一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗
阅读说明：本技术 一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗 (Recombinant virus combination of African swine fever virus ASFV gene and vaccine prepared from recombinant virus combination ) 是由 扈荣良 周鑫韬 郭晓盼 陈腾 岳慧贤 张艳艳 张守峰 张菲 于 2021-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种非洲猪瘟病毒ASFV基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗。本发明提供了非洲猪瘟病毒蛋白组合,其包括如下3种蛋白：MGF 110-5L-6L蛋白、B119L蛋白和DP96R蛋白。上述ASFV蛋白组合还包括如下13种蛋白中的至少一种；所述13种蛋白为MGF 110-9L、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L和K196R。本发明提供的一种基于ASFV基因的重组病毒的组合及由其制备的疫苗,用该类疫苗免疫猪以后,可保护易感猪免受ASFV的自然感染或人为攻击,用于非洲猪瘟的预防。(The invention discloses a recombinant virus combination of African swine fever virus ASFV genes and a vaccine prepared from the recombinant virus combination. The invention provides an African swine fever virus protein combination, which comprises the following 3 proteins: MGF 110-5L-6L protein, B119L protein and DP96R protein. The ASFV protein combination also comprises at least one of the following 13 proteins; the 13 proteins are MGF 110-9L, I329L, MGF 505-5R, B438L, O61R, E199L, M448R, MGF 505-7R, A137R, I177L, I226R, DP71L and K196R. The combination of the recombinant virus based on the ASFV gene and the vaccine prepared by the combination can protect susceptible pigs from natural infection or artificial attack of the ASFV after the vaccines are used for immunizing the pigs, and is used for preventing African swine fever.)
技术领域
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒ASFV基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是猪的一种烈性传染病，死亡率接近100％，是养猪业的主要危害，并在流行地区造成重大损失。非洲猪瘟由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起，目前由该病毒制备的灭活疫苗和活疫苗均未获批上市。非洲猪瘟的防控一直以来主要采取扑杀和尸体清除的方法，并采取严格的生物安全措施进行防范。
非洲猪瘟病毒基因组全长170-193kb,含有150-180个ORFs,推测可编码约165种蛋白。其中已发现包括多基因家族基因等在内的大量与病毒毒力、免疫抑制、抑制凋亡等相关的基因。研究认为其毒力因子包括9GL、UK、I177L等(Lewis et al., 2000) (Zsak et al.,1998) (O’Donnell et al., 2015) (Borca et al., 2020)，免疫抑制因子包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360以及MGF505等(Afonso et al., 2004) (Li et al., 2021) (Reiset al., 2016)，血吸附因子如CD2v、EP153R等(Rodriguez et al., 1993)。
近年来针对ASFV MGF360、MGF505、CD2v、UK、A238L等基因进行缺失的减毒疫苗株，以及在家猪或野猪群中分离的自然弱毒株，在猪体内证实有一定的免疫保护效果，但有些毒株在田间试验中证明可产生慢性病变，如皮肤溃疡、发热、关节肿胀、僵猪、母猪流产和育肥期出现临床异常症状等不良反应（King et al.，2011；Leitao et al.，2001；Revilla etal.，1992，个人通讯）。人工基因缺失病毒株如MGF/CD2v、I177L、I226R、A137R、UK等基因缺失毒株具有良好的免疫效果。但是，人们对活疫苗变异等方面的担心使该类疫苗获批上市缓慢。尽管采用ASFV的一些基因如p30、p54、p72等构建的重组疫苗和亚单位疫苗据报道有一定的免疫效果，但未见效果更好的疫苗应用推广。因此，探索更为安全有效的新疫苗，一直是养猪业中ASF防控面临的重要而现实的课题。
ASFV的毒力基因种类除了上面提到的以外目前尚不完全清楚，有的基因具有抑制干扰素产生作用、有的具有凋亡抑制作用，还有一些发挥类似炎症因子作用。目前，多基因家族中的一些蛋白MGF110、MGF360、MGF505以及UK、CD2v、DP71L、9GL、B119L、I329L、DP148R、M448R等基因在缺失或发生突变以后，病毒的毒力大部分或完全丧失。过去的研究表明，很多ASFV基因组合免疫猪都不能对ASFV感染提供完全的保护。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种非洲猪瘟病毒蛋白组合。
本发明提供的非洲猪瘟病毒蛋白组合，其包括如下3种蛋白：MGF 110-5L-6L蛋白、B119L蛋白和DP96R蛋白。
上述ASFV蛋白组合还包括如下13种蛋白中的任意1种、任意2种、任意3种、任意4种、任意5种、任意6种、任意7种、任意8种、任意9种、任意10种、任意11种、任意12种或全部13种；
所述13种蛋白为MGF 110-9L、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L和K196R。
上述蛋白均来自非洲猪瘟病毒，且可以为蛋白全长，也可以为具有相同功能的蛋白截短体。
所述蛋白MGF 110-5L-6L为如下任一种：
1）由序列表中序列17所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白B119L为如下任一种：
1）由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白DP96R为如下任一种：
1）由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白B438L为如下任一种：
1）由序列表中序列20所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白O61R为如下任一种：
1）由序列表中序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白E199L为如下任一种：
1）由序列表中序列22所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白I329L为如下任一种：
1）由序列表中序列23所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白MGF 505-5R为如下任一种：
1）由序列表中序列24所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白DP71L为如下任一种：
1）由序列表中序列25所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白K196R为如下任一种：
1）由序列表中序列26所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白M448R为如下任一种：
1）由序列表中序列27所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白MGF 505-7R为如下任一种：
1）由序列表中序列28所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白A137R为如下任一种：
1）由序列表中序列29所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白I177L为如下任一种：
