氨基葡萄糖的酶催化制备方法
阅读说明：本技术 氨基葡萄糖的酶催化制备方法 (Enzymatic preparation method of glucosamine ) 是由 陈延静 詹金明 王松叶 于 2021-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明是一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法,属于生物工程技术领域。该方法包括：采用葡萄糖异构酶催化,将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖；葡萄糖异构酶来源于凝结芽孢杆菌、树枝状黄杆菌、橄榄色链霉菌、凝结芽孢杆菌、树枝状黄杆菌、橄榄色链霉菌；转氨酶来源于枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、唾液链球菌、马里乳杆菌；本发明利用生物酶通过体外催化D-葡萄糖实现制备氨基葡萄糖的方法,初始原料为D-葡萄糖或D-果糖所需的葡萄糖异构酶和转氨酶可通过构建大肠杆菌基因工程表达菌,采用“一锅法”催化直接得到终产物氨基葡萄糖,方法具有原料廉价、生产成本低、环境友好等优点。(The invention relates to an enzyme catalysis preparation method of glucosamine, belonging to the technical field of bioengineering. The method comprises the following steps: converting D-glucose into D-fructose by adopting glucose isomerase catalysis; and converting D-fructose to glucosamine using a transaminase, an amino donor compound, and a weak oxidant compound; the glucose isomerase is derived from Bacillus coagulans, Flavobacterium arborescens, Streptomyces olivaceus, Bacillus coagulans, Flavobacterium arborescens, and Streptomyces olivaceus; the transaminase is derived from Bacillus subtilis, Bacillus belgii, Bacillus pumilus, and Bacillus licheniformis 、 Streptococcus salivarius, lactobacillus mali; the invention relates to a method for preparing glucosamine by in vitro catalyzing D-glucose by utilizing biological enzyme, wherein the initial raw material is glucose isomerase and transaminase required by D-glucose or D-fructoseThe final product glucosamine is directly obtained by constructing escherichia coli genetic engineering expression bacteria and adopting one-pot catalysis, and the method has the advantages of cheap raw materials, low production cost, environmental friendliness and the like.)
技术领域
本发明涉及一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法，尤其涉及体外采用生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
氨基葡萄糖是D-葡萄糖分子中2位羟基被氨基取代后的化合物，化学名称为2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，易溶于水及亲水性溶剂，是一种重要的功能性单糖。氨基葡萄糖几乎存在于所有有机体包括细菌、真菌、植物以及动物体中，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。
氨基葡萄糖及其衍生物应用十分广泛，在医药、食品、化妆品等领域均具有重要用途。在医药工业方面，氨基葡萄糖硫酸盐能通过刺激软骨蛋白聚糖的生物合成从而作为治疗抗风湿性关节炎的原料药；在食品工业方面，氨基葡萄糖具有吸收体内自由基、抗衰老、促进减肥、抑菌及调节人体内分泌等多种生理功能，被用于食品添加剂和保健食品的生产中；在化妆品工业方面，乙酰氨基葡萄糖是透明质酸的单体，是高档化妆品中不可缺少的一种物质。
目前，主要有两种生产氨基葡萄糖的方法：
（1）甲壳素水解法，包括甲壳素酸水解法和甲壳素酶水解法。其中，甲壳素酸水解法是最常用的氨基葡萄糖生产方法，该方法首先用高浓度盐酸水解几丁质得到乙酰氨基葡萄糖，然后将乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基得到氨基葡萄糖。然而该生产方法易受原料供应的影响，酸处理产生的废水也会对环境造成污染，此外一些对虾蟹原料过敏的人群在食用该方法制备的氨基葡萄糖后会出现过敏反应。甲壳素酶水解法以甲壳素为原料，在甲壳素酶的作用下水解反应生成氨基葡萄糖单体，该方法虽然对环境污染较小，但同样受到原料供应、生产效率、致过敏反应等因素的限制。
（2）微生物发酵法，该方法通过代谢工程手段改造获得大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等基因工程菌株，以葡萄糖、淀粉等为原料生产氨基葡萄糖。该方法虽然具不受原料来源限制、生产效率较高、环境污染较小等优点，但也存在微生物代谢途径改造难度较高、工程菌遗传稳定性难以控制、易产生代谢副产物等缺点。由此，急切需要开发低成本、低污染、高效率生产制备氨基葡萄糖的新方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有生产制备氨基葡萄糖方法的不足，提供一种新颖的利用生物酶通过体外催化达到生产制备氨基葡萄糖的方法。该方法具有原料廉价、生产成本低、生产效率较高、环境友好、对人体安全等优点。
本发明通过如下技术方案来实现：
本发明提供了一种以D-葡萄糖为原料利用生物酶通过体外催化实现制备氨基葡萄糖的方法，包括：采用葡萄糖异构酶（glucose isomerase，GI）或称木糖异构酶（xyloseisomerase，XI）催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用转氨酶（transaminase，TA）、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
本发明的合成路线如下：
