具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本发明实施例中涉及到的催化酶的引物合成及基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成；细菌质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司；PCR反应体系2×Ape×HFFS PCR Master Mix购自艾科瑞生物工程有限公司公司；镍柱填料购自上海博格隆生物技术有限公司；所使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)预制胶购自金斯瑞生物科技有限公司；蛋白Marker为Transgene Blue Plus IV Protein Marker，购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；SDS-PAGE上样缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；SDS-PAGE快速染色液购自北京睿博兴科生物技术有限公司；蛋白超滤离心管购自MerckMillipore；蛋白脱盐柱PD-10购自美国GE life sciences；HPLC用乙腈和甲醇购自美国Fisher Chemical公司。

实施例1，本实施例采用BelK作为催化酶，合成(S)-6-硝基正亮氨酸，具体步骤如下：

1、BelK催化酶的合成

(1)基因合成和电转化

申请人委托苏州金唯智生物科技有限公司对基因belK(protein_id＝ARO49579.1)进行大肠杆菌密码子优化及基因合成，并通过NdeI+HindIII酶切位点连接到pET28a(+)表达载体，获得pET28a+belK蛋白表达质粒。将大肠杆菌BL21(DE3)于1.5mL离心管中37℃摇床培养5h，12000rpm离心1min，弃去上清，加入1mL无菌水12000rpm离心1min洗涤两遍，弃去上清液，加入质粒溶液1μL，混匀后转入电转杯。将电转杯放入电转仪，设定电压1350V进行电转化，结束后迅速向电转杯中加入1mL新鲜LB培养基，转入1.5mL离心管37℃摇床培养复苏1h，涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。

belK基因大肠杆菌密码子优化后的序列如下：

ATGACCACCGAGCGTAATCTGGATATGCCGGACCCGCAGCGCAACGATTTTCCGCTGCTGGCCGAATTTACAGCCGCCCTGACCAGTGTTAGCTTTGGCACCTGGCAGGAGCTGGTGGATGACTATGCCCATCGCGCAGAACTGGCAGGCGAATGTCGCCGCCTGGCCGATCTGGCATTTCGTGGTCGCGATGCCGCAGCCCGTGAACACCTGCATGACATCCTGACCGTGGTGTACGCATACGAATTTAGCCAGAGCGCAGCCCGTAATCCGGATCAGGATCCTCAGCCGATCCTGCGTGACGTGACCAGCGTGCTGGAGAACGCCATGCTGGATAATGAATTTCGCCAGGTGCCGGAAGAACTGTTAACCGGCTATCCGAGCGGTGAGAAAGAATATGTGCGCTGGCTGAAAGCCCTGATCCAGGATCATCCGGCAAGCGCACATCCGATGTATGCCGAGCACCTGACAAACGCAGCAACCGTGGAAGATATCCGCTTTCTGCTGGCACAGGAAACAAGCCTGGATCCTCGCTTCGACGATATCCTGGCCGTTATGCAGTTTGGCGCCACAGGCGCCGAGAAGATGGAGATTGCCGCAAACTACTGGGACGAAATGGGCAATGGCGAGTTTGCAGATGTGCATACCACCCTGTTTAGCCAGTGCCTGACCAGCATCGGCGTTGATCGTGGCTACATCGAAAGCAATCTGCTGCTGGCCGCCAAAGAGTGCGGCAATATTAGTGCAGGCCTGGCCCTGAGCCGCCGTCATTATCTGCGTGCCATCGGCTATTACGGCGTGACCGAATTTCTGGCACCGCGCCGCTTTCGTCAGCTGGTTACAGCCTGGGATCGCTTAGGTCTGCCCCCTGAAGGTAAGGTGTACCACGACATCCACATCAACGTGGATGCCCACCATGCCGCCGGTTGGTATAAGAACGTGATTGGCCCGGTTGTTGAACGTGATCCGGCCGCAGGTCGTGAAATTGCCCTGGGCACCTTCGTTCGCCTGAATACCAGCGCCTATTATCTGGATCGCGTGCTGGAAGTGTGCCAGAAACAACCGCTGCCGGCATAA。