1）由序列表中序列30所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白I226R为如下任一种：
1）由序列表中序列31所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质；
所述蛋白MGF 110-9L为如下任一种：
1）由序列表中序列32所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）与1）至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白；
3）将1）或2）所示的序列末端添加标签得到的蛋白质。
上述ASFV蛋白组合为如下任一组合：
1）由如下3个基因编码的蛋白组成：MGF 110-5L-6L、B119L和DP96R；
2）由如下4个基因编码的蛋白组成：MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L。
3）由如下5个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R。
4）由如下6个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、I329L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、K196R；
5）由如下7个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、I329L
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、M448R、MGF 505-7R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、DP71L、K196R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、MGF 110-9L、MGF 505-5R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、MGF 505-7R、M448R；
6）由如下8个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L；
或，MGF 110-5L-6L、DP96R、B119L、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R；
或，MGF 110-5L-6L、DP96R、B119L、B438L、O61R、E199L、DP71L、K196R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L I329L、M448R、MGF 505-7R、E199L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、M448R、MGF 505-7R、A137R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、M448R、MGF 505-7R、I226R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、A137R、I177L、I226R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、O61R、DP71L、K196R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、MGF 505-5R、MGF 505-7R、E199L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、MGF 505-5R、O61R、E199L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、I329L、MGF 505-5R、MGF 110-9L、E199L；
7）由如下9个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、DP71L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L 、MGF110-9L；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、MGF 505-7RO61R、E199L、M448R、；MGF 110-9L；
8）由如下10个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、DP71L、K196R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、MGF110-9L、M448R。
9）由如下11个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、DP71L、K196R 、M448R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、MGF505-7R、MGF 110-9L、M448R；
10）由如下12个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、DP71L、K196R 、M448R、MGF 505-7R；
或，MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、MGF110-9L、A137R M448R、MGF 505-7R；
11）由如下13个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L A137R、I177L、MGF 110-9L、M448R、MGF 505-7R；
12）由如下14个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L MGF 110-9L、I226R。M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L；
13）由如下15个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-9L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L DP71L；
14）由如下16个基因编码的蛋白组成：
MGF 110-9L、B119L、DP96R、B438L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、MGF 110-5L-6L、O61R、E199L、MGF 505-5R、I329L、K196R。
本发明另一个目的是提供非洲猪瘟病毒基因组合。
本发明提供的基因组合，其包括如下3种基因：基因MGF 110-5L-6L、基因B119L和基因DP96R。
上述非洲猪瘟病毒基因组合还包括如下13种基因中的任意1种、任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个、任意8个、任意9个、任意10个、任意11个、任意12个或全部13个；
所述13种基因为基因MGF 110-9L、基因I329L、基因MGF 505-5R、基因B438L、基因O61R、基因E199L、基因M448R、基因MGF 505-7R、基因A137R、基因I177L、基因I226R、基因DP71L和基因K196R。
所述基因MGF 110-5L-6L为如下任一种：
1）序列表中序列1所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因B119L为如下任一种：
1）序列表中序列2所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因DP96R为如下任一种：
1）序列表中序列3所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因B438L为如下任一种：
1）序列表中序列4所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因O61R为如下任一种：
1）序列表中序列5所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因E199L为如下任一种：
1）序列表中序列6所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因I329L为如下任一种：
1）序列表中序列7所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因MGF 505-5R为如下任一种：
1）序列表中序列8所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因DP71L为如下任一种：
1）序列表中序列9所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因K196R为如下任一种：
