一种酶法制备富含亚麻酸甘油二酯的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备富含亚麻酸甘油二酯的方法 (Method for preparing diglyceride rich in linolenic acid by enzyme method ) 是由 王小三 陈烨 王熠璠 赵昕辰 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法制备富含亚麻酸甘油二酯的方法,属于食品加工技术领域。本发明利用酶法甘油解法制备富含亚麻酸甘油二酯,采用蒸馏或吸附的方法降低富含亚麻酸原料中的过氧化值,以实现在酶促反应过程中最大程度保留脂肪酶活力的目的,从而提高甘油解反应过程中脂肪酶的重复使用次数,降低酶法制备甘油二酯的成本。本发明提供了一种高效率、低成本的酶法合成甘油二酯油脂的方法,避免了在酶促反应过程中脂肪酶容易失活的问题,本发明所采用的方法在油脂加工中具有极大的应用前景。(The invention discloses a method for preparing diglyceride rich in linolenic acid by an enzyme method, belonging to the technical field of food processing. The invention utilizes an enzymatic glycerolysis method to prepare diglyceride rich in linolenic acid, and adopts a distillation or adsorption method to reduce the peroxide value in the raw material rich in linolenic acid so as to achieve the aim of keeping the lipase activity to the maximum extent in the enzymatic reaction process, thereby improving the repeated use times of the lipase in the glycerolysis reaction process and reducing the cost for preparing the diglyceride by the enzymatic method. The invention provides a method for synthesizing diglyceride grease by an enzyme method with high efficiency and low cost, which avoids the problem that lipase is easy to inactivate in the enzymatic reaction process, and the method has great application prospect in grease processing.)
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种结构脂的制备方法，具体涉及一种酶法制备富含亚麻酸甘油二酯的方法。
背景技术
油脂通常是由甘油和脂肪酸脱水酯化合成的。大多数油脂中甘油三酯(TAG)含量最高，约占总量的95％以上。其他成分有甘油一酯(MAG)、甘油二酯(DAG)、游离脂肪酸、磷脂等。甘油二酯，尤其是1,3-甘油二酯(1,3-DAG)，其代谢途径不同于甘油三酯，具有抑制脂肪在体内的积累，帮助人体控制体重的作用。目前，现代社会的肥胖问题日益严重，甘油二酯作为食用油中甘油三酯的理想替代物，其研究受到广泛关注，具有广阔的市场。
DAG可以改善餐后和空腹的血脂水平，对不同的人群的实验均证实了这一效果。如对糖尿病患者的实验中，使用DAG替代TAG后，糖尿病或者空腹和餐后血脂的水平明显下降，对于控制具有高脂血症的糖尿病患者的血脂水平也有较好的效果。已有大量研究证实了DAG降低胆固醇水平、降低血脂的作用，因此，在医药和食品等行业，DAG具有广泛的应用前景。
目前，甘油二酯的酶法制备方法包括甘油和游离脂肪酸的直接酯化法、天然油脂的部分水解法和甘油解法。前两种方法制备甘油二酯过程中，酶解粗产物中都含有大量的游离脂肪酸，目前产物的得率不高，且粗产物中含有大量的游离脂肪酸，为后续精炼的工艺增加难度。酶法甘油解法制备甘油二酯得率高，且酶解过程中不产生游离脂肪酸，具有后续精炼工艺简便等特点，但制约酶法甘油解在制备甘油二酯油产业化应用中的主要障碍为脂肪酶价格高，重复利用次数有限等问题。
发明内容
[技术问题]
酶法甘油解在制备甘油二酯油产业化应用中酶重复利用次数少，且粗产物中游离脂肪酸含量高，精炼工艺难度大。
[技术方案]
本发明对所采用的富含亚麻酸油脂底物进行降过氧化值处理，然后使用酶促甘油解法制备富含亚麻酸甘油二酯，这种方法极大的增加了脂肪酶的重复使用次数，降低了工业化生产的成本，具有潜在的应用价值。
具体的，本发明提供了如下技术方案：一种酶法制备富含亚麻酸甘油二酯的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、原料处理：将富含亚麻酸油脂进行降过氧化值处理，所述过氧化值需降到4mmol/kg以下；
S2、富含亚麻酸甘油二酯合成：将S1处理后的富含亚麻酸油脂与甘油进行混合，添加或者不添加有机溶剂后，在脂肪酶的催化下进行反应，反应一定时间后，去除脂肪酶和甘油，得到富含亚麻酸甘油二酯。
优选地，S1步骤中，所述富含亚麻酸油脂为亚麻酸含量大于30％的天然油脂，优选亚麻籽油。
优选地，S1步骤中，降低富含亚麻酸油脂过氧化值的方法包括蒸馏法和吸附法中的任一种或两种。
