具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请实施例的大豆提取物及其制备方法、应用进行具体说明。

一种大豆提取物的制备方法，包括：

将大豆破壁，在55～65℃下保温0.5～3h；然后在1～4℃保温6～15h，过滤后取滤液；

向滤液中加入C1～C4醇、添加剂，调节电导率至40000～80000μs/cm后静置至体系分层，取上层液；

其中，所述添加剂为鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷和/或PEG-30二聚羟基硬脂酸酯；所述添加剂与所述大豆的重量比为10～20％。

作为示例性地，先进行破壁，然后高温保温，再低温保温，破坏大豆的内部组织使大豆异黄酮进入滤液中。

在本申请的一些实施例中，将大豆破壁的步骤包括：将大豆、助磨剂和水一并研磨。

例如，助磨剂包括硫酸钙、碳酸钙和硫酸钡中的至少一种。可以理解的是，在本申请的一些其他实施例中，助磨剂可以选用其他不会与大豆发生化学反应以及不会发生物理吸附且不溶于水的物质。

可以理解的是，在本申请的其他实施例中，可以采用其他方式破坏大豆的细胞壁，不仅限于研磨的方式。

在本申请的一些实施例中，大豆为大豆胚芽，大豆胚芽的异黄酮含量较高可以获取较多的大豆异黄酮；可以理解的是，在本申请的其他实施例中，可以直接选用大豆。

作为示例性地，助磨剂和大豆胚芽的质量比为1～4％；例如可以为1％、2％、3％、4％。

水与大豆的质量比可以为(0.8～2):1，例如可以为0.8:1、0.9:1、1：1、1.2：1、1.5：1、2：1等等。

大豆、助磨剂和水一并研磨，助磨剂可以使大豆异黄酮与大豆其他组织充分分离；研磨完成后在55～65℃下保温0.5～3h；然后在2～4℃保温6～15h，过滤后取滤液。

在55～65℃下保温，可以使蛋白质被破坏，然后在1～4℃下使大豆蛋白变性。

例如，高温下的温度可以为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、63℃、65℃等等，高温保温的时间可以为0.5h、0.8h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h等等。

作为示例性地，55～65℃下保温可以为在该温度下搅拌，例如，在55～65℃下500～800rpm(例如可以为500rpm、600rpm、700rpm、800rpm)下搅拌0.5～3h。或者，直接将研磨后的体系在55-65℃下保温0.5～3h，可以不进行搅拌等操作。

高温保温后进行低温保温，低温保温的温度为1～4℃，例如可以为1℃、2℃、3℃、4℃等等，低温保温的时间为6～15h，例如可以为6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、15h等等。低温保温的过程中可以不进行搅拌等操作。

低温保温完成后进行过滤。

例如采用离心的方式使固液分离，例如，采用10000g的离心力离心。

向所述滤液中加入C1～C4醇、添加剂并混合。

添加剂包括鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷和/或PEG-30二聚羟基硬脂酸酯。例如，添加剂包括鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷；或者，添加剂包括PEG-30二聚羟基硬脂酸酯；或者，添加剂包括鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷和/PEG-30二聚羟基硬脂酸酯。

添加剂与大豆的重量比为10～20％；例如可以为10％、11％、12％、13％、15％、16％、18％、19％、20％等等。

C1～C4醇例如可以包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇中的至少一种，在本申请的一些实施例中，C1～C4醇为乙醇。

作为示例性地，乙醇的体积为滤液体积的1～2倍；例如可以为1倍、1.2倍、1.5倍、1.8倍或者2倍等等。

可以理解的是，在不考虑乙醇的利用率等因素的情况下，乙醇的用量也可以远多于滤液。

作为示例性地，为了使滤液、C1～C4醇、添加剂充分混合，可以在2000～5000rpm下搅拌2～10min使体系混合均匀。

调节电导率至40000～80000μs/cm后静置至体系分层，取上层液；

作为示例性地，采用不溶于C1～C4醇的盐调节电导率，例如氯化钾、氯化钠、氯化钙等。

调节电导率至40000μs/cm、50000μs/cm、60000μs/cm、70000μs/cm、80000μs/cm。

例如，不溶于C1～C4醇的盐的用量可以为滤液重量的20-32％；可以理解的是，在本申请的其他实施例中，盐的用量可以以电导率为指导选择合适的量。

调节完电导率后静置至体系分层，取上层液。

大豆异黄酮主要存在于上层液(醇层)。大豆中蛋白和卵磷脂溶解在下层；添加剂可以促进蛋白和卵磷脂溶解在下层中。

在一些实施例中，还包括对上层液干燥去除醇。

本申请提供的大豆提取物的制备方法至少具有以下优点：

该方法具有成本低、可连续操作等优点，而且反应条件温和，利用相似相溶原则，在提取制备过程中实现物质纯化，高效除去蛋白质和卵磷脂。大豆中富含的蛋白质、油脂和卵磷脂等，通过添加剂进行增溶，利用不同物质的静电作用、疏水作用和生物亲和作用形成双水相，从而影响不同成分的溶解性有效提高大豆异黄酮的提取率和纯度。