1）序列表中序列10所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因M448R为如下任一种：
1）序列表中序列11所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因MGF 505-7R为如下任一种：
1）序列表中序列12所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因A137R为如下任一种：
1）序列表中序列13所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因I177L为如下任一种：
1）序列表中序列14所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因I226R为如下任一种：
1）序列表中序列15所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
所述基因MGF 110-9L为如下任一种：
1）序列表中序列16所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质且来源于非洲猪瘟病毒的DNA分子。
本发明还有一个目的是提供重组载体组。
本发明提供的重组载体组，其包括表达基因MGF 110-5L-6L、基因B119L和基因DP96R的重组载体或重组载体组。
上述重组载体组还包括表达如下13种基因中的任意1种、任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个、任意8个、任意9个、任意10个、任意11个、任意12个或全部13个的重组载体或重组载体组。
所述13种基因为基因MGF 110-9L、基因I329L、基因MGF 505-5R、基因B438L、基因O61R、基因E199L、基因M448R、基因MGF 505-7R、基因A137R、基因I177L、基因I226R、基因DP71L和基因K196R。
上述重组载体为将各个基因或多个基因插入表达载体得到的重组载体；
上述重组载体组为由上述各个重组载体组成的重组载体组；
各个基因单独或多个分布在各个重组载体上；也就是说，每个重组载体可以表达单独的基因，也可以表达多个基因偶联基因。
上述表达载体包括但不限于：人5型腺病毒、痘病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖呼吸综合征病毒、猪腺病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、狂犬病病毒、逆转录病毒、副粘病毒或其他可在哺乳动物体内产生一过性感染、稳定性感染或持续表达外源基因但不引起任何异常临床症状的病毒载体系统或细菌载体系统。
在本发明的实施例中，重组载体举例为重组腺病毒载体、重组猪繁殖呼吸综合征病毒载体、重组猪伪狂犬病病毒载体或重组狂犬病病毒载体。
本发明还有一个目的是提供重组病毒组合。
本发明提供的重组病毒组合，其包括表达基因MGF 110-5L-6L、基因B119L和基因DP96R的重组病毒或重组病毒组。
上述重组病毒组合还包括表达如下13种基因中的任意1种、任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个、任意8个、任意9个、任意10个、任意11个、任意12个或全部13个的重组病毒或重组病毒组；
所述13种基因为基因MGF 110-9L、基因I329L、基因MGF 505-5R、基因B438L、基因O61R、基因E199L、基因M448R、基因MGF 505-7R、基因A137R、基因I177L、基因I226R、基因DP71L和基因K196R。
所述重组病毒为将表达各个基因重组载体或表达多个基因的重组载体分别包装得到的重组病毒。
上述重组病毒组为由上述各个重组病毒组成的重组病毒组；
各个基因单独或多个分布在各个重组病毒上；也就是说，每个重组病毒可以表达单独的基因，也可以表达多个基因偶联基因。
上述重组病毒组合中可以为同类载体病毒组合，也可以为不同类载体病毒组合。
在本发明的实施例中，举例如下：
重组腺病毒，为将表达目标基因的重组腺病毒载体和骨架质粒pacAd5 9.2-100转染细胞，包装得到重组腺病毒。重组腺病毒组，可以为3个或3个以上的重组腺病毒组合，每种病毒使用量均大于等于108.0TCID50；如实施例中图8-12、图14所示的组合。
重组蓝耳病毒，为将表达目标基因的重组蓝耳病毒载体转染细胞，包装得到重组蓝耳病毒。重组蓝耳病毒组，可以为3个或3个以上的重组蓝耳病毒组合，每种病毒使用量均大于等于103.5TCID50；如实施例中图17所示的组合。
重组伪狂犬病病毒，为将表达目标基因的重组伪狂犬病病毒载体转染细胞，包装得到重组伪狂犬病病毒。重组伪狂犬病病毒组，可以为3个或3个以上的重组伪狂犬病病毒组合，每种病毒使用量均大于等于104.5TCID50；如实施例中图20所示的组合。
重组狂犬病病毒，为将表达目标基因的重组狂犬病病毒载体和表达N、P、G和L结构基因的载体转染细胞，包装得到重组狂犬病病毒。重组狂犬病病毒组，可以为3个或3个以上的重组狂犬病病毒组合，每种病毒使用量均大于等于106.0TCID50；如实施例中图24所示的组合；
重组病毒组，也可以为3个或3个以上重组腺病毒和3个或3个以上重组狂犬病病毒组合，每种病毒使用量均大于等于106.0TCID50；如实施例中图25和图26所示的组合；
重组病毒组，也可以为3个或3个以上重组蓝耳病毒组和3个或3个以上重组伪狂犬病病毒组合，如实施例中图27所示的组合。该重组病毒组可以混合一起注射，也可以分配2次注射，图27中重组PRRSV的滴度均为105.5TCID50/ml，重组PRV的滴度均为106.5TCID50/ml。
本发明还有一个目的是提供一种具有预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染引发的疾病的产品。
本发明提供的产品，其活性成分为上述重组病毒组合。
在该产品中，上述重组病毒组合可以任意三个重组病毒及三个以上重组病毒组合，按照一定比例混合在一起直接使用或分批使用。
上述产品中还包括佐剂或免疫增强剂或免疫调节剂或其他疫苗。
上述佐剂可以为如铝胶等盐类佐剂、不同的多糖佐剂、生物蛋白佐剂、核酸佐剂或纳米材料佐剂等；在本发明的实施例中，进一步的，所述佐剂为多糖佐剂，具体为茯苓多糖或五味子多糖。
上述非洲猪瘟病毒蛋白组合或上述的基因组合或上述重组载体组合或上述重组病毒的组合或所述产品在制备具有如下功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1）治疗或抗非洲猪瘟病毒引发的疾病；
2）预防非洲猪瘟病毒引发的疾病，如非洲猪瘟。
上述产品具体为疫苗。
本发明还提供一种预防非洲猪瘟病毒的方法，为将上述产品免疫动物后，实现免疫。在本发明的实施例中，所述产品中各个重组病毒一定比例混合后免疫。
本发明提供了一种ASFV基因的重组病毒的组合及由其制备的疫苗，即利用ASFV的MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R等基因作为目标基因，分别构建不同的病毒或细菌载体的重组病毒或重组菌，这些不同基因的重组病毒或重组细菌组合，培养的病毒液或细菌培养液按照等比例或不同比例混合后直接使用，或与佐剂、免疫增强剂一起混合后使用，免疫易感动物，都可表现良好的对非洲猪瘟病毒的免疫攻毒保护作用，可保护易感猪免受ASFV强毒的自然感染或人为攻毒，用于非洲猪瘟的预防。
非洲猪瘟病毒的毒力抗原基因同样可以被机体的免疫系统所记忆，在体内表达后刺激机体发生特异性免疫保护反应及回忆反应，使机体对ASFV的感染发挥抵抗作用。毒力抗原基因联合结构蛋白基因后免疫力进一步提高。
本发明的实验证明了，本发明提供基于ASFV基因的重组病毒的组合及由其制备的疫苗，用该类疫苗免疫猪以后，可保护易感猪免受ASFV的自然感染或人为攻击，用于非洲猪瘟的预防，即由这类毒力抗原基因和结构蛋白构建的重组病毒组合在一起，免疫猪以后，可完全抵抗强毒的攻击而不发病。
附图说明
图1为非洲猪瘟病毒基因-人5型腺病毒重组病毒构建示意图，ASFV gene可以分别是MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R（UK）、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R等基因单独或2个及以上独立或融合的基因片段。
图2为非洲猪瘟病毒基因-狂犬病病毒载体重组病毒构建示意图，ASFV gene可以分别是MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R（UK）、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R等基因单独或2个及以上独立或融合的基因片段。
图3为非洲猪瘟病毒基因-PRRSV载体重组病毒构建示意图，ASFV gene分别是MGF110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R（UK）、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R等基因单独或2个及以上独立或融合的基因片段。
图4为非洲猪瘟病毒基因-PRV载体重组病毒构建示意图，ASFV gene分别是MGF110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R（UK）、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R等基因单独或2个及以上独立或融合的基因片段。