根据本发明，所述方法包括将D-葡萄糖转化为D-果糖的反应步骤，该步骤采用葡萄糖异构酶或称木糖异构酶催化，该酶能将D-葡萄糖、D-木糖、D-核糖等醛糖异构化为相应酮糖。
根据本发明，所述方法包括将D-果糖转化为氨基葡萄糖的反应步骤，该步骤采用转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物催化，以磷酸吡哆醛(PLP)为辅因子，氨基供体化合物为D-丙氨酸、异丙胺、叔丁胺和苯乙氨中的一种、两种或者更多种的任意混合物，弱氧化剂化合物为亚磷酸盐、有机过氧酸和氧化铜中的一种、两种或者更多种的任意混合物。
本发明所述的葡萄糖异构酶来源于凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），GenBank编号KYC85466；或者来源于树枝状黄杆菌（Flavobacterium arborescens），GenBank编号OAZ44030；或者来源于橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes），GenBank编号为KUN44528；或者来源于凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），GenBank编号为KYC85466；或者来源于树枝状黄杆菌（Flavobacterium arborescens），GenBank编号为OAZ44030；或者来源于橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes），GenBank编号为KUN44528；
所述的转氨酶来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），GenBank编号QHF59041；或者来源于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），GenBank编号AFZ92582；或者来源于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），GenBank编号为SNV15900；或者来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），GenBank编号为VEH77736；或者来源于唾液链球菌（Streptococcus salivarius），GenBank编号为KXU58123；或者来源于马里乳杆菌（Lactobacillus mali），GenBank编号为KRN26726。
根据本发明，所述催化反应在无添加NAD(H)和ATP的条件下进行。
本领域技术人员可以理解，本发明的方法所包括的上述步骤可以同时进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行。
本领域技术人员可以理解，本发明的方法所包括的上述步骤也可以分步进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行或在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行。
根据本发明，催化反应的温度为20-70℃，优选为35-40℃或者30-37℃。
根据本发明，催化反应的pH为4.0-9.0，优选为pH6.7-7.5。
根据本发明，上述步骤同时进行时，催化反应时间为1-48h，优选为20-30h。
根据本发明，上述步骤分步进行时，各步骤催化反应时间彼此独立进行为1-15小时，优选为5-8h。
根据本发明，反应体系中底物葡萄糖的浓度为1-200g/L，优选为8-20g/L或者8-35g/L。
根据本发明，反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为0.1-20U/mL，优选为4-8U/mL；转氨酶的浓度为0.1-20U/mL，优选为4-8U/mL。
根据本发明，反应体系中辅因子磷酸吡哆醛(PLP)的浓度为0.1-2mM，优选为0.8-1.5mM；氨基供体的浓度为0.1-3mM，优选为1-2mM；弱氧化剂的浓度为0.5-20mM，优选为8-12mM。
根据本发明，上述反应体系中还含有缓冲液。本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。反应体系中缓冲液的浓度为20～300mM，优选为80-150mM。
根据本发明，将D-果糖转化为氨基葡萄糖，包括纯的氨基葡萄糖，氨基葡萄糖盐以及乙酰氨基葡萄糖；其中，氨基葡萄糖盐选自盐酸氨基葡萄糖，硫酸氨基葡萄糖，磷酸氨基葡萄糖，硫酸氨基葡萄糖氯化钠复合盐，硫酸氨基葡萄糖氯化钾复合盐，或者硫酸氨基葡萄糖氯化钙复合盐。
根据本发明，在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了一种全新的利用生物酶通过体外催化D-葡萄糖实现制备氨基葡萄糖的方法，初始原料为D-葡萄糖或D-果糖，价格便宜，所需的葡萄糖异构酶和转氨酶可通过构建大肠杆菌基因工程表达菌，然后利用发酵大量制备获得，相对易得和廉价。
本发明提供的方法为“一锅法”催化，底物和酶加入后开始反应，反应结束后直接得到终产物氨基葡萄糖。与现有其他生产制备方法相比，本发明提供的氨基葡萄糖的生物酶制备方法具有原料廉价、生产成本低、环境友好、对人体安全等优点，适宜推广。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
本发明实施例中使用的部分材料信息如下：
pColdII质粒（Takara，Dalian，China）；
大肠杆菌克隆菌株E. coli DH5α（Invitrogen，Carlsbad，CA）；
大肠杆菌表达菌株E. coli BL21(DE3)（Invitrogen，Carlsbad，CA）；
实施例1，含葡萄糖异构酶基因和转氨酶基因的工程表达菌株构建
根据凝结芽孢杆菌（B. coagulans）的葡萄糖异构酶也称木糖异构酶的基因核苷酸序列(GenBank编号KYC85466)和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的转氨酶基因核苷酸序列（GenBank编号QHF59041）分别进行全基因合成，通过酶切和连接反应与pColdII质粒相连，转化进入大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，涂布含氨苄抗生素(30μg/ml)的LB平板，37℃培养12h后，挑取、鉴定阳性转化子并测序。将所验证的阳性单克隆接种至5mL含30μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，分别提取两个重组质粒，转化入表达宿主E. coliBL21(DE3)中，获得重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-GI和重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-AT，摇瓶小试发酵验证后，对重组菌株进行斜面保存以及-80℃甘油保存。LB培养基成分为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，pH 7.4。酶活单位定义：每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为一个酶活单位U。
