一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法
阅读说明：本技术 一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法 (Method for hydrolyzing rice straw by using cellulase ) 是由 顾斌涛 黄国昌 熊大维 章帅文 于 2021-11-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法,涉及农作物秸秆酶解领域,包括：S1、将稻草秸秆粉碎；S2、将稻草秸秆与离子液体混合,微波加热,并辅助以超声波处理10～30min；S3、将稻草秸秆进行洗涤,干燥至稻草秸秆的湿度为60～70％,然后将稻草秸秆加入密闭容器内,往密闭容器中加入液氨,处理5～20min后释放压力进行爆破；S4、往稻草秸秆中加入pH缓冲溶液,调节pH为4.5～6.5,加入纤维素酶进行酶解。本发明的有益效果是进行了离子液体与氨纤维爆破预处理结合,能够打破木质素与纤维素及半纤维素之间的结合,提高纤维素的可及度及疏松性,促进后续的纤维素酶与底物的接触,提高酶解的效率。(The invention discloses a method for hydrolyzing rice straw by using cellulase, which relates to the field of crop straw enzymolysis and comprises the following steps: s1, crushing straw stalks; s2, mixing the straw stalks with ionic liquid, heating by microwave, and carrying out ultrasonic treatment for 10-30 min in an auxiliary manner; s3, washing the straw stalks, drying until the humidity of the straw stalks is 60-70%, adding the straw stalks into a closed container, adding liquid ammonia into the closed container, treating for 5-20 min, and releasing pressure to explode; s4, adding a pH buffer solution into the straw stalks, adjusting the pH to 4.5-6.5, and adding cellulase for enzymolysis. The method has the advantages that the ionic liquid and the ammonia fiber are combined in the blasting pretreatment, so that the combination of lignin, cellulose and hemicellulose can be broken, the accessibility and the looseness of the cellulose are improved, the subsequent contact between the cellulase and a substrate is promoted, and the enzymolysis efficiency is improved.)
技术领域
本发明涉及农作物酶解技术领域，具体涉及一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法。
背景技术
稻草秸秆是一类重要的可再生生物质资源，目前，除了在造纸业工业方面的利用，绝大多数被废弃或者焚烧，严重浪费了资源，并且污染了环境。
稻草秸秆的主要成分包括纤维素、半纤维素、木质素，它们主要以细胞壁形式存在。其中，纤维素是纤维的骨骼物质，而木质素和半纤维素以包容物质的形式分散在纤维之中及其周围。稻草秸秆中约含有35％的纤维素，25％的半纤维素，21％的木质素。除了纤维素、木质素以及半纤维素以外，稻草秸秆还含有粗蛋白、低分子碳水化合物和无机盐等少量成分。
从稻草秸秆水解制取酒精、乳酸、可生物降解的纤维素薄膜等产品的研究正引起越来越多人们的关注，但植物细胞壁的结构非常复杂，木质纤维素构成了植物的细胞壁，对细胞起着保护作用。木质纤维素是指纤维素、半纤维素及木质素三者的总称，也有少量的果胶、树胶、藻胶和琼脂等成分，结构非常复杂。纤维素和半纤维素被木质素层层包裹，纤维素是由1000～10000个β-D-吡喃型葡萄糖单体形式以β-1,4-糖苷键连接形成的直链多糖，多个分子层平行排列构成丝状不溶性微纤维结构，基本组成单位为纤维二糖，是地球上含量最丰富的聚合物。半纤维素主要是由木糖、少量阿拉伯糖、半乳糖或甘露糖组成。而木质素是由苯丙烷及其衍生物为基本组成单位而形成的高分子芳香族化合物，在水解纤维素过程中扮演着屏障作用。因此，木质素的存在使得酶对纤维素和半纤维素的接触受到阻碍，并且木质素对水解酶的结合不可逆，导致水解速度降低。因此，要提高天然纤维素的酶解效率，必须在其被利用之前需要采用一定的预处理方法来破坏其复杂的结构，使纤维素暴露出来，以便纤维素酶对其进行水解。