图5为各基因扩增引物及产物大小。
图6为重组腺病毒滴度测定结果。
图7为p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62基因扩增引物及产物大小。
图8为不同重组病毒组合及传统目的蛋白重组病毒免疫攻毒结果。
图9为不同重组病毒组合及传统目的蛋白重组病毒免疫攻毒结果。
图10为不同重组病毒组合及传统目的蛋白重组病毒免疫攻毒结果。
图11为不同基因重组腺病毒组合免疫猪攻毒结果。
图12为不同基因重组腺病毒组合免疫猪攻毒结果。
图13为重组病毒特异性扩增引物及产物大小。
图14为不同三基因融合重组病毒与传统目的蛋白重组病毒免疫效果比较。
图15为重组PRRSV病毒特异性引物及产物大小。
图16为重组PRRSV滴度测定结果。
图17为不同基因组合重组猪繁殖呼吸综合征病毒免疫猪的攻毒结果。
图18为重组PRV病毒特异性引物及产物大小。
图19为非洲猪瘟病毒基因-重组PRV滴度测定结果。
图20为MGF 110-9L等基因重组PRV免疫猪攻毒结果。
图21为转染液的配制。
图22为ASFV基因-重组RABV病毒特异性鉴定引物及产物大小。
图23为非洲猪瘟病毒基因-重组RABV滴度测定结果。
图24为ASFV基因重组狂犬病病毒免疫猪攻毒结果。
图25为ASFV基因-重组腺病毒、重组狂犬病病毒免疫猪攻毒结果。
图26为ASFV基因重组腺病毒、重组狂犬病病毒免疫猪攻毒结果。
图27为ASFV基因重组PRRSV、重组PRV免疫猪攻毒结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中采用的细胞、毒株和载体为如下：
1、细胞HEK293AD细胞（购自美国Invitrogen公司），本单位实验室保存，需在含有1%-10% 胎牛血清的DMEM培养基或全悬浮培养基中培养。BHK-21细胞（购自中国兽医药品监查所），本单位实验室保存，需在含有1%-10% 胎牛血清的DMEM培养基或全悬浮培养基中培养。Marc-145细胞（购自中国兽医药品监查所），本单位实验室保存，需在含有1%-10% 胎牛血清的DMEM培养基中培养。Vero细胞（购自中国兽医药品监查所），本单位实验室保存，需在含有1%-10% 胎牛血清的DMEM培养基培养。
2、外源基因的表达质粒载体pacAd5 CMVK-NpA（购自美国Invitrogen公司）、骨架质粒pacAd5 9.2-100（购自美国Invitrogen公司）均在大肠杆菌中扩增和提取。
3、狂犬病病毒疫苗株本实验室保存的弱毒疫苗株SRV9株(岳军明，侯世宽，殷震.狂犬病疫苗口服免疫的研究现状[J].中国人兽共患病杂志,1994,10(3):32-35.)。
4．PRRSV疫苗候选株为本实验室合成的PRRSV-A1株（基因全长由吉林库美生物技术有限公司合成，序列33的第59-15453bp），为一株拯救的弱毒疫苗株，感染性基因组克隆在质粒中。
5．伪狂犬病病毒毒株为疫苗候选株JL14-△gI/gE株，具体构建方法：本实验室分离鉴定的强毒JL株，通过gI、gE基因的同源重组缺失后致弱为疫苗候选株JL14-△gI/gE株（候选株JL14-△gI/gE记载在如下文献中：周鑫韬. 伪狂犬病病毒基因缺失株JL14-△gI/gE/TK构建及特性研究[D].吉林农业大学,2018.）。
6．非洲猪瘟病毒SY18株（记载在如下文献中：Zhou X, Li N, Luo Y, Liu Y,Miao F, Chen T, Zhang S, Cao P, Li X, Tian K, Qiu HJ, Hu R (2018) Emergenceof African Swine Fever in China, 2018. Transboundary and emerging diseases 65(6):1482-1484. doi:10.1111/tbed.12989），由军事兽医研究所流行病学研究室于2018年分离。本病毒的基因组序列的GenBank登录号：MH766894（2018年8月17日提交），本研究所使用毒株为采用PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。
非洲猪瘟病毒目标基因MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、I329L、MGF 505-5R、DP71L、K196R、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、MGF 110-9L。
下述实施例中的基因和蛋白序列如下：
非洲猪瘟病毒目标基因MGF 110-5L-6L（序列1）、B119L（序列2）、DP96R（序列3）、B438L（序列4）、O61R（序列5）、E199L（序列6）、I329L（序列7）、MGF 505-5R（序列8）、DP71L（序列9）、K196R（序列10）、M448R（序列11）、MGF 505-7R（序列12）、A137R（序列13）、I177L（序列14）、I226R（序列15）、MGF 110-9L（序列16）的核苷酸序列依次为序列1-序列16。
上述目标基因编码的蛋白MGF 110-5L-6L（序列17）、B119L（序列18）、DP96R（序列19）、B438L（序列20）、O61R（序列21）、E199L（序列22）、I329L（序列23）、MGF 505-5R（序列24）、DP71L（序列25）、K196R（序列26）、M448R（序列27）、MGF 505-7R（序列28）、A137R（序列29）、I177L（序列30）、I226R（序列31）、MGF 110-9L（序列32）的氨基酸序列依次为序列17-序列32。
实施例1、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒构建及免疫效果
一、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒构建
本实施例是提供非洲猪瘟病毒目标基因MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、I329L、MGF 505-5R、DP71L、K196R、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、MGF 110-9L重组腺病毒的构建（其他复制缺陷型和可复制型载体DNA病毒的ASFV基因重组毒的构建和使用策略相似）。
1、同源重组质粒的构建
采用常规方法提取非洲猪瘟病毒SY18株基因组，分别设计带有表达质粒载体pacAd5 CMVK-NpA同源臂的ASFV MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、I329L、MGF 505-5R、DP71L、K196R、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、MGF 110-9L目标基因的引物（图5）。以SY18株基因组为模板，采用PCR方法分别扩增，获得各个基因的同源重组基因片段。
下述重组质粒为将各个基因片段插入质粒pacAd5 CMVK-NpA（人5型腺病毒表达载体）的EcoRI位点间得到的质粒。
将上述各个基因的同源重组基因片段分别与EcoRI酶切后得到的线性化pacAd5CMVK-NpA质粒连接，再转化大肠杆菌感受态细胞，进行同源重组，分别获得如下16种重组质粒：pAdCMV-MGF 110-5L-6L、pAdCMV-B119L、pAdCMV-DP96R、pAdCMV-B438L、pAdCMV-O61R、pAdCMV-E199L、pAdCMV-I329L、pAdCMV-MGF 505-5R、pAdCMV-DP71L、pAdCMV-K196R、pAdCMV-M448R、pAdCMV-MGF 505-7R、pAdCMV-A137R、pAdCMV-I177L、pAdCMV-I226R、pAdCMV-MGF110-9L。
上述16种重组质粒分别将ASFV MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、B438L、O61R、E199L、I329L、MGF 505-5R、DP71L、K196R、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、MGF110-9L这些目标基因通过各个基因的同源重组基因片段插入pacAd5 CMVK-NpA质粒的EcoRI酶切位点中得到的载体，16种重组质粒分别表达对应的16种目标基因。
2、重组病毒的拯救和鉴定
将重组质粒pAdCMV-MGF 110-5L-6L、pAdCMV-B119L、pAdCMV-DP96R、pAdCMV-B438L、pAdCMV-O61R、pAdCMV-E199L、pAdCMV-I329L、pAdCMV-MGF 505-5R、pAdCMV-DP71L、pAdCMV-K196R、pAdCMV-M448R、pAdCMV-MGF 505-7R、pAdCMV-A137R、pAdCMV-I177L、pAdCMV-I226R、pAdCMV-MGF 110-9L和骨架质粒pacAd5 9.2-100分别采用PacI酶进行线性化，得到16种酶切后的重组质粒和酶切后的骨架质粒pacAd5 9.2-100。