实施例2，葡萄糖异构酶和转氨酶的重组表达制备
1)种子培养：将斜面保存的重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-GI和重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-AT分别接种至含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；
2)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD600值为0.5，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-半乳糖苷（IPTG），转速160转/min，诱导表达24h，收集菌体，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析全菌总蛋白，显示基因工程菌经诱导后有明显的葡萄糖异构酶和转氨酶重组表达蛋白条带，条带分子量与预期分子量大小一致。所述LB液体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4，使用前加入30μg/ml氨苄青霉素。在此条件下，重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的50%，大部分为可溶性状态。诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性重组葡萄糖异构酶和转氨酶，亲和层析中两者咪唑洗脱浓度均为400 mM。
实施例3 ，一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法，
该方法包括：采用实施例2制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例2制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物选自D-丙氨酸、异丙胺、叔丁胺和苯乙氨中的；所述的弱氧化剂化合物选自亚磷酸盐、有机过氧酸和氧化铜中的一种。催化反应的温度为35℃；催化反应的pH为6.7。两个催化反应步骤同时进行时，催化反应时间为20h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为8g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为4U/mL；转氨酶的浓度为4U/mL。
反应体系中氨基供体化合物的浓度为1mM；弱氧化剂化合物的浓度为8mM。反应体系中含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为0.8mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液浓度为80mM。缓冲液为HEPES缓冲液。
实施例4，一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法，
该方法包括：采用实施例2制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例2制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物采用D-丙氨酸和异丙胺1：1配成的混合物；所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐和有机过氧酸1：2配成的混合物。催化反应的温度为0℃；催化反应的pH为pH7.5。两个催化反应步骤分步进行时，各步骤催化反应时间彼此独立进行5h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为20g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为8U/mL；转氨酶的浓度为8U/mL。
反应体系中氨基供体化合物的浓度为2mM；弱氧化剂化合物的浓度为12mM。反应体系中含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.5mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液浓度为150mM。缓冲液为Tris-HCl缓冲液或MOPS缓冲液。
实施例5 ，一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法，
该方法包括：采用实施例2制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例2制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物选自叔丁胺和苯乙氨中按2：1组成的混合物；所述的弱氧化剂化合物为有机过氧酸和氧化铜中按3：1组成的混合物。催化反应的温度为28℃；催化反应的pH为7。两个催化反应步骤同时进行时，催化反应时间为24h；反应体系中底物葡萄糖的浓度为10g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为6U/mL；转氨酶的浓度为7U/mL。
反应体系中氨基供体化合物的浓度为1.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为10mM。反应体系中含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.0mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液浓度为120mM。缓冲液为MOPS缓冲液或者柠檬酸盐缓冲液。
实施例6 ，一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法，
该方法包括：采用实施例2制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例2制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物为异丙胺和叔丁胺按1：1组成的混合物；所述的弱氧化剂化合物选自亚磷酸盐、有机过氧酸和氧化铜按1：1：1组成混合物。催化反应的温度为30℃；催化反应的pH为6.5。当两个催化反应步骤同时进行时，催化反应时间为24h反应体系中底物葡萄糖的浓度为100g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为10U/mL；转氨酶的浓度为6U/mL。
反应体系中氨基供体化合物的浓度为3mM；弱氧化剂化合物的浓度为15。反应体系中含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.8mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液浓度为200mM。缓冲液选自HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液或者柠檬酸盐缓冲液。
实施例7，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖实验：