BelK蛋白序列如下：

MTTERNLDMPDPQRNDFPLLAEFTAALTSVSFGTWQELVDDYAHRAELAGECRRLADLAFRGRDAAAREHLHDILTVVYAYEFSQSAARNPDQDPQPILRDVTSVLENAMLDNEFRQVPEELLTGYPSGEKEYVRWLKALIQDHPASAHPMYAEHLTNAATVEDIRFLLAQETSLDPRFDDILAVMQFGATGAEKMEIAANYWDEMGNGEFADVHTTLFSQCLTSIGVDRGYIESNLLLAAKECGNISAGLALSRRHYLRAIGYYGVTEFLAPRRFRQLVTAWDRLGLPPEGKVYHDIHINVDAHHAAGWYKNVIGPVVERDPAAGREIALGTFVRLNTSAYYLDRVLEVCQKQPLPA。

(2)蛋白表达和纯化

将质粒pET28a+belK电转化到大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种到50mL的LB(含卡那霉素50μg/mL)，放入37℃、200rpm摇床10h，经过基因测序正确后转接到2L的LB(含卡那霉素50μg/mL)，放入37℃、200rpm摇床4h，待菌液OD₆₀₀＝0.6左右时，加入六水合三氯化铁溶液至终浓度0.2mM，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)至终浓度0.1mM，放入25℃、200rpm摇床24h，之后离心收集菌体。加入破菌缓冲溶液(K₂HPO₄ 50mM，NaCl 300mM，咪唑5mM，甘油10％(v/v)，用盐酸调pH＝7.5)重旋菌体，1g菌体对应5mL破菌缓冲溶液。使用超高压细胞破碎仪(700bar左右)破菌三次至液体呈半透明状，4℃、14000rpm离心1h。离心后取上清，加入到镍柱中，依次用10mM、25mM、50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱蛋白，淋洗液暂存于4℃或冰浴。每种浓度留样进行SDS-PAGE检测。根据电泳结果收集目的蛋白，使用10kDa的蛋白超滤离心管浓缩蛋白，用蛋白脱盐柱PD-10脱除咪唑，将蛋白纯化溶液交换为脱盐缓冲溶液(K₂HPO₄ 50mM，NaCl 100mM，甘油10％(v/v)，DTT 1mM)。使用酶标仪检测蛋白浓度。每20μL分装一管，先放入液氮中速冻，之后-80℃保存备用。蛋白产量约65mg/L。电泳结果如图1所示。

2、BelK催化(S)-6-硝基正亮氨酸的生成

表1、反应体系(总体积100μL)

按照表1的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelK蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在保留时间约12.4min处产生一个新峰，分子量[M+H]⁺＝410，该峰在缺少L-赖氨酸、NADH、PMS或者BelK时均不存在(图2)，高分辨质谱显示该峰精确分子量为[M+H]⁺＝410.1385，推测分子式为C₁₈H₂₄N₃O₆S⁺，(计算值：[M+H]⁺＝410.1380)，与DNSC衍生后的(S)-6-硝基正亮氨酸相符，推测BelK将L-赖氨酸的6-氨基氧化生成(S)-6-硝基正亮氨酸。

为了进一步确定产物为(S)-6-硝基正亮氨酸，申请人按照文献方法(Eur.J.Org.Chem.2006,1525-1534)化学合成了(S)-6-硝基正亮氨酸标准品，将化学合成的(S)-6-硝基正亮氨酸按照上述方法与DNSC衍生，HPLC-ESI-MS显示DNSC衍生后的(S)-6-硝基正亮氨酸与本发明方法合成的产物具有相同的保留时间、分子量和紫外吸收谱图，具体如图2所示，进一步说明了BelK催化酶可以高区域选择性的氧化L-赖氨酸的6-氨基生成(S)-6-硝基正亮氨酸，而2-氨基完全不发生氧化。