分别将上述各个酶切后的重组质粒以一定比例（2微克）和酶切骨架质粒pacAd59.2-100（4微克）混合，再与12微升转染试剂（Lipofectamine® 2000）混合后，加入2ml细胞培养液，均匀加入到细胞单层上，转染25CM2的长成单层的HEK293AD细胞，3天后，对转染的细胞进行传代，长至单层后，按照上述步骤分别进行第二次转染。
按以上步骤转染3次，观察到细胞有大量变圆等病变时，冻融细胞，收集并保存冻融液，分别记为P0代重组腺病毒，不同的基因片段记为不同的重组腺病毒；将P0代重组腺病毒按照一定比例（MOI值为0.1）接入25CM2细胞瓶（10ml培养液）的新鲜HEK293AD细胞中，2天病变后冻融，并收集保存冻融液，此为P1代重组腺病毒；重复上述步骤收集到P2、P3代重组腺病毒。
3、检测
将上述2获得的表达各个目标基因的P3代重组腺病毒进行滴度测定，测定方法为：将病毒培养液作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复孔，接种到96孔板的HEK293AD细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养5-6日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
结果如下图6所示。
提取表达各个目标基因的P3代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物（上游引物：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG，下游引物：CACTGCATTCTAGTTGTGGTTT）进行重组腺病毒鉴定，预期鉴定产物大小如图5中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
将上述表达各个目标基因的重组腺病毒分别命名rAdv-MGF 110-5L-6L、rAdv-B119L、rAdv-DP96R、rAdv-B438L、rAdv-O61R、rAdv-E199L、rAdv-I329L、rAdv-MGF 505-5R、rAdv-DP71L、rAdv-K196R、rAdv-M448R、rAdv-MGF 505-7R、rAdv-A137R、rAdv-I177L、rAdv-I226R、rAdv-MGF 110-9L（如图6）。
非洲猪瘟病毒基因-重组腺病毒的构建过程示意图见图1。
二、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒不同组合的免疫保护试验
本发明采用上述一制备的表达各个目标基因的重组腺病毒rAdv-MGF 110-5L-6L、rAdv-B119L、rAdv-DP96R、rAdv-B438L、rAdv-O61R、rAdv-E199L、rAdv-I329L、rAdv-MGF505-5R、rAdv-DP71L、rAdv-K196R、rAdv-M448R、rAdv-MGF 505-7R、rAdv-A137R、rAdv-I177L、rAdv-I226R、rAdv-MGF 110-9L按照3、4、5、6、7、8…12个基因重组腺病毒组合进行免疫保护试验（其他复制缺陷型和可复制型载体DNA病毒以及这些基因的其他组合和使用策略相似），具体如下：
1、免疫
上述一制备的重组腺病毒按照图8-图10所示的3、4、5、6、7、8…12个基因重组腺病毒组合形式组合（每种病毒均使用108.0TCID50），得到不同组合形式的疫苗，总体积2ml，且在每头份疫苗中加入100微克茯苓多糖；
茯苓多糖按照如下方法制备：将10Kg茯苓块茎粉碎，加入50Kg蒸馏水浸泡过夜，加热至80℃，维持2小时，并不断搅拌，通过连续离心机以10000rpm（离心力为12857g g）离心15分钟收集上清，通过旋转蒸发器蒸发水分至上清体积的1/10。取上清若干，加入1/5体积的石油醚，37℃回流60min，取水相加入无水乙醇至乙醇终浓度为65%，静置1小时后，8000rpm（8228g）离心30min，收集沉淀，将沉淀重悬于质量体积比（g：ml）为0.9%生理盐水（Nacl水溶液）中，使沉淀的终浓度达到100mg/ml，即为茯苓多糖。
实验组：将上述添加了茯苓多糖的每种组合形式的疫苗分别注射猪颈部肌肉（每种病毒均使用108.0TCID50，每种病毒混合后每头份（总体积2ml）再加100微克茯苓多糖），每组5头。
对照免疫组：利用分别表达p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62和pp220基因的重组腺病毒的混合物作为对照（每种病毒均使用108.0TCID50，混合后每头份（2ml）再加100微克茯苓多糖），每组5头。
分别表达p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62、pp220基因的重组腺病毒分别按照一中的重组腺病毒的构建方法制备，模板为非洲猪瘟病毒SY 18株基因组，引物序列和扩增基因大小如图7。
提取表达各个目标基因的P3代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物（上游引物：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG，下游引物：CACTGCATTCTAGTTGTGGTTT）进行重组腺病毒鉴定，预期鉴定产物大小如图7中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日（以第二次免疫第一天记作第1日）采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒：每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株。观察猪的存活情况。
各组合的重组腺病毒的免疫攻毒结果如图8-图10所示，可以看出，各组合的重组腺病毒均有显的攻毒保护效果，表明选择的非洲猪瘟病毒基因组合具有明显的攻毒保护效果。
三、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒不同组合的免疫保护试验
本发明采用上述一制备的表达各个目标基因的重组腺病毒rAdv-MGF 110-9L、rAdv-MGF 110-5L-6L、rAdv-MGF 505-5R、rAdv-B119L、rAdv-DP96R、rAdv-I329L、rAdv-B438L、rAdv-O61R、rAdv-E199L、rAdv-M448R、rAdv-MGF 505-7R、rAdv-A137R、rAdv-I177L、rAdv-I226R、rAdv-DP71L和rAdv-K196R中9个以上（9、10、11、12、13、14、15、16个）重组腺病毒组合的免疫和攻毒试验。
1、免疫
上述一制备的重组腺病毒随机原则选取9个以上包括9、10、11、12、13、14、15、16个重组腺病毒组合作为1头份疫苗，如图11-12所示，每种组合中每种重组腺病毒的病毒滴度均为108TCID50-1010TCID50/ml，每种组合每种重组病毒取108TCID50，等比例混合，并在每头份疫苗中加入100微克五味子多糖；
五味子多糖按照如下方法制备：将10Kg五味子叶粉碎，加入50Kg蒸馏水浸泡过夜，加热至80℃，维持2小时，并不断搅拌，通过连续离心机以10000rpm（离心力为12857g）离心15分钟收集上清，通过旋转蒸发器蒸发水分至上清体积的1/10。取上清若干，加入1/5体积的石油醚，37℃回流60min，取水相加入无水乙醇至乙醇终浓度为70%，静置1小时后，8000rpm（8228g）离心30min，收集沉淀，将沉淀重悬于质量体积比（g：ml）为0.9%生理盐水（Nacl水溶液）中，使沉淀的终浓度达到100mg/ml，即为五味子多糖。
实验组：将上述添加了五味子多糖的每种组合形式的疫苗分别肌肉注射猪颈部肌肉（每种病毒均使用108TCID50/ml，等比例混合后每头份（2ml）再加100微克五味子多糖），每组5头。
对照免疫组（免疫传统载体疫苗组合）：利用分别表达p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62、pp220基因的重组腺病毒的混合物作为对照（每种病毒均使用108.0TCID50，混合后再加100微克五味子多糖），每组5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日（以第二次免疫第一天记作第1日）采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒：每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图11-图12所示，通过28日内观察，攻毒对照组全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，其他免疫实验组5头猪全部健活。
实施例2、表达非洲猪瘟病毒多目标基因的重组腺病毒构建及免疫效果
本发明提供了ASFV三基因融合重组腺病毒的构建和免疫效果（其他复制缺陷型和可复制型载体DNA病毒任意三基因及以上融合的构建和组合使用策略相似），具体如下：
一、ASFV三基因融合重组腺病毒的构建
将MGF 110-5L-6L基因序列+linker序列+DP96R基因序列+linker序列+B119L基因序列中3个基因的编码区核苷酸依次通过In-fusion方法串联连接，得到三基因融合片段（A组，MGF 110-5L-6L-DP96R-B119L）；