按实施例2制备出重组葡萄糖异构酶和转氨酶。采用高效液相色谱法(HPLC)定量分析氨基葡萄糖。所用色谱柱为氨基柱，流动相为80％乙腈水溶液，流速1mL/min，柱温40℃，所用检测器为Waters2414示差折光检测器。氨基葡萄糖标准样品保留时间约为10.3min。氨基葡萄糖浓度与氨基葡萄糖的HPLC特征峰的响应强度成正比。将含有10g/L D-葡萄糖、2mM异丙胺或D-丙氨酸、100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)、1mM的磷酸吡哆醛、10mM亚磷酸盐或有机过氧酸、5U/mL葡萄糖异构酶、5U/mL 转氨酶的1mL反应混合物在37℃下反应24h。反应结束后，向反应体系添加等体积的乙腈终止反应，12000转/min离心10min，取上清液通过高效液相色谱法测定反应溶液中的氨基葡萄糖的浓度。反应进行24h时，氨基葡萄糖的浓度为7.3g/L，转化率为73％。
实施例8，含葡萄糖异构酶基因和转氨酶基因的工程表达菌株构建
根据橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes，GenBank编号KUN44528）、或凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans，GenBank编号KYC85466）、或树枝状黄杆菌（Flavobacterium arborescens，GenBank编号OAZ44030）、或橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes，GenBank编号KUN44528）的葡萄糖异构酶也称木糖异构酶的基因核苷酸序列，以及短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus，GenBank编号SNV15900）、或地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，GenBank编号VEH77736）、或唾液链球菌（Streptococcus salivarius，GenBank编号KXU58123）、或马里乳杆菌（Lactobacillus mali，GenBank编号KRN26726）的转氨酶基因核苷酸序列分别进行全基因合成，通过酶切和连接反应与pColdII质粒相连，转化进入大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，涂布含氨苄抗生素(30μg/ml)的LB平板，37℃培养12h后，挑取、鉴定阳性转化子并测序。将所验证的阳性单克隆接种至5mL含30μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，分别提取两个重组质粒，转化入表达宿主E. coli BL21(DE3)中，获得重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-GI和重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-AT，摇瓶小试发酵验证后，对重组菌株进行斜面保存以及-80℃甘油保存。LB培养基成分为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，pH 7.4。酶活单位定义：每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为一个酶活单位U。
实施例9，葡萄糖异构酶和转氨酶的重组表达制备
1)种子培养：将斜面保存的重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-GI和重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-AT分别接种至含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；
2)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD600值为0.5，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-半乳糖苷（IPTG），转速160转/min，诱导表达24h，收集菌体，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析全菌总蛋白，显示基因工程菌经诱导后有明显的葡萄糖异构酶和转氨酶重组表达蛋白条带，条带分子量与预期分子量大小一致。所述LB液体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4，使用前加入30μg/ml氨苄青霉素。在此条件下，重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的50%，大部分为可溶性状态。诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性重组葡萄糖异构酶和转氨酶，亲和层析中两者咪唑洗脱浓度均为400 mM。
实施例10，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖
取实施例9制备的来源于橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes，GenBank编号KUN44528）的重组葡萄糖异构酶和来源于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus，GenBank编号SNV15900）的转氨酶。采用高效液相色谱法(HPLC)定量分析氨基葡萄糖。所用色谱柱为氨基柱，流动相为80％乙腈水溶液，流速1mL/min，柱温40℃，所用检测器为Waters2414示差折光检测器。氨基葡萄糖标准样品保留时间约为10.3min。氨基葡萄糖浓度与氨基葡萄糖的HPLC特征峰的响应强度成正比。将含有10g/L D-葡萄糖、2mM异丙胺或D-丙氨酸、100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)、1mM的磷酸吡哆醛、10mM亚磷酸盐或有机过氧酸、5U/mL葡萄糖异构酶、5U/mL 转氨酶的1mL反应混合物在37℃下反应24h。反应结束后，向反应体系添加等体积的乙腈终止反应，12000转/min离心10min，取上清液通过高效液相色谱法测定反应溶液中的氨基葡萄糖的浓度。反应进行24h。氨基葡萄糖的浓度为7.5g/L，转化率为69％。
实施例11，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖
取实施例9制备的来源于凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans，GenBank编号KYC85466）的重组葡萄糖异构酶和来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，GenBank编号VEH77736）的转氨酶。采用实施例10相同的方法进行反应36h，得到的氨基葡萄糖的浓度为7.0g/L，转化率为72％。
实施例12，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖
取实施例9制备的来源树枝状黄杆菌（Flavobacterium arborescens，GenBank编号OAZ44030）的重组葡萄糖异构酶和来源于唾液链球菌（Streptococcus salivarius，GenBank编号KXU58123）的转氨酶。采用实施例10相同的方法进行反应48h。氨基葡萄糖的浓度为8.0g/L，转化率为80％。
实施例13，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖
取实施例9制备的来源于橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes，GenBank编号KUN44528）的重组葡萄糖异构酶和来源于马里乳杆菌（Lactobacillus mali，GenBank编号KRN26726）的转氨酶。采用实施例10相同的方法进行反应36h，反应进行24h时。氨基葡萄糖的浓度为7.8g/L，转化率为78％。
实施例14，氨基葡萄糖制备盐酸氨基葡萄糖：
向实施例10制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量盐酸，进行成盐反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到盐酸氨基葡萄糖。
实施例15，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖:
向实施例11制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖。
实施例16，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖氯化钾复合盐：
向实施例12制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。反应完成后，加入等摩尔氯化钾，在35℃-45条件下，络合反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖氯化钾复合盐。
实施例17，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖氯化钠复合盐:
向实施例13制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。反应完成后，加入等摩尔氯化钠，在35℃-45条件下，络合反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖氯化钠复合盐。
实施例18，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖氯化钙复合盐:
向实施例10制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。反应完成后，加入等摩尔氯化钙，在35℃-45条件下，络合反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖氯化钙复合盐。
实施例19，氨基葡萄糖制备磷酸氨基葡萄糖：
向实施例11制得的在氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量磷酸，进行成盐反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到磷酸氨基葡萄糖。
实施例20，氨基葡萄糖制备乙酰氨基葡萄糖：
向实施例12制得的氨基葡萄糖水溶液或混合溶剂中，加入适量催化剂，再等摩尔或摩尔过量乙酸酐，进行酰化反应，反应完成后。浓缩除去部分溶剂，进行结晶，结晶完成后，分离，洗涤，干燥，得到乙酰氨基葡萄糖。
实施例21，氨基葡萄糖制备乙酰氨基葡萄糖：
向实施例13制得的氨基葡萄糖水溶液或混合溶剂中，加入适量催化剂，再等摩尔或摩尔过量乙酰氯，进行酰化反应，反应4-6小时，反应完成后。浓缩除去部分溶剂，进行结晶，结晶完成后，分离，洗涤，干燥，得到乙酰氨基葡萄糖。
实施例22，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
先按照实施例9所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。
制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes），GenBank编号为KUN44528的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用来源于马里乳杆菌（Lactobacillus mali），GenBank编号为KRN26726的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖；
上述方法中：
氨基供体化合物为D-丙氨酸；所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐。催化反应的温度为30℃；催化反应的pH为6.7。两个催化步骤同时进行，催化反应时间为20h；反应体系中底物葡萄糖的浓度为8g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为3U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为3U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为0.8mM。氨基供体化合物的浓度为1.0mM；弱氧化剂化合物的浓度为8mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为HEPES缓冲液，其浓度为80mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为7.3g/L，转化率为76％。
实施例23，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
先按照实施例9所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。
制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于来源于橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes），GenBank编号为KUN44528的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用来源于来源于唾液链球菌（Streptococcus salivarius），GenBank编号为KXU58123的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖；
上述方法中：