实施例2，本实施例采用HrmI作为催化酶，合成(S)-6-硝基正亮氨酸，具体步骤如下：

1、HrmI(protein_id＝AEH41787.1)催化酶的合成：合成过程及方法同实施例1中的BelK，电泳结果如图1所示。

hrmI基因大肠杆菌密码子优化后的序列如下：

ATGATCCCGGAAAGTTTTAAAATCGACCGCAGCGTCGTTGAAGAATTTCTGGCGCTGGATCCGGACGCTTGGGAACGTCTGAACGCAGATTATACCGCACGTCGTCGTATTGGCGAAGCGTGCCGTGCACTGAGTCGTCACGCATTTGTTGAAGAAGATCCGTCTGCACTGGAAGAACTGCACGATGTTCTGGCGCTGATTTATCAGCAGGATTTTTCTGGCGCACCGGTTGAACTGCTGGGTTGCGAAACCCAACCGGTTCTGCGCGATATTGCAGCAATTCTGGAAGGCGCTGTTCTGGCAGCGGAACTGGATAGCATTAGCGAAGAACAGATTAGCGCGTATCCGCGTTCTGGTAAAGAGTACGTCCACTGGCTGAAACGCGTTATTGGCGAACATCCGGCAGCAGGTCATCCGTTTTATCGCGATTTTGTTCCGACCCGCGCAACCGAAGGCGATTTTCGTTTCTACCTGGCACAGGAAACCAACCTGGATCCGAAATTCGACGACATCCTGGCGTTTATGCAAATTGGCGCAGCACCGGACGAAAAAATGGAAATTGCGGGCAACTACTGGGACGAAATGGGTAACGGTAAACCGGCAGAGGTTCACACCGCTATGTTTGCACATGCACTGGACGCACTGGACGTTAACGACGATTATATCCGCCGTAATCTGCTGCCGGAAGCAAAAGCAAGCGGTAATCTGGCAAGCTGTCTGGCGATTAGCCGCCGTCATTACTACAAAAGCGTTGGCTTCTTTGGCGTCACCGAATATCTGGTTCCGCGTCGCTTTAAACTGGTCGTTGATCGTTGGGCTGATATTGGTCTGCCGCGCGAAGGTATTGCGTATCACGACGCGCATATTTCCATTGATGCGGTTCACGCAAGCGGTTGGTTTAAAAACGTTATTGCGCCGGCAGTTGATCGCGATCCGCGCGTTGGTCGCGAAATTGCAGTTGGTGCACTGATTCGTCTGAATAGCAGCCAACGTTACCTGGATTCCCTGCTGATGCATCTGCATCATGATAGCGCAGCACATACCAGTTAA。

HrmI蛋白序列如下：

MIPESFKIDRSVVEEFLALDPDAWERLNADYTARRRIGEACRALSRHAFVEEDPSALEELHDVLALIYQQDFSGAPVELLGCETQPVLRDIAAILEGAVLAAELDSISEEQISAYPRSGKEYVHWLKRVIGEHPAAGHPFYRDFVPTRATEGDFRFYLAQETNLDPKFDDILAFMQIGAAPDEKMEIAGNYWDEMGNGKPAEVHTAMFAHALDALDVNDDYIRRNLLPEAKASGNLASCLAISRRHYYKSVGFFGVTEYLVPRRFKLVVDRWADIGLPREGIAYHDAHISIDAVHASGWFKNVIAPAVDRDPRVGREIAVGALIRLNSSQRYLDSLLMHLHHDSAAHTS。

2、HrmI催化(S)-6-硝基正亮氨酸的生成

表2、反应体系(总体积100μL)