优选地，所述蒸馏法包括脱臭、分子蒸馏中的任一种或两种。
优选地，所述脱臭的温度为120～200℃，时间为30～120min，操作压力不高于4mbar。
优选地，所述分子蒸馏的蒸发面温度为120～200℃，操作压力不高于4mbar。
优选地，所述吸附法的反应时间为25min以下。
优选地，所述吸附法的吸附剂包括硅胶、活性白土、活性炭、二氧化硅和凹凸棒土中的一种或几种，优选硅胶、活性炭。
优选地，反应底物甘油和富含亚麻酸油脂的摩尔比为(0.5～4)：1。
优选地，所述S2步骤使用的脂肪酶包括但不限于以南极假丝酵母(Candidaantarctica)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米根霉(Rhizopusoryzea)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)为来源的脂肪酶中的任一种或多种。
优选的，所述脂肪酶包括来源于米根霉(Rhizopus oryzea)的Lipase DF IM和/或Lipase“Amano”DF；来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的Novozym 435、Lipozyme435和/或Lipase CL“Amano”IM；来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的Lipozyme TL IM和/或Lipozyme TL 100L；来源于米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)Lipozyme RM IM和/或Lipozyme RM的为来源的脂肪酶中的任一种或多种；
优选地，所述富含亚麻酸甘油二酯的制备方法为间歇或者连续化制备工艺。
优选地，所述脂肪酶的添加量为反应底物总质量的3％～12％。
优选地，S2步骤中，使用的有机溶剂包括叔丁醇、异丙醇或叔戊醇的一种或几种。
优选地，步骤S2中，合成富含亚麻酸甘油二酯的反应温度为40℃～70℃，反应时间为3h～15h。
优选的，步骤S2中，反应体系的压力为不超过90mbar。
本发明还提供了上述方法在制备甘油二酯油脂领域中的应用。
本发明的有益效果：
富含亚麻酸的油脂容易氧化，本发明对酶法合成富含亚麻酸甘油二酯所需的原料进行降过氧化值处理，进而可有效增加酶的重复利用次数，降低生产成本，克服了工业化生产甘油二酯过程中脂肪酶成本高的问题。
此外，酶法甘油解制备甘油二酯油过程中产物中含有极低的游离脂肪酸含量，对后续脱酸工艺有利。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
1.甘油二酯分析方法：HPLC分析甘油二酯的方法和分析条件参考张瑜博士论文{张瑜.DHA和2-DHA-单甘酯的制备纯化及调节HepG2细胞脂质代谢的比较研究[D].江南大学博士学位论文，2019。
2.过氧化值分析方法：参照《GB5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》的方法分析过氧化值。
实施例1：(反应温度优化)
(1)原料经降过氧化值处理：对过氧化值为6.4mmol/kg的亚麻籽油进行脱臭处理，脱臭条件为180℃，2mbar，80min；处理后的原料过氧化值降为2.6mmol/kg。
(2)富含亚麻酸甘油二酯的合成：向经降过氧化值处理后的亚麻籽油中加入甘油(甘油和亚麻籽油的摩尔比为1:2)，然后加入来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶Lipozyme435，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL反应器中，快速升温至一定温度，反应8h，反应体系压力控制在80mbar以下。待反应结束后，回收脂肪酶并去除甘油，得到富含亚麻酸甘油二酯，最后使用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量。
探究第(2)步中反应温度对甘油解合成产物中甘油二酯含量的影响，结果见表1，可见，一定的温度范围内，酶催化温度升高有利于提高粗产物中甘油二酯含量，当酶促温度提高至50℃以上时，继续升高温度对产物中甘油二酯含量的影响很小。
表1第(2)步反应温度对粗产物中甘油二酯含量的影响
实施例2：(反应时间优化)
(1)原料经降过氧化值处理：对过氧化值为6.4mmol/kg的亚麻籽油进行脱臭处理，脱臭条件为180℃，2mbar，80min；处理后的原料过氧化值降为2.6mmol/kg。
(2)富含亚麻酸甘油二酯的合成：向经降过氧化值处理后的亚麻籽油中加入甘油(甘油和亚麻籽油的摩尔比为1:2)，然后加入来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶Lipozyme 435，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL反应器中，快速升温至50℃，反应一段时间，反应体系压力控制在80mbar以下。待反应结束后，回收脂肪酶并去除甘油，得到富含亚麻酸甘油二酯，最后使用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量。
探究第(2)步中反应温度对甘油解合成产物中甘油二酯含量的影响，结果见表2，可见，一定的温度范围内，酶催化时间的延长有利于提高粗产物中甘油二酯含量，当酶促反应时间超过10h时，继续延长时间反而导致粗产物中甘油二酯含量逐渐的降低。
表2第(2)步反应时间对粗产物中甘油二酯含量的影响
实施例3：(反应体系优化)