预处理过程就是促进木质纤维素的天然高分子结构分解成为易被微生物利用的结构。利用预处理方法可以破坏木质素、半纤维素对纤维素的包裹，去除木质素，降解半纤维素，改变纤维素的结晶结构，提高纤维素的可及度及疏松性，促进酶与底物的接触，提高后续酶解的效率和得糖率。常规的预处理方法主要采用酸碱等预处理，但是酸碱预处理方法会造成大量的废液产生，而这些废液中含有强酸强碱直接排放会对环境产生污染。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法。
本发明的技术解决方案如下：
一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法，包括以下步骤：
S1、将稻草秸秆粉碎；
S2、将步骤S1粉碎后的稻草秸秆与离子液体混合，微波加热，并辅助以超声波处理，处理时间为10～30min；
S3、将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为60～70％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，处理5～20min后释放压力进行爆破；
S4、往步骤S3处理后的稻草秸秆中加入pH缓冲溶液，调节pH为4.5～6.5，加入纤维素酶进行酶解。
作为优选，所述步骤S2中，离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，稻草秸秆与离子液体的固液比为1:5～20g/ml。
作为优选，所述步骤S2中，微波功率为200～300W，微波加热温度60～80℃，超声波处理功率为300～400W，频率为10～20KHZ。
作为优选，所述步骤S3中，液氨与稻草秸秆的质量比为0.5～1.5:1。
作为优选，所述步骤S3中，密闭容器内的压力为1～4MPa。
作为优选，所述步骤S3具体包括：将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为60～70％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，并对密闭容器进行加热至90～100℃，处理5～20min后释放压力进行爆破。。
作为优选，所述S4中，纤维素酶的加入量为稻草秸秆质量的5～10％，纤维素酶的酶活为1000～1500U/g。
作为优选，所述S4中，酶解温度40～60℃，酶解时间为20～40h。
作为优选，所述S4中，还加入谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂与纤维素酶一起进行酶解。
作为优选，于，谷胱甘肽的加入量为稻草秸秆质量的0.001～0.0015％，牛血清蛋白的加入量为稻草秸秆质量的0.002～0.003％，鼠李糖脂的加入量为稻草秸秆质量的0.001～0.002％。
本发明至少具有以下有益效果之一：
1、本发明对稻草秸秆进行了离子液体与氨纤维爆破预处理结合，本发明先将稻草秸秆与离子液体混合，并辅助以微波-超声处理，离子液体对纤维素有良好的溶解能力，微波处理包括热效应和非热效应，可改善纤维的超分子结构，使纤维结晶区尺寸发生变化，能够部分降解木质素和半纤维素；超声波可产生力学效应、空化效应和热效应，其不仅能强化传质，增加离子液体与稻草秸秆表面的接触，对稻草秸秆本身也能产生结构上的影响，因此，通过离子液体与微波-超声处理协同作用，能够对稻草秸秆进行预处理，打破木质素与纤维素及半纤维素之间的结合；进一步地，本发明对离子液体与微波-超声预处理后的稻草秸秆继续进行氨纤维爆破，由于液氨汽化而产生骤冷作用，氨纤维爆破可使纤维素结晶分解以及半纤维素解聚，进一步打破木质素与纤维素及半纤维素之间的结合，并能够去除木质素和少量的半纤维素，提高纤维素的可及度及疏松性，从而能够促进后续的纤维素酶与底物的接触，提高后续酶解的效率。
2、由于纤维素酶具有较高敏感性，易受环境影响，反应中会渐渐失活，故本发明通过添加谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂与纤维素酶一起酶解，谷胱甘肽和鼠李糖脂优先于纤维素酶吸附在底物分子表面，吸附在底物上的酶可被置换，酶分子被重新释放进入溶液，避免了部分酶的不可逆吸附而失效，从而能够减少纤维素酶的无效吸附，减小纤维素酶变性失活速率，牛血清蛋白能够提高酶的活力和稳定性，提高反应效率，从而大大提高水解效率。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例1
一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法，包括以下步骤：
S1、将稻草秸秆粉碎至50～150目；
S2、将步骤S1粉碎后的稻草秸秆与离子液体混合，微波加热，并辅助以超声波处理，处理时间为10min；离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，稻草秸秆与离子液体的固液比为1:5g/ml；微波功率为300W，微波加热温度80℃，超声波处理功率为400W，频率为20KHZ；