按照表2的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、HrmI蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在保留时间约12.4min处产生一个新峰，分子量[M+H]⁺＝410，该峰在缺少L-赖氨酸、NADH、PMS或者HrmI时均不存在(图2)，高分辨质谱显示该峰精确分子量为[M+H]⁺＝410.1384，推测分子式为C₁₈H₂₄N₃O₆S⁺，(计算值：[M+H]⁺＝410.1380)，与DNSC衍生后的(S)-6-硝基正亮氨酸相符，推测HrmI将L-赖氨酸的6-氨基氧化生成(S)-6-硝基正亮氨酸。

为了进一步确定产物为(S)-6-硝基正亮氨酸，申请人按照文献方法(Eur.J.Org.Chem.2006,1525-1534)化学合成了(S)-6-硝基正亮氨酸标准品，将化学合成的(S)-6-硝基正亮氨酸按照上述方法与DNSC衍生，HPLC-ESI-MS显示DNSC衍生后的(S)-6-硝基正亮氨酸与本发明方法合成的产物具有相同的保留时间、分子量和紫外吸收谱图，具体如图2所示，进一步说明了HrmI催化酶可以高区域选择性的氧化L-赖氨酸的6-氨基生成(S)-6-硝基正亮氨酸，而2-氨基完全不发生氧化。

实施例3，本实施例采用BelK作为催化酶，使用L-赖氨酸甲酯为底物，合成(S)-6-硝基正亮氨酸，具体步骤如下：

1、BelK催化酶的合成：合成过程及方法同实施例1中的BelK，电泳结果如图1所示。

2、BelK催化L-赖氨酸甲酯生成(S)-6-硝基正亮氨酸

表3、反应体系(总体积100μL)

按照表3的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸甲酯、吩嗪硫酸甲酯、BelK蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在保留时间约12.4min处产生一个新峰，分子量[M+H]⁺＝410，该峰在缺少BelK时不存在(图3)，高分辨质谱显示该峰精确分子量为[M+H]⁺＝410.1385，推测分子式为C₁₈H₂₄N₃O₆S⁺，(计算值：[M+H]⁺＝410.1380)，与DNSC衍生后的(S)-6-硝基正亮氨酸相符。此外，该峰的保留时间、分子量和紫外吸收谱图均与BelK催化L-赖氨酸生成的DNS-(S)-6-硝基正亮氨酸相同。HPLC-ESI-(HR)MS没有检测到DNS-(S)-6-硝基正亮氨酸甲酯的分子量(C₁₉H₂₆N₃O₆S⁺，计算值：[M+H]⁺＝424.1537)，说明在催化过程中BelK可以脱除L-赖氨酸羧基的甲基保护基，生成(S)-6-硝基正亮氨酸，并没有生成(S)-6-硝基正亮氨酸甲酯。

实施例4，本实施例采用BelK作为催化酶，使用Nα-乙酰基保护的L-赖氨酸为底物，合成(S)-6-硝基正亮氨酸，具体步骤如下：

1、BelK催化酶的合成：合成过程及方法同实施例1中的BelK，电泳结果如图1所示。

2、BelK催化Nα-乙酰-L-赖氨酸生成(S)-6-硝基正亮氨酸

表4、反应体系(总体积100μL)

按照表4的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、Nα-乙酰-L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelK蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在保留时间约12.4min处产生一个新峰，分子量[M+H]⁺＝410，该峰在缺少BelK时不存在(图3)，高分辨质谱显示该峰精确分子量为[M+H]⁺＝410.1383，推测分子式为C₁₈H₂₄N₃O₆S⁺，(计算值：[M+H]⁺＝410.1380)，与DNSC衍生后的(S)-6-硝基正亮氨酸相符。此外，该峰的保留时间、分子量和紫外吸收谱图均与BelK催化L-赖氨酸生成的DNS-(S)-6-硝基正亮氨酸相同。HPLC-ESI-(HR)MS没有检测到(S)-2-乙酰-6-硝基正亮氨酸的分子量，说明在催化过程中BelK可以脱除Nα-乙酰-L-赖氨酸的乙酰基保护基，生成(S)-6-硝基正亮氨酸，并没有生成(S)-2-乙酰-6-硝基正亮氨酸。