(1)原料经降过氧化值处理：对过氧化值为6.4mmol/kg的亚麻籽油进行脱臭处理，脱臭条件为180℃，2mbar，80min；处理后的原料过氧化值降为2.6mmol/kg。
(2)富含亚麻酸甘油二酯的合成：向经降过氧化值处理后的亚麻籽油中加入甘油(甘油和亚麻籽油的摩尔比为1:2)，然后加入来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶Lipozyme 435，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL反应器中，向反应器中添加底物总质量的2倍的有机溶剂或者不添加有机溶剂，随后快速升温至50℃，反应8h，无溶剂反应体系中，其操作压力控制在80mbar以下。待反应结束后，回收脂肪酶并去除甘油，得到富含亚麻酸油脂甘油二酯，最后使用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量，结果如表3所示。
表3第(2)步反应体系对粗产物中甘油二酯含量的影响
实施例4：(脂肪酶的优化)
(1)原料经降过氧化值处理：对过氧化值为6.4mmol/kg的亚麻籽油进行脱臭处理，脱臭条件为180℃，2mbar，80min；处理后的原料过氧化值降为2.6mmol/kg。
(2)亚麻籽油甘油二酯的合成：向经降过氧化值处理后的亚麻籽油中加入甘油(甘油和亚麻籽油的摩尔比为1:2)，然后加入来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶或者来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米根霉(Rhizopusoryzea)的脂肪酶，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL反应器中，随后快速升温至50℃，反应10h，反应体系压力控制在80mbar以下。待反应结束后，回收脂肪酶并去除甘油，得到富含亚麻酸油脂甘油二酯，最后使用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量，结果如表4所示。
表4第(2)步反应中脂肪酶的种类对粗产物中甘油二酯含量的影响
实施例5：(底物摩尔比的优化)
(1)原料经降过氧化值处理：对过氧化值为6.4mmol/kg的亚麻籽油进行脱臭处理，脱臭条件为180℃，2mbar，80min；处理后的原料过氧化值降为2.6mmol/kg。
(2)富含亚麻酸甘油二酯的合成：向经降过氧化值处理后的亚麻籽油中加入甘油，然后加入来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的Lipozyme 435脂肪酶，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL反应器中，，随后快速升温至50℃，反应8h，反应体系压力控制在80mbar以下。待反应结束后，回收脂肪酶并去除甘油，得到富含亚麻酸甘油二酯，最后使用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量，结果如表5所示。
表5第(2)步甘油和亚麻籽油的摩尔比对粗产物中甘油二酯含量的影响
实施例6：(不同的降过氧化值处理方法)
(1)原料经降过氧化值处理：对过氧化值为7.7mmol/kg的亚麻籽油进行降过氧化值处理，降过氧化值的条件参考表3(实施例中均降至4mmol/kg以下)。
(2)富含亚麻酸甘油二酯的合成：向经降过氧化值处理后的亚麻籽油中加入甘油(甘油和亚麻籽油的摩尔比为1:1)，然后加入来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的Lipozyme435脂肪酶，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL反应器中，随后快速升温至50℃，反应8h，反应体系压力控制在90mbar以下。待反应结束后，回收脂肪酶并去除甘油，得到富含亚麻酸甘油二酯，最后使用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量，结果如表6所示。
将第(2)步回收后的脂肪酶加入下一次酶法合成甘油二酯的反应中，其余条件与第一次反应一致，经过3次重复使用后，采用HPLC检测粗产物中甘油二酯的含量。
探究原料经不同的降过氧化值方法处理即分子蒸馏、脱臭和吸附后对所用脂肪酶活性维持情况的影响，同时考察了各方法下的各个条件，分别测得不同降过氧化值方法下，酶促反应中脂肪酶重复利用3次后得到的粗产物中甘油二酯含量，结果见表6。对比例中使用的是相同的原料，但不进行任何处理或者不在最优的条件下进行降过氧化值处理后，经酶促重复反应3次后，粗产物中甘油二酯的含量。
表6酶在重复使用3次后，酶促粗产物中甘油二酯的含量
从表6中可知，使用蒸馏和吸附方法处理原料均能有效提高酶重复利用率，在使用3次后仍保留有一定程度的酶活性。在使用蒸馏法降低原料的过氧化值过程中，要采用合适的温度和真空度，蒸馏(分子蒸馏或者脱臭)的温度过氧和过低都不利于原料过氧化值的降低，也不利用粗产物中甘油二酯含量的增加。总体而言，蒸馏法可以将原料的过氧化值降低到4mmol/kg以下，而吸附法降过氧化值更为高效，可以将原料中的过氧化值降低至1mmol/kg以下，因此，吸附法降过氧化值处理后的原料，在脂肪酶的催化下，粗产物中能得到更高含量的甘油二酯。此外，本方法得到的甘油二酯油脂中酸价低，符合食用植物油国家标准对其酸价的规定，因此，后续脱酸工艺可以省略或者简化。
当采用本发明的其他脂肪酶时，利用本发明的方法也能够有效的维持酶的活性，增加酶的重复利用次数，从而实现酶利用率的提高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。