将B438L基因序列+linker序列+O61R基因序列+linker序列+E199L基因序列中3个基因的编码区核苷酸依次通过In-fusion方法串联连接，得到三基因融合片段（B组，B438L-O61R-E199L）；
将MGF 505-5R基因序列+linker序列+I329L基因序列+linker序列+M448R基因序列中3个基因的编码区核苷酸依次通过In-fusion方法串联连接，得到三基因融合片段（C组，MGF 505-5R-I329L-M448R）；
上述linker序列为：gcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccg。
按照实施例1的一中的重组腺病毒构建方法分别构建三基因融合重组腺病毒：先将各个三基因融合片段扩增后得到同源重组片段（以三基因融合片段为模板，扩增所需引物和产物大小如图13所示），通过同源重组构建到pacAd5 CMVK-NpA质粒的EcoRI酶切位点中，得到重组质粒，再将重组质粒和骨架质粒pacAd5 9.2-100转染到HEK293AD细胞，收获冻融液，直到得到各个P3代三基因融合重组腺病毒，分别命名为rAdv-MGF 110-5L-6L-DP96R-B119L（A）、rAdv-B438L-O61R-E199L（B）、rAdv-MGF 505-5R-I329L-M448R（C）。
每种目的基因的扩增引物及产物大小见图13。
提取表达各个目标基因的P3代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物（上游引物：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG，下游引物：CACTGCATTCTAGTTGTGGTTT）进行重组腺病毒鉴定，预期鉴定产物大小如图13中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
按照常规方法测定各重组病毒的滴度，测定时，将获得的每个病毒培养液分别作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复，接种到96孔板的HEK293AD细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养5-6日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如图14所示。
二、三基因融合重组腺病毒的免疫保护试验
1、免疫
实验组：上述一制备的各个三基因融合重组腺病毒（图14所示）分别取108.0TCID50，以A、A+B、A+B+C、A+C分别混合后再加100微克茯苓多糖；注射猪颈部肌肉，每组免疫5头。
对照免疫组：用分别表达p30、p54、p72的重组腺病毒的三种病毒混合物作为对照，每种病毒均使用108.0TCID50，混合后再加100微克茯苓多糖，每组免疫5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日（以第二次免疫第一天记作第1日）采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒，口服103.0TCID50/2mlASFV强毒SY18株。观察猪的生存情况。
结果如下：
各重组病毒构建的结果分别命名为：rAdv-MGF 110-5L-6L-DP96R-B119L（A），rAdv-B438L-O61R-E199L（B），rAdv-MGF 505-5R-I329L-M448R（C）。
各重组病毒的滴度测定结果、免疫效果如图14所示，可以看出，不免疫对照猪全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，其他免疫组5头猪全部健活。说明选择的基因及融合组合具有明显的攻毒保护效果，不同于传统的基因选择。
实施例3、ASFV基因重组PRRSV病毒的构建及免疫原性检测
MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组PRRSV的构建，具体如下：
一、ASFV 基因重组PRRSV病毒的构建
1、重组载体的构建
病毒拯救质粒构建以质粒pcDNA3.1为载体，在图3所示位置插入HamRz-PRRSV(5’UTR-ORF1-TRS-PacⅠ-ORF2-ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-3’UTR)-HdvRz片段（序列33）插入质粒pcDNA3.1（Invitrogen，货号：V790-20）的EcoRV酶切位点间，得到的质粒。
序列33所示的HamRz-PRRSV(5’UTR-ORF1-PacⅠ-TRS-ORF2-ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-3’UTR)-HdvRz片段中第1-58位为锤头状核酶编码基因、第12048-12048位为酶切位点PacⅠ、第12049-12087为转录调控序列TRS、第15454-15537位为丁肝核酶编码基因。
以ASFV SY18株DNA为模板，参考Takara公司无缝克隆酶In-Fusion说明书要求设计引物（图15所示），PCR扩增带MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因,按照图3所示位置分别克隆到EcoRV酶切后的质粒pcDNA-HH-PRRSV-TRS上，构建重组PRRSV拯救质粒pcDNA-HH-PRRSV-MGF 110-9L、pcDNA-HH-PRRSV-MGF 110-5L-6L、pcDNA-HH-PRRSV-B119L、pcDNA-HH-PRRSV-DP96R、pcDNA-HH-PRRSV-I329L、pcDNA-HH-PRRSV-MGF 505-5R、pcDNA-HH-PRRSV-B438L、pcDNA-HH-PRRSV-O61R、pcDNA-HH-PRRSV-E199L、pcDNA-HH-PRRSV-M448R、pcDNA-HH-PRRSV-MGF 505-7R、pcDNA-HH-PRRSV-A137R、pcDNA-HH-PRRSV-I177L、pcDNA-HH-PRRSV-I226R、pcDNA-HH-PRRSV-DP71L、pcDNA-HH-PRRSV-K196R。
上述重组质粒为将各个基因片段插入质粒pcDNA-HH-PRRSV-TRS的PacⅠ位点间得到的质粒。
2、重组病毒的拯救和鉴定
以MGF 110-9L基因重组PRRSV的拯救、鉴定为例。
将重组PRRSV拯救质粒pcDNA-HH-PRRSV-MGF 110-9L转染BHK-21细胞，3天后冻融2次，收集上清转接到Marc145细胞，观察4天，若发现细胞病变即证明重组病毒拯救成功，标记为rPRRSV-MGF 110-9L。
用鉴定引物（上游引物:5’-TGCTGGAAAGTGATGTTGGAC-3’,下游引物:5’-TGCTCAGGGTGAACGGTAGA-3’）对重组病毒rPRRSV-MGF 110-9L进行RT-PCR鉴定，得到目标产物大小正确（如图15中所示），则为目标重组病毒。
以同样的方法，分别用对应的拯救质粒转染BHK细胞，拯救得到表达MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因的重组PRRSV病毒rPRRSV-MGF 110-9L、rPRRSV-MGF110-5L-6L、rPRRSV-B119L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-I329L、rPRRSV-MGF 505-5R、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L、rPRRSV-M448R、rPRRSV-MGF 505-7R、rPRRSV-A137R、rPRRSV-I177L、rPRRSV-I226R、rPRRSV-DP71L、rPRRSV-K196R，用鉴定引物进行RT-PCR鉴定。
非洲猪瘟病毒基因-重组PRRSV的构建和拯救过程见图3。
测定非洲猪瘟病毒基因-重组PRRSV的滴度，测定时，将获得的每个重组病毒的培养液分别作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复，接种到96孔板的Marc-145细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养4-5日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如下图16所示。
二、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组PRRSV病毒不同组合的免疫保护试验
MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组PRRSV的免疫和攻毒试验如下：
1、免疫
分别以106.0TCID50以上的各重组PRRSV病毒液组合，按照等比例混合。
组合1：rPRRSV-MGF 110-5L-6L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-B119L、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L