氨基供体化合物为异丙胺；所述的弱氧化剂化合物为有机过氧酸。催化反应的温度为-37℃；催化反应的pH为7.5。两个催化步骤同时进行时，催化反应时间为24h；反应体系中底物葡萄糖的浓度为35g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为8U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为8U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.2mM。氨基供体化合物的浓度为2.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为12mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，缓冲液浓度为150mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为7.5g/L，转化率为77％。
实施例24，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
先按照实施例9所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。
制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于来源于凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），GenBank编号为KYC85466的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用来源于来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），GenBank编号为VEH77736、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖；
氨基供体化合物为叔丁胺；所述的弱氧化剂化合物为氧化铜。催化反应的温度为35℃；催化反应的pH为7.2。两个催化步骤分步进行，各步骤催化反应时间彼此独立进行为6h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为25g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为5U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为6U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.0mM。氨基供体化合物的浓度为1.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为10mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为MOPS缓冲液，缓冲液浓度为120mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为7.8g/L，转化率为79％。
实施例25，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
先按照实施例9所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。
制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于树枝状黄杆菌（Flavobacterium arborescens），GenBank编号为OAZ44030的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用来源于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），GenBank编号为SNV15900的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖；
上述方法中：
氨基供体化合物为苯乙氨；所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐。催化反应的温度为35℃；催化反应的pH为7.0。两个催化步骤分步进行，各步骤催化反应时间彼此独立进行为8h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为25g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为6U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为5U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.2mM。氨基供体化合物的浓度为2.0mM；弱氧化剂化合物的浓度为11mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，缓冲液浓度为110mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为8.0g/L，转化率为80％。
实施例26，含葡萄糖异构酶基因和转氨酶基因的工程表达菌株构建
根据树枝状黄杆菌（F. arborescens）的葡萄糖异构酶也称木糖异构酶的基因核苷酸序列(GenBank编号OAZ44030)和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）的转氨酶基因核苷酸序列（GenBank编号AFZ92582）分别进行全基因合成，通过酶切和连接反应与pColdII质粒相连，转化进入大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，涂布含氨苄抗生素(30μg/ml)的LB平板，37℃培养12h后，挑取、鉴定阳性转化子并测序。将所验证的阳性单克隆接种至5mL含30μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，分别提取两个重组质粒，转化入表达宿主E. coli BL21(DE3)中，获得重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-GI和重组菌株E. coliBL21(DE3)/pColdII-AT，摇瓶小试发酵验证后，对重组菌株进行斜面保存以及-80℃甘油保存。LB培养基成分为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，pH 7.4。酶活单位定义：每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为一个酶活单位U。
实施例27，葡萄糖异构酶和转氨酶的重组表达制备
1)种子培养：将斜面保存的重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-GI和重组菌株E. coli BL21(DE3)/pColdII-AT分别接种至含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；
