚中会含有极少量的其他物质，这些物质极有可能会在减压浓缩过程中保留，对于服用者的健康带来一定的隐患。通过冷榨提取法提取后续溶液颜色难以脱除；植物体内芳香类物质提取量少；并且高沸点的芳香类物质难以提取出来。
酶解法也常用于植物细胞液的提取中。中国专利申请CN109730948A公开了一种采用超声低温旋蒸法和酶法相结合制备牡丹鲜花细胞水的方法：首先通过压榨法得到榨汁和残渣1，再将残渣1旋蒸得到细胞水1和残渣2，最后将残渣2进行酶解再旋蒸得到细胞水3。将榨汁、细胞水1/2混合后得到高收率牡丹花细胞水。该方法具有较高的提取效率，但是具有如下缺陷：(1)采用压榨法，后与真空提取法得到的液体混合，这样会带入多糖、色素和刺激气味，导致防腐和脱色问题；(2)工艺后期配合其他植物一起蒸馏，解决防腐问题，但是容易改变原有的牡丹花细胞水成分和气味！后期生产也无法控制品质。
发明内容
本发明的目的在于，克服上述技术缺陷，提供一种牛大力细胞水的制备方法，得到的牛大力细胞水中含有大量的具有清香怡人的芳类物质。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种牛大力细胞水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：不加入溶剂，将块状或片状牛大力在30℃-65℃、压力-60kPa～-101kPa下初步提取，牛大力细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1-2.5小时，得到初提液体和初提残渣；在初提液体中加入初始牛大力总质量为基准的0.2-0.4％的纤维素酶和0-0.1％果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在35℃-45℃、压力-60kPa～-101kPa条件下再次提取，3-6小时提取结束，收集得到牛大力细胞水。
所述的牛大力切片为1mm-10mm。切片的目的是为了减少牛大力厚度提高细胞水流程速率。
所述的初提阶段的温度为35℃-50℃，压力为-70kPa～-101kPa。
初步提取时间是关键参数之一，如果时间太短，提取出的牛大力细胞水过少，加入酶后细胞水很难湿润牛大力残渣表面，导致酶解不能正常进行。如果初步提取时间过长，细胞水流出过多，降低了后续提取效率，也增加了酶解时间带来过度酶解的风险。本发明通过在初提细胞水中加入一定量的酶，再次投入容器中对牛大力残渣进行提取，具有如下有益优点。第一、初提细胞水表面张力低，渗透性好；第二、初提细胞水pH为3-7，无需额外调节pH，有利于提高酶活性；第三、酶解能够加速破壁；第四、低温真空技术。通过四种效应的协同，能够在较低温度(35-50℃)下控制酶解速度，加快细胞液流出速度。再次提取步骤中的前1小时左右会蒸除掉倒回容器内的初提细胞水，加快酶解速度，缩短酶解的时长(此时初提液体的多少就至关重要，多了会延长酶解时间，少了会缩短酶解时间)，也避免了传统酶解法需要加入大量的水稀释细胞液以及酶解过度带来的刺激气味。
关于初提液体的渗透性，通过实验发现，当采用细胞液作为溶剂法的溶剂提取牛大力残渣时，能够带出大量的黄酮和多糖等大分子物质以及易挥发活性成分。相比采用纯水作为溶剂，细胞水作为溶剂能够提取出更多的黄酮和多糖等活性成分。
优选的，再次提取时间为4小时-5小时。通过时间控制，使酶解程度与细胞液提取量达到一个高效的平衡，细胞液提取率达到60％以上，同时细胞液保持高品质。
在提取过程中进行搅拌，搅拌速度为1-150转/分钟。通过搅拌能够让牛大力片不断的翻动，防止贴壁，而造成高温破坏活性，提高切片断面暴露在空气中的时间，暴露在空气的一面能够更好的流出细胞液。
收集过程中进行冷凝，温度为-10～8℃。
所述的牛大力选用牛大力根部。新鲜的牛大力根部不含有霉变，鲜嫩多汁。本发明采用新鲜的牛大力根部，采摘后无暴晒或烘烤，无腐烂和霉变。
上述的牛大力细胞水应用，用于护肤品、食品、保健品等。
所述的牛大力细胞水中含有丰富的芳类物质；所述的芳类物质包括3-辛酮、3-辛醇、2-庚酮、2-庚醇。牛大力细胞水中的物质主要是通过进行顶空气质表征。
通过本发明的方法制备得到的牛大力细胞水，纯天然，没有其他溶剂与添加剂，并且香气宜人，更能使用在高端的护肤品、食品、保健品中。
本发明相比于现有技术，具有如下有益效果：
通过单一低温-真空提取技术，在提取后期细胞水的渗出率较低，需要更长的提取时间。并且，得到的牛大力细胞水中含有的活性成分仅有不足60种，清香但不浓郁。通过酶解法得到的牛大力细胞水，首先需要加入一定量的水从而稀释了细胞水的浓度，如果采用蒸馏浓缩法会大大损失活性成分；其次，即使通过双重过滤，也无法得到的澄清，而且味道具有刺激性，品质低。
通过本发明的低温真空提取技术与酶解法(采用渗透性更强的初提细胞液作为酶解溶剂)的结合，能够快速得到澄清透明、清香浓郁的高品质牛大力细胞水(60多种活性成分)。同时不含有多糖等容易导致霉变的物质，提升了保存稳定性。并且，通过本发明的方法，相比于纯酶解法，得到的牛大力残渣保存度高，可以制备成为保健品或食品，配合牛大力细胞水使用。
附图说明
图1：牛大力细胞水安全性测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例所用的牛大力根部是新鲜无霉变的，洗净沥干水分后进行提取。