实施例5，本实施例采用BelK作为催化酶，使用5-羟基-L-赖氨酸为底物，合成(S)-5-羟基-6-硝基正亮氨酸，具体步骤如下：

1、BelK催化酶的合成：合成过程及方法同实施例1中的BelK，电泳结果如图1所示。

2、BelK催化5-羟基-L-赖氨酸生成(S)-5-羟基-6-硝基正亮氨酸

表5、反应体系(总体积100μL)

按照表5的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、5-羟基-L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelK蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在保留时间约10.8min处产生一个新峰，分子量[M+H]⁺＝426，该峰在缺少BelK时不存在(图4)，高分辨质谱显示该峰精确分子量为[M+H]⁺＝426.1336，推测分子式为C₁₈H₂₄N₃O₇S⁺，(计算值：[M+H]⁺＝426.1329)，与DNSC衍生后的(S)-5-羟基-6-硝基正亮氨酸相符。由此说明BelK可以催化5-羟基-L-赖氨酸的氧化生成(S)-5-羟基-6-硝基正亮氨酸。

实施例6，本实施例采用BelK作为催化酶，使用S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸为底物，合成S-(2-硝基乙基)-L-半胱氨酸，具体步骤如下：

1、BelK催化酶的合成：合成过程及方法同实施例1中的BelK，电泳结果如图1所示。

2、BelK催化S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸生成S-(2-硝基乙基)-L-半胱氨酸

表6、反应体系(总体积100μL)

按照表6的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelK蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在保留时间约12.3min处产生一个新峰，分子量[M+H]⁺＝428，该峰在缺少BelK时不存在(图5)，高分辨质谱显示该峰精确分子量为[M+H]⁺＝428.0936，推测分子式为C₁₇H₂₂N₃O₆S₂ ⁺，(计算值：[M+H]⁺＝428.0945)，与DNSC衍生后的S-(2-硝基乙基)-L-半胱氨酸相符。由此说明BelK可以催化S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸的氧化生成S-(2-硝基乙基)-L-半胱氨酸。

为了进一步深入研究本发明提供的催化酶的功能位点及其催化机理，申请人以BelK催化酶为例，对部分氨基酸(下划线所示)进行定点突变，证实下述位点对酶催化功能具有重要作用，具体见实施例7-14。

QEXXXDXXFDDXXXXXXXGXXXXXKXEXXXNXXDEMGNGXXXXXHXXXF；

GXXXXTEXXXPXR(X)_17-21 YHXXHXXXDXXHXXXXXXNVXXP(X)_12-16GXXXRXNXSXXYLD；

其中，X表示任意氨基酸，数字表示任意氨基酸的数目范围。

实施例7，本实施例采用BelK E205A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测E205氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK E205A点突变蛋白的合成

(1)BelK E205A点突变质粒的构建

以pET28a+belK质粒为模板，利用引物BelK-E205A-F(5’-GCAAACTACTGGGACGCAATGGGCAATGGCGAG-3’)和BelK-E205A-R(5’-CTCGCCATTGCCCATTGCGTCCCAGTAGTTTGC-3’)进行PCR，PCR体系如表7所示。PCR结束后，向PCR体系中加入1μL DpnI限制性内切酶切除模板，之后脱盐膜脱盐30min。将大肠杆菌BL21(DE3)于1.5mL离心管中37℃摇床培养5h，12000rpm离心1min，弃去上清，加入1mL无菌水12000rpm离心1min洗涤两遍，弃去上清液，加入全部的PCR体系，混匀后转入电转杯。将电转杯放入电转仪，设定电压1350V进行电转化，结束后迅速向电转杯中加入1mL新鲜LB培养基，转入1.5mL离心管37℃摇床培养复苏1h，涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接种到1mL的LB(含卡那霉素50μg/mL)，放入37℃、960rpm摇床5h，送测序。