本申请还提供一种大豆提取物，大豆提取物通过上述的大豆提取物的制备方法制备得到。

前述方法制备得到的大豆提取物中大豆异黄酮含量较高，蛋白质和卵磷脂含量较低。

本申请还提供一种应用，上述大豆提取物在制备抗过敏药物或者抗炎药物中的应用。

上述大豆提取物具有较佳的抗过敏和抗炎效果，可以用于制备抗过敏药物或者抗炎药物中的应用。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取1kg大豆胚芽，添加0.02kg硫酸钙，放入三辊机，加入1.02kg水，进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加20倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至4℃保温10h，10000g离心，取上清液。

(3)加入上清液重量1倍的无水乙醇，添加大豆胚芽重量的15％的鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷，4000rpm搅拌5min，加入添加大豆胚芽重量的4.5倍的氯化钾，搅拌至完全溶解即可，然后静置1.0h。图1示出了静置1.0h后的实物图，可以看出明显的分层。

(4)取上层液体(此为乙醇层)，进行真空干燥，得大豆提取物。

实施例2

本实施例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取1kg大豆胚芽，添加0.02kg硫酸钙，放入三辊机，加入1.02kg水，进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加10倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至4℃保温10h，10000g离心，取上清液。

(3)加入上清液重量2.0倍的无水乙醇，添加大豆胚芽重量的15％PEG-30二聚羟基硬脂酸酯，5000rpm搅拌5min，添加大豆胚芽重量的5倍的氯化钾，搅拌至完全溶解即可，然后静置1.0h。图2示出了静置1.0h后的实物图，可以看出明显的分层。

(4)取上层液体(此为乙醇层)，进行真空干燥，得大豆提取物。

实施例3

本实施例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取1kg大豆胚芽，添加0.02kg硫酸钙，放入三辊机，加入1.02kg水，进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加20倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至4℃保温10h，10000g离心，取上清液。

(3)加入上清液重量1倍的甲醇，添加大豆胚芽重量的15％的鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷，4000rpm搅拌5min，加入添加大豆胚芽重量的4.5倍的氯化钾，搅拌至完全溶解即可，然后静置1.0h。图3示出了静置1.0h后的实物图，可以看出明显的分层。

(4)取上层液体(此为甲醇层)，进行真空干燥，得大豆提取物。

对比例1

本对比例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取1kg大豆胚芽，放入三辊机，加入1kg的水，进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加15倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至4℃保温10h，10000g离心，去上清液。

(3)加入上清液重量2.0倍的无水乙醇，添加大豆胚芽重量的15％鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷或者PEG-30二聚羟基硬脂酸酯，2000-5000rpm搅拌5min，添加大豆胚芽重量的4倍的氯化钾，搅拌至完全溶解即可，然后静置1.0h。图4示出了静置1.0h后的实物图，可以看出明显的分层。

(4)取上层液体(此为乙醇层)，进行真空干燥，得大豆提取物。

对比例2

本对比例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取1kg大豆胚芽，添加0.02kg硫酸钙，放入三辊机，加入1.02kg水，进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加25倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至3℃保温10h，10000g离心，取上清液。

(3)加入上清液重量两倍的无水乙醇，2000-5000rpm搅拌5min，然后静置1.0h。图5示出了静置1.0h后的实物图，可以看出未分层。

(4)过滤后取滤液进行真空干燥，得大豆提取物。

对比例3

本对比例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取1kg大豆胚芽，添加0.02硫酸钙，放入三辊机，加入1.02kg水,进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加15倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，10000g离心，取上清液。

(3)加入上清液重量两倍的无水乙醇，添加大豆胚芽重量的20％鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷，5000rpm搅拌5min，添加大豆胚芽重量的4倍的氯化钾，搅拌至完全溶解即可，然后静置1.0h。图6示出了静置1.0h后的实物图，可以看出明显的分层。

(4)取上层液体(此为乙醇层)，进行真空干燥，得大豆提取物。

对比例4

本对比例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取大豆胚芽，添加0.02kg碳酸钙，放入三辊机，加入1:1的水,进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加25倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至3℃保温10h，10000g离心，取上清液。

(3)加入上清液重量1.0倍的无水乙醇，添加大豆胚芽重量的35％鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷，5000rpm搅拌5min，添加大豆胚芽重量的2.5倍的氯化钾，然后静置1.0h。图7示出了静置1.0h后的实物图，可以看出未分层。