组合2：rPRRSV-MGF 110-5L-6L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-B119L、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L、rPRRSV-I329L
组合3：rPRRSV-MGF 110-5L-6L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-B119L、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L、rPRRSV-I329L、rPRRSV-MGF 505-5R
组合4：rPRRSV-MGF 110-5L-6L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-B119L、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L、rPRRSV-M448R、rPRRSV-MGF 505-7R
组合5：rPRRSV-MGF 110-5L-6L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-B119L、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L、rPRRSV-DP71L、rPRRSV-K196R
组合6：rPRRSV-MGF 110-9L、rPRRSV-MGF 110-5L-6L、rPRRSV-B119L、rPRRSV-DP96R、rPRRSV-I329L、rPRRSV-MGF 505-5R、rPRRSV-B438L、rPRRSV-O61R、rPRRSV-E199L、rPRRSV-M448R、rPRRSV-MGF 505-7R、rPRRSV-A137R、rPRRSV-I177L、rPRRSV-I226R、rPRRSV-DP71L、rPRRSV-K196R
实验组：上述一制备的各个组合中的重组PRRSV病毒分别取105.5TCID50/ml每种重组病毒等比例混合，每种病毒0.3ml，混合后再加100微克五味子多糖；注射猪颈部肌肉，每组免疫5头。
免疫传统载体疫苗组合组：用rAdv-p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62、pp220重组腺病毒混合物作为对照，每种病毒均使用106.0TCID50，混合后再加100微克五味子多糖，每组免疫5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
不免疫攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日（以第二次免疫第一天记作第1日）采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒（每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株）。观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图17所示，不免疫对照猪全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，其他免疫组5头猪全部健活。
实施例4、ASFV基因重组PRV病毒的构建及免疫原性检测
MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组伪狂犬病病毒的构建，具体如下：
一、ASFV 基因重组PRV病毒的构建
pUC-ΔTK-EGFP质粒以质粒pUC19（Takara公司，Code No.3219）基础，将TKRight Arm-EGFP-TKLeft Arm片段（序列34）插入pUC19质粒的XbaⅠ和SphⅠ酶切位点之间所得。
以ASFV SY18株DNA为模板，参考Takara公司无缝克隆酶In-Fusion说明书要求设计引物（图18），PCR扩增带MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因对应片段,按照图4所示位置分别克隆到pUC-ΔTK-EGFP质粒上，构建同源重组质粒pUC-ΔTK-EGFP-MGF 110-9L、pUC-ΔTK-EGFP-MGF 110-5L-6L、pUC-ΔTK-EGFP-B119L、pUC-ΔTK-EGFP-DP96R、pUC-ΔTK-EGFP-I329L、pUC-ΔTK-EGFP-MGF 505-5R、pUC-ΔTK-EGFP-B438L、pUC-ΔTK-EGFP-O61R、pUC-ΔTK-EGFP-E199L、pUC-ΔTK-EGFP-M448R、pUC-ΔTK-EGFP-MGF 505-7R、pUC-ΔTK-EGFP-A137R、pUC-ΔTK-EGFP-I177L、pUC-ΔTK-EGFP-I226R、pUC-ΔTK-EGFP-DP71L、pUC-ΔTK-EGFP-K196R。
上述重组质粒为将各个基因片段在In-Fusion酶作用下重组，插入PCR获得的pUC-ΔTK-EGFP线性化片段的GCCACC（Kozak序列）和EGFP基因之间，得到的质粒。
2、重组病毒拯救、纯化及鉴定
以MGF 110-9L 基因重组伪狂犬病病毒的拯救、纯化及鉴定为例。
将重组质粒pUC-ΔTK-EGFP-MGF 110-9L转染BHK细胞，5h后以0.1MOI感染病毒JL14-△gI/gE中；培养24h后，挑取有绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BHK细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化4轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BHK细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存；使用鉴定引物（上游引物：5’-GGCTGACCGCCCAACGA-3’,下游引物：5’- CCTTGCTCACCATCGGTCC-3’）进行纯度鉴定，鉴定条带大小如图18中所示；所得纯化后的毒株即命名为rPRV JLΔTKΔgIgE-MGF 110-9L。
以同样的方法，用对应的同源重组质粒转染BHK细胞，拯救纯化得到PRV-MGF 110-9L、PRV-MGF 110-5L-6L、PRV-B119L、DP96R、PRV-I329L、PRV-MGF 505-5R、PRV-B438L、PRV-O61R、PRV-E199L、PRV-M448R、PRV-MGF 505-7R、PRV-A137R、PRV-I177L、PRV-I226R、PRV-DP71L、PRV-K196R基因重组伪狂犬病病毒，用鉴定引物鉴定正确后，-40℃保存。
非洲猪瘟病毒基因-重组伪狂犬病病毒的构建和拯救过程见图4。
测定非洲猪瘟病毒基因-重组伪狂犬病病毒的滴度，测定时，将获得的每个重组病毒的培养液分别作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复，接种到96孔板的Vero细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养3-4日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如图19所示。
二、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组PRV病毒不同组合的免疫保护试验
MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组伪狂犬病病毒的免疫和攻毒试验如下：
1、免疫
组合1：PRV-MGF 110-5L-6L、PRV-DP96R、PRV-B119L
组合2：PRV-MGF 110-5L-6L、PRV-DP96R、PRV-B119L、PRV-MGF 505-5R、PRV-I329L、PRV-MGF 505-7R、PRV-B438L、PRV-E199L
组合3：PRV-MGF 110-5L-6L、PRV-B119L、PRV-DP96R、PRV-MGF 505-5R、PRV-I329L、PRV-B438L、PRV-O61R、PRV-E199L
组合4：PRV-MGF 110-9L、PRV-MGF 110-5L-6L、PRV-MGF 505-5R、PRV-B119L、PRV-DP96R、PRV-I329L、PRV-B438L、PRV-O61R、PRV-E199L、PRV-M448R、PRV-MGF 505-7R、PRV-A137R、PRV-I177L、PRV-I226R、PRV-DP71L、PRV-K196R
实验组：上述一制备的各个组合中的重组PRV病毒分别取106.5TCID50/ml，每种重组病毒等比例混合，每种病毒0.1ml，混合后再加100微克刺4%纳米五味子多糖；注射猪颈部肌肉，每组免疫5头。
免疫传统载体疫苗组合组：用rAdv-p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62、pp220重组腺病毒混合物作为对照，每种病毒均使用108.0TCID50，混合后再加100微克五味子多糖，每组免疫5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