表7、PCR反应体系(总体积20μL)

(2)BelK E205A点突变蛋白的表达纯化

挑选测序正确的BL21(DE3)pET28a+belK E205A转接到2L的LB(含卡那霉素50μg/mL)，放入37℃、200rpm摇床4h，待菌液OD₆₀₀＝0.6左右时，加入六水合三氯化铁溶液至终浓度0.2mM，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)至终浓度0.1mM，放入25℃、200rpm摇床24h，之后离心收集菌体。加入破菌缓冲溶液(K₂HPO₄ 50mM，NaCl 300mM，咪唑5mM，甘油10％(v/v)，用盐酸调pH＝7.5)重旋菌体，1g菌体对应5mL破菌缓冲溶液。使用超高压细胞破碎仪(700bar左右)破菌三次至液体呈半透明状，4℃、14000rpm离心1h。离心后取上清，加入到镍柱中，依次用10mM、25mM、50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱蛋白，淋洗液暂存于4℃或冰浴，每种浓度留样进行SDS-PAGE检测。根据电泳结果收集目的蛋白，使用10kDa的蛋白超滤离心管浓缩蛋白，用蛋白脱盐柱PD-10脱除咪唑，将蛋白纯化溶液交换为脱盐缓冲溶液(K₂HPO₄ 50mM，NaCl 100mM，甘油10％(v/v)，DTT 1mM)。使用酶标仪检测蛋白浓度。每20μL分装一管，先放入液氮中速冻，之后-80℃保存备用。电泳结果如图1所示。

2、BelK E205A的测活体系

表8、反应体系(总体积100μL)

按照表8的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKE205A蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK E205A测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明将E205突变为丙氨酸后BelK的催化功能完全丧失，E205氨基酸残基对于BelK的催化功能具有重要影响。

实施例8，本实施例采用BelK H215A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测H215氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK H215A点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-H215A-F(5’-GAGTTTGCAGATGTGGCAACCACCCTGTTTAGC-3’)和BelK-H215A-R(5’-GCTAAACAGGGTGGTTGCCACATCTGCAAACTC-3’)，电泳结果如图1所示。

2、BelK H215A的测活体系

表9、反应体系(总体积100μL)

按照表9的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKH215A蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK H215A测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明将H215突变为丙氨酸后BelK的催化功能完全丧失，H215氨基酸残基对于BelK的催化功能具有重要影响。

实施例9，本实施例采用BelK E269A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测E269氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK E269A点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-E269A-F(5’-TATTACGGCGTGACCGCATTTCTGGCACCGCGC-3’)和BelK-E269A-R(5’-GCGCGGTGCCAGAAATGCGGTCACGCCGTAATA-3’)，电泳结果如图1所示。

2、BelK E269A的测活体系

表10、反应体系(总体积100μL)

按照表10的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKE269A蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK E269A测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明将E269突变为丙氨酸后BelK的催化功能完全丧失，E269氨基酸残基对于BelK的催化功能具有重要影响。

实施例10，本实施例采用BelK H299A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测H299氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK H299A点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-H299A-F(5’-GTGTACCACGACATCGCAATCAACGTGGATGCC-3’)和BelK-H299A-R(5’-GGCATCCACGTTGATTGCGATGTCGTGGTACAC-3’)，电泳结果如图1所示。

2、BelK H299A的测活体系

表11、反应体系(总体积100μL)

按照表11的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKH299A蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK H299A测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明将H299突变为丙氨酸后BelK的催化功能完全丧失，H299氨基酸残基对于BelK的催化功能具有重要影响。

实施例11，本实施例采用BelK D303A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测D303氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK D303A点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-D303A-F(5’-ATCCACATCAACGTGGCAGCCCACCATGCCGCC-3’)和BelK-D303A-R(5’-GGCGGCATGGTGGGCTGCCACGTTGATGTGGAT-3’)，电泳结果如图1所示。