S3、将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为60％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，对稻草秸秆进行加热至90℃，并控制密闭容器内的压力为3MPa，处理5min后释放压力进行爆破。
S4、往步骤S3处理后的稻草秸秆中加入pH缓冲溶液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调节pH为4.5，加入纤维素酶与谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂进行酶解，纤维素酶的加入量为稻草秸秆质量的5％，纤维素酶的酶活为1500U/g，谷胱甘肽的加入量为稻草秸秆质量的0.001％，牛血清蛋白的加入量为稻草秸秆质量的0.002％，鼠李糖脂的加入量为稻草秸秆质量的0.001％；酶解温度40℃，酶解时间为20h。
实施例2
一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法，包括以下步骤：
S1、将稻草秸秆粉碎至50～150目；
S2、将步骤S1粉碎后的稻草秸秆与离子液体混合，微波加热，并辅助以超声波处理，处理时间为15min；离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，稻草秸秆与离子液体的固液比为1:10g/ml；微波功率为300W，微波加热温度75℃，超声波处理功率为400W，频率为20KHZ；
S3、将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为65％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，对稻草秸秆进行加热至92℃，并控制密闭容器内的压力为1.5MPa，处理10min后释放压力进行爆破；液氨与稻草秸秆的质量比为0.8:1，密闭容器内的压力为1.5MPa；对密闭容器进行加热，加热温度为90℃。
S4、往步骤S3处理后的稻草秸秆中加入pH缓冲溶液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调节pH为5，加入纤维素酶与谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂进行酶解，纤维素酶的加入量为稻草秸秆质量的6％，纤维素酶的酶活为1400U/g，谷胱甘肽的加入量为稻草秸秆质量的0.0014％，牛血清蛋白的加入量为稻草秸秆质量的0.0028％，鼠李糖脂的加入量为稻草秸秆质量的0.0018％；酶解温度55℃，酶解时间为25h。
实施例3
一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法，包括以下步骤：
S1、将稻草秸秆粉碎至50～150目；
S2、将步骤S1粉碎后的稻草秸秆与离子液体混合，微波加热，并辅助以超声波处理，处理时间为20min；离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，稻草秸秆与离子液体的固液比为1:12g/ml；微波功率为250W，微波加热温度70℃，超声波处理功率为350W，频率为15KHZ；
S3、将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为65％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，对稻草秸秆进行加热至95℃，并控制密闭容器内的压力为2.5MPa，处理12min后释放压力进行爆破。
S4、往步骤S3处理后的稻草秸秆中加入pH缓冲溶液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调节pH为5.5，加入纤维素酶与谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂进行酶解，纤维素酶的加入量为7％，纤维素酶的酶活为1300U/g，谷胱甘肽的加入量为稻草秸秆质量的0.0013％，牛血清蛋白的加入量为稻草秸秆质量的0.0025％，鼠李糖脂的加入量为稻草秸秆质量的0.0015％；酶解温度50℃，酶解时间为30h。
实施例4
一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法，包括以下步骤：
S1、将稻草秸秆粉碎至50～150目；
S2、将步骤S1粉碎后的稻草秸秆与离子液体混合，微波加热，并辅助以超声波处理，处理时间为25min；离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，稻草秸秆与离子液体的固液比为1:15g/ml；微波功率为250W，微波加热温度65℃，超声波处理功率为350W，频率为15KHZ；