2)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD600值为0.5，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-半乳糖苷（IPTG），转速160转/min，诱导表达24h，收集菌体，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析全菌总蛋白，显示基因工程菌经诱导后有明显的葡萄糖异构酶和转氨酶重组表达蛋白条带，条带分子量与预期分子量大小一致。所述LB液体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4，使用前加入30μg/ml氨苄青霉素。在此条件下，重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的50%，大部分为可溶性状态。诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性重组葡萄糖异构酶和转氨酶，亲和层析中两者咪唑洗脱浓度均为400 mM。
实施例28，一种酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
包括：采用实施例27制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例27制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物为D-丙氨酸、异丙胺、叔丁胺和苯乙氨中的一种。所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐、有机过氧酸和氧化铜中的一种。催化反应的温度为35℃；催化反应的pH为6.7。两个催化步骤同时进行，催化反应时间为20h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为8g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为2U/mL；转氨酶的浓度为2U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为0.8mM。氨基供体化合物的浓度为1.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为6mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液选自HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液或者柠檬酸盐缓冲液，缓冲液浓度为80mM。
实施例29，一种酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
包括：采用实施例27制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例27制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物为D-丙氨酸和异丙胺按1：1组成的混合物。所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐、有机过氧酸按2：1组成的混合物。催化反应的温度为40℃；催化反应的pH为7.5。两个催化步骤分步进行，各步骤催化反应时间彼此独立进行为5h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为20g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为8U/mL；转氨酶的浓度为8U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.5mM。氨基供体化合物的浓度为2.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为15mM。反应体系中还含有HEPES缓冲液或Tris-HCl缓冲液，缓冲液浓度为150mM。
实施例30，一种酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
包括：采用实施例27制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例27制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物为叔丁胺和苯乙氨按2：1组成的混合物。所述的弱氧化剂化合物为有机过氧酸和氧化铜按3：1组成的混合物。催化反应的温度38℃；催化反应的pH为7.0，两个催化步骤同时进行，催化反应时间为28h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为10g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为6U/mL；转氨酶的浓度为4U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.0mM。氨基供体化合物的浓度为2mM；弱氧化剂化合物的浓度为10mM。反应体系中还含有MOPS缓冲液或者柠檬酸盐缓冲液，缓冲液浓度为100mM。
实施例31，一种酶催化制备氨基葡萄糖的方法：
包括：采用实施例27制得的葡萄糖异构酶催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用实施例27制得的转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。
所述的氨基供体化合物为D-丙氨酸和苯乙氨按1：2组成的混合物。所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐和氧化铜中按4：1组成的混合物。催化反应的温度为70℃；催化反应的pH为6。两个催化步骤分步进行，各步骤催化反应时间彼此独立进行为10h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为50g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为15U/mL；转氨酶的浓度为12U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为2mM。氨基供体化合物的浓度为3mM，弱氧化剂化合物的浓度为20mM。反应体系中还含有HEPES缓冲液，缓冲液浓度为200mM。
实施例32，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖实验：
按实施例27制备出重组葡萄糖异构酶和转氨酶。采用高效液相色谱法(HPLC)定量分析氨基葡萄糖。所用色谱柱为氨基柱，流动相为80％乙腈水溶液，流速1mL/min，柱温40℃，所用检测器为Waters2414示差折光检测器。氨基葡萄糖标准样品保留时间约为10.3min。氨基葡萄糖浓度与氨基葡萄糖的HPLC特征峰的响应强度成正比。将含有10g/L D-葡萄糖、2mM异丙胺或D-丙氨酸、100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)、1mM的磷酸吡哆醛、10mM亚磷酸盐或有机过氧酸、5U/mL葡萄糖异构酶、5U/mL 转氨酶的1mL反应混合物在37℃下反应24h。反应结束后，向反应体系添加等体积的乙腈终止反应，12000转/min离心10min，取上清液通过高效液相色谱法测定反应溶液中的氨基葡萄糖的浓度。反应进行24h时，氨基葡萄糖的浓度为7.0g/L，转化率为70％。
本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。