实施例1：不加入任何溶剂，50kg牛大力根部切片(2mm厚)在55℃、压力-90kPa下初步提取，牛大力细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取1.8小时，得到初提液体和初提残渣；在初提液体中加入110g纤维素酶和40g果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在50℃、压力-101kPa条件下再次提取，3.5小时提取结束，全程搅拌60转/份，收集得到30.8kg牛大力细胞水，液体澄清透明、气味清新浓郁。
实施例2：不加入任何溶剂，50kg牛大力根部切片(2mm厚)在45℃、压力-95kPa下初步提取，牛大力细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取2小时，得到初提液体和初提残渣；在初提液体中加入120g纤维素酶和20g果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在45℃、压力-101kPa条件下再次提取，4.5小时提取结束，全程搅拌60转/份，收集得到31.4kg牛大力细胞水，液体澄清透明、气味清新浓郁。
实施例3：不加入任何溶剂，50kg牛大力根部切片(2mm厚)在60℃、压力-100kPa下初步提取，牛大力细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取1.5小时，得到初提液体和初提残渣；在初提液体中加入150g纤维素酶和30g果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在40℃、压力-101kPa条件下再次提取，6小时提取结束，全程搅拌60转/份，收集得到32.7kg牛大力细胞水，液体澄清透明、气味清新浓郁。
对比例1：不加入任何溶剂，50kg牛大力根部切片(2mm厚)在60℃、压力-100kPa下提取，牛大力细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取6小时，全程搅拌60转/份，收集得到28.7kg牛大力细胞水，液体透明、气味清新但是较淡。
对比例2：50kg牛大力根部切片(2mm厚)，与5kg水、200g纤维素酶和80g果胶酶混合后子在50℃下搅拌45分钟，后在50℃、压力-100kPa下提取，牛大力细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取6小时，全程搅拌60转/份，收集得到36.9kg牛大力细胞水，液体浅色、气味含有些许刺激性。
对比例3：50kg牛大力根部切片(2mm厚)，与5kg水、200g纤维素酶和80g果胶酶混合后子在60℃下提取，提取6小时，全程搅拌60转/份，过滤后收集得到37.1kg牛大力细胞水，液体有细小悬浮颗粒并且异味重。
表1：实施例和对比例所提取牛大力细胞液检测结果
各项测试方法：
(1)牛大力细胞水活性成分分析：在80℃进样温度下进行顶空气质检测：
1.仪器信息：
Agilent 7980A GC；
MS:5975C；
50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头，美国SUPELCO公司。
2.GC-MS条件：
色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱子(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为He，流速1mL/min，分离比5:1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5min，以8℃/min，升至250℃，保持5min。
质谱条件：EI电离源，能量70eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30-400m/z。
3.样品前处理：
将5mL样品、1g NaCl置于20ml顶空瓶中，拧紧瓶盖。于搅拌模式80℃下平衡5min后，用固相微萃取针80℃下萃取5min，然后于进样口解析5min。
(2)防腐挑战测试：将制备得到的牛大力细胞水，添加到如下喷雾配方中。接种一定数量的细菌和真菌，间隔0天、7天、14天、21天、28天按照美国药典USP32<51>微生物防腐功效测试的检测方法检测微生物数量变化情况表1：实验喷雾配方
原料
含量
丁二醇
2.4％
甜菜碱
0.04％
甘草酸二钾
0.05％
可溶性蛋白多糖
0.05％
蜂王浆提取物
0.05％
牛大力细胞水
余量
柠檬酸
调节PH＝6-7
(3)牛大力细胞水安全性测试：HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，对HaCaT细胞的细胞毒性，可作为对皮肤安全性的参考数据。正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质还原为带颜色的结晶状物质，沉积在细胞周围，该变化可通过酶标仪读取OD值，通过OD值与空白对照组的比较，可以得知细胞的相对生长情况(仅测试实施例1所提取的牛大力细胞液，结果请见附图1)。