S3、将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为65％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，对稻草秸秆进行加热至98℃，并控制密闭容器内的压力为1MPa，处理10min后释放压力进行爆破。
S4、往步骤S3处理后的稻草秸秆中加入pH缓冲溶液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调节pH为6，加入纤维素酶与谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂进行酶解，纤维素酶的加入量为稻草秸秆质量的9％，纤维素酶的酶活为1400U/g，谷胱甘肽的加入量为稻草秸秆质量的0.0014％，牛血清蛋白的加入量为稻草秸秆质量的0.0028％，鼠李糖脂的加入量为稻草秸秆质量的0.0018％；酶解温度55℃，酶解时间为35h。
实施例5
一种利用纤维素酶水解处理稻草秸秆的方法，包括以下步骤：
S1、将稻草秸秆粉碎至50～150目；
S2、将步骤S1粉碎后的稻草秸秆与离子液体混合，微波加热，并辅助以超声波处理，处理时间为30min；离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，稻草秸秆与离子液体的固液比为1:20g/ml；微波功率为200W，微波加热温度80℃，超声波处理功率为300W，频率为15KHZ；
S3、将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤，干燥至稻草秸秆的湿度为70％，然后将稻草秸秆加入密闭容器内，往密闭容器中加入液氨，对稻草秸秆进行加热至100℃，并控制密闭容器内的压力为2MPa，处理20min后释放压力进行爆破。
S4、往步骤S3处理后的稻草秸秆中加入pH缓冲溶液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调节pH为6.5，加入纤维素酶与谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂进行酶解，纤维素酶的加入量为稻草秸秆质量的10％，纤维素酶的酶活为1000U/g，谷胱甘肽的加入量为稻草秸秆质量的0.0015％，牛血清蛋白的加入量为稻草秸秆质量的0.003％，鼠李糖脂的加入量为稻草秸秆质量的0.002％；酶解温度60℃，酶解时间为40h。
对比例1
与实施例1的区别在于：步骤S2中不进行微波和超声波处理，以常规方式加热至80℃，其他与实施例1相同。
对比例2
与实施例1的区别在于：不进行步骤S2，其他与实施例1相同。
对比例3
与实施例1的区别在于：不进行步骤S3，其他与实施例1相同。
对比例4
与实施例1的区别在于：步骤S2和S3的顺序对换，即先进行步骤S3，再进行步骤S2，将步骤S2处理后的稻草秸秆进行洗涤后，再进行步骤S4，其他与实施例1相同。
对比例5
与实施例1的区别在于：步骤S4中不加入谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂，其他与实施例1相同。
对比例6
与实施例1的区别在于：不进行步骤S2和S3，步骤S4中不加入谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂，其他与实施例1相同。
结果测试：
检测实施例1～5以及对比例1～6中酶解率，结果如表1所示：
表1
由表1可以看出，实施例1的酶解率为99.4％，实施例2～5的酶解率均为100％，由此说明，本发明的预处理方法能够完全打破木质素与纤维素及半纤维素之间的结合，提高纤维素的可及度及疏松性，使得纤维素酶能够与底物充分接触，并通过添加谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂提高了纤维素酶的活性和稳定性，提高了酶解的效率。
将实施例1与对比例1～6比较可以看出，对比例6未进行预处理及未添加谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂，酶解率仅为8.9％，可见稻草秸秆在酶解前需要预处理才能获得较高的酶解率；对比例1未进行微波和超声波辅助处理，酶解率为90.2％；对比例2未进行离子液体预处理，只进行了氨纤维爆破预处理，酶解率为82.4％；对比例3未进行了氨纤维爆破预处理，只进行离子液体预处理，酶解率为85.1％；由此说明，是否进行微波和超声波辅助处理、是否进行离子液体预处理、是否进行氨纤维爆破预处理均会影响酶解效率的效果，且离子液体预处理对酶解效率的影响最大。对比例4只是将步骤S2和S3的顺序对换，酶解率为93.8％，相比实施例1稍有下降，由此说明，离子液体预处理和氨纤维爆破预处理对酶解效率也有影响，其中的机理暂不清楚。对比例5未加入谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂，酶解率降至84.7％，由此说明，谷胱甘肽、牛血清蛋白、鼠李糖脂会影响纤维素酶的活性，从而最终影响酶解率。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
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