2、BelK D303A的测活体系

表12、反应体系(总体积100μL)

按照表12的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKD303A蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK D303A测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明将D303突变为丙氨酸后BelK的催化功能完全丧失，D303氨基酸残基对于BelK的催化功能具有重要影响。

实施例12，本实施例采用BelK H306A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测H306氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK H306A点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-H306A-F(5’-AACGTGGATGCCCACGCAGCCGCCGGTTGGTAT-3’)和BelK-H306A-R(5’-ATACCAACCGGCGGCTGCGTGGGCATCCACGTT-3’)，电泳结果如图1所示。

2、BelK H306A的测活体系

表13、反应体系(总体积100μL)

按照表13的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKH306A蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK H306A测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明将H306突变为丙氨酸后BelK的催化功能完全丧失，H306氨基酸残基对于BelK的催化功能具有重要影响。

实施例13，本实施例采用BelK Y295A点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测Y295氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK Y295A点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-Y295A-F(5’-CCTGAAGGTAAGGTGGCACACGACATCCACATC-3’)和BelK-Y295A-R(5’-GATGTGGATGTCGTGTGCCACCTTACCTTCAGG-3’)。对BelK Y295A点突变蛋白进行表达纯化的过程中发现该蛋白不可溶，只存在于蛋白沉淀中，在上清液及纯化后的溶液中均没有检测到可溶性蛋白，因此无法进行后续的体外测活和产物检测。由此说明Y295对于维持BelK蛋白正常的三级结构具有重要的作用，将该残基突变为丙氨酸后导致蛋白无法折叠形成正确的高级结构，从而导致蛋白沉淀。

实施例14，本实施例采用BelK Y295F点突变蛋白作为催化酶，使用L-赖氨酸为底物，检测Y295氨基酸残基对BelK蛋白催化活性的影响，具体步骤如下：

1、BelK Y295F点突变蛋白的合成：

合成过程及方法同实施例7中的BelK E205A，将BelK E205A中的引物替换为BelK-Y295F-F(5’-CCTGAAGGTAAGGTGTTTCACGACATCCACATC-3’)和BelK-Y295F-R(5’-GATGTGGATGTCGTGAAACACCTTACCTTCAGG-3’)，相比于Y295A点突变，Y295F蛋白可以形成正确的折叠，获得可溶性蛋白。电泳结果如图1所示。

2、BelK Y295F的测活体系

表14、反应体系(总体积100μL)

按照表14的顺序依次加入H₂O、K₂HPO₄缓冲溶液、L-赖氨酸、吩嗪硫酸甲酯、BelKY295F蛋白，最后加入NADH，混匀开启反应，28℃放置2h。

3、合成产物的检测

在反应体系中加入100μL乙腈终止反应，震荡混匀，13000rpm离心15min，取上清，加入4μL丹磺酰氯(dansyl chloride，DNSC，50mM乙腈溶液)至终浓度1mM，放入50℃恒温水浴锅衍生1h，13000rpm离心15min，加入样品瓶进行HPLC-ESI-(HR)MS检测。流动相：H₂O(0.1％HCOOH)+CH₃CN(0.1％HCOOH)，流速1mL/min，紫外吸收检测波长254nm，方法：T＝0min,5％B；T＝3min,5％B；T＝18min,95％B；T＝22min,95％B；T＝23min,5％B；and T＝25min,5％B。

HPLC-ESI-MS显示在BelK Y295F测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰完全消失，而阳性对照BelK测活体系中保留时间约12.4min，分子量[M+H]⁺＝410的产物峰依旧存在(图6)，由此说明Y295中苯环的羟基可以和其它氨基酸残基形成氢键从而发挥正常的催化功能，将Y295突变为苯丙氨酸后，因羟基的缺失导致BelK的催化功能完全丧失。