(4)过滤后，取滤液进行真空干燥，得大豆提取物。

对比例5

本对比例提供一种大豆提取物，主要通过以下步骤制得：

(1)取大豆胚芽，添加0.02kg碳酸钙，放入三辊机，加入1:1的水,进行粉碎，重复三次，形成匀浆。

(2)取步骤(1)获得的匀浆，添加20倍水，升温至60℃，500rpm搅拌0.5h后，降温至3℃保温10h，10000g离心，取上清液。

(3)添加大豆胚芽重量的20％鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷，5000rpm搅拌5min，添加大豆胚芽重量的4.5倍的氯化钾，然后静置1.0h。图8示出了静置1.0h后的实物图，可以看出未分层。

(4)过滤后，取滤液进行真空干燥，得大豆提取物。

实验例1

采用BCA蛋白浓度测定方法测试实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物的蛋白含量。测试方法的原理为：在碱性条件下蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，然后与BCA试剂反应生成紫色化合物，在562nm处检测。测试结果如表1所示。

蛋白含量(％)＝测定样品蛋白质量(g)/大豆提取物冻干粉质量(g)

表1

实验例2

测试实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物的大豆异黄酮的含量，测试原理如下：

大豆异黄酮各组分结构中含有羟基和芳香环官能团，形成具有较强紫外吸收特性共轭体系，大豆异黄酮各组分最大吸收波长差别很小，染料木素在紫外区最大吸收波长为260nm、大豆苷元最大吸收波长为256nm，可以采用紫外分光光度法来检测大豆异黄酮的含量。以染料木素为标准品，在260nm下测吸光度值，标准曲线为y＝107.79x-0.0014，R²＝0.9999。测试结果如表2所示。

表2

从实验例1、实验例2和实施例3可以看出：

与实施例1相比，对比例1中未加入助磨剂，导致提取率低，大豆提取物中异黄酮含量较低。

对比例2中未加入添加剂以及盐，在静置后未分层，导致蛋白质和大豆异黄酮没有较好地分离，因此，对比例2的大豆提取物中大豆异黄酮的占比较小，纯度低，蛋白占比较大。

对比例3中在60℃下搅拌后，未在低温(1-4℃)下保温，对比例3大豆提取物中异黄酮的占比和蛋白占比均较大，两者未分离。

对比例4中加入添加剂，添加剂的量是大豆胚芽的重量的35％，添加剂的量过多，导致蛋白质和大豆异黄酮没有较好地分离，大豆提取物中黄酮占比较小，蛋白占比较大。

对比例5中未加入乙醇，导致未能形成两相，导致黄酮纯度低。大豆提取物中黄酮占比较小，蛋白占比较大。

实验例3

透明质酸酶体外抑制法测试实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物的大抗过敏功效。

测试方法包括：取实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物使用水溶解至浓度为5mg/mL；

取0.5mL样品、0.5mL1200U/mL透明质酸酶和0.1mLCaCl₂溶液混合，保温20min，添加0.5mL透明质酸钠，37℃保温40min；添加0.1mL氢氧化钠和0.5mL乙酰丙酮，沸水浴15min，冰浴5min，室温放置10min；1.0mLP-DAB显色，加3mL无水乙醇，混匀后在530nm处测定吸光值。

实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物对透明质酸酶抑制率的结果如图8所示。

透明质酸酶是过敏反应的参与者，分解体内的透明质酸(HA)，使其变成低分子量的酸性刺激源，引起组胺释放，诱导机体产生敏感症状。由图9可见，实施例1-3提供的大豆提取物具有优异抑制透明质酸酶的作用。

实验例4

脂肪氧化酶抑制实验测试实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物的抗炎效果。

脂肪氧化酶(简称LOX)是一种含非血红素铁的氧化还原酶，专一催化花生四希酸、亚油酸等具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应，生成白三烯类(LTs)和羟基二十四碳四烯酸(X-HETE)等具有共轭不饱和脂肪酸清过氧化物。因此，可以通过检测某种物质对脂肪氧化酶的抑制率可在一定程度上反映其抗炎活性。

测试方法包括：取实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物使用水溶解至浓度为5mg/mL。取0.1mL样品提取液和0.4mL脂肪氧化酶260u/mL，混匀于10mL试管中，30℃水浴3min，加入0.54mL/L亚油酸1.6mL，混匀于30℃水浴3min，然后加入4mL无水乙醇，234nm处检测脂肪氧化酶抑制率。

实施例1-3、对比例1-5的大豆提取物对肪氧化酶抑制率的结果如图10所示。

由图10可见，实施例1、实施例2和实施例3提供的大豆提取物对脂肪氧化酶抑制效果达95.2％，远优于对比例1-5的大豆提取物。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。