不免疫攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日（以第二次免疫第一天记作第1日）采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒（每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株）。观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图20所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，免疫组合1有2头出现厌食、沉郁、卧地、高烧、死亡，另外3头轻微发热，最后康复。免疫组合2及其他免疫组的5头猪全部健活。
实施例5、ASFV基因重组狂犬病病毒的构建及免疫原性检测
ASFV MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R单个基因、两个及以上独立基因、两个及以上融合基因可复制型基因重组狂犬病病毒的构建（其他可复制型RNA病毒载体构建策略类似）
一、ASFV基因重组SRV9病毒的构建
1．RABV全长基因组转录载体的构建
（1）pcDNA3.1-SRV9-PacI质粒的线性化
以PacI酶切pcDNA3.1-SRV9-PacI质粒（本实验室在pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点中连入HamRZ-SRV9-pacI-HdvRZ序列（序列35），包含核酶和SRV9毒株全长基因组cDNA序列，且在全长基因组的P和M基因之间引入PacI酶切位点，以便后续的外源基因克隆），获得线性化载体。
（2）表达外源基因重组载体质粒构建
扩增（引物和目的条带大小为图22）获得MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R等基因片段，两侧含有狂犬病病毒（RABV）同源臂。
用各基因片段分别与pcDNA3.1-SRV9-PacI线性化载体进行in-fusion连接，菌液PCR鉴定和核酸片段测序正确的质粒分别命名为pcDNA3.1-SRV9-MGF 110-9L、pcDNA3.1-SRV9-MGF 110-5L-6L、pcDNA3.1-SRV9-MGF 505-5R、pcDNA3.1-SRV9-B119L、pcDNA3.1-SRV9-DP96R、pcDNA3.1-SRV9-I329L、pcDNA3.1-SRV9-B438L、pcDNA3.1-SRV9-O61R、pcDNA3.1-SRV9-E199L、pcDNA3.1-SRV9-M448R、pcDNA3.1-SRV9-MGF 505-7R、pcDNA3.1-SRV9-A137R、pcDNA3.1-SRV9-I177L、pcDNA3.1-SRV9-I226R、pcDNA3.1-SRV9-DP71L、pcDNA3.1-SRV9-K196R。
上述重组质粒为将各个基因片段同源重组插入质粒pcDNA3.1-SRV9-PacI的PacI酶切位点间得到的质粒。
2、辅助质粒的构建
以EcoRV酶切线性化载体pcDNA3.1（购自Invitrogen，本实验室构建保存的表达载体）；以全长转录载体为模板扩增获得N、P、G和L结构基因片段的扩增；将4个片段分别与线性化的载体质粒进行同源重组连接，转化大肠杆菌，测序鉴定出正确的质粒。备用于病毒的转染拯救。
pcDNA3.1-N为将SRV9-N基因（提交日为Jun 22, 2004，GenBank:AF499686.2，第71~1423bp）插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒；
pcDNA3.1-P为将SRV9-P基因（提交日为Jun 22, 2004，GenBank:AF499686.2，第1514~2407bp）插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒；
pcDNA3.1-G为将SRV9-G基因（提交日为Jun 22, 2004，GenBank:AF499686.2，第3317~4891bp）插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒；
pcDNA3.1-L为将SRV9-L基因（提交日为Jun 22, 2004，GenBank:AF499686.2，第5414~11797bp）插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒。
3．重组病毒的拯救
（1）提前12-24h，铺细胞BSR（金黄仓鼠肾细胞，上海细胞库，货号-BFN60810674），于6孔板中，共准备2孔细胞，其中1个用于转染，1个用于空白对照。
（2）转染：待细胞长至单层后，准备进行转染。转染体系如下图21（以-A137R基因为例，其余重组病毒的拯救方法相同）：
（3）每天观察转染细胞状况，5-7天（根据细胞状态），直接刮取细胞，吹打均匀，一部分接到新的单层BSR细胞中继续扩大培养，接种量为5%（V/V）；一部分用于直接免疫荧光鉴定（针对RABV-N和-A137R）：根据孔中是否有荧光信号判定病毒是否拯救成功，外源基因-A137R是否正确表达。
（4）遗传稳定性鉴定：重组病毒连续传代10次，选取2、4、6、8、10共5个代次的病毒进行序列、滴度测定和免疫荧光鉴定。结果病毒传代后序列和蛋白特性表现稳定。
以同样的方法，分别用其他重组质粒重组病毒的拯救，获得重组病毒SRV9-MGF110-9L、SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-MGF 505-5R、SRV9-B119L、SRV9-DP96R、SRV9-I329L、SRV9-B438L、SRV9-O61R、SRV9-E199L、SRV9-M448R、SRV9-MGF 505-7R、SRV9-A137R、SRV9-I177L、SRV9-I226R、SRV9-DP71L、SRV9-K196R。
免疫荧光鉴定所需要的FITC标记RABV抗体购自吉林紫荆神州生物技术有限公司，产品目录号为ZJ-023-016.
提取表达各个目标基因的P3代重组狂犬病病毒的核酸，使用鉴定引物（上游引物：TGGTGAGATAGCCAAGGTG，下游引物：AACTCAGTATCATCATCCCAAG）进行外源基因鉴定，预期鉴定产物大小如图22中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
非洲猪瘟病毒基因-重组狂犬病病毒的构建和拯救过程见图2。
测定非洲猪瘟病毒基因-重组狂犬病病毒的滴度，测定时，将获得的每个重组病毒的培养液分别作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复，接种到96孔板的BHK细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养4-5日时，进行荧光抗体染色。在荧光显微镜下观察病毒增殖情况，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如图23所示。
二、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组SRV9病毒不同组合的免疫保护试验
ASFV MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重狂犬病病毒的免疫和攻毒试验如下：
1、免疫
组合1：SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-DP96R、SRV9-B119L（组合1）；
组合2：SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-DP96R、SRV9-B119L、SRV9-MGF 505-5R、SRV9-MGF110-9L、SRV9-I329L、SRV9-B438L、SRV9-E199L、（组合2）；
组合3：SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-DP96R、SRV9-B119L、SRV9-MGF 505-7R、SRV9-A137R、SRV9-I177L、SRV9-I226R、SRV9-DP71L、SRV9-K196R（组合3）；
组合4：SRV9-MGF 110-9L、SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-B119L、SRV9-DP96R、SRV9-O61R、SRV9-E199L、SRV9-M448R、SRV9-MGF 505-7R（组合4）；
组合5：SRV9-MGF 110-9L、SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-MGF 505-5R、SRV9-B119L、SRV9-DP96R、SRV9-I329L、SRV9-B438L、SRV9-O61R、SRV9-E199L、SRV9-M448R、SRV9-MGF 505-7R、SRV9-A137R、SRV9-I177L、SRV9-I226R、SRV9-DP71L、SRV9-K196R（组合5）；
实验组：上述一制备的各个组合中的重组RABV病毒分别取108.0TCID50/ml，每种重组病毒等比例混合，每种病毒0.1ml，混合后直接进行注射猪颈部肌肉，每组免疫5头。
免疫传统载体疫苗组合组：分别用表达p30、p54、p72、pCD2v、pF317L、pp62、pp220重组腺病毒的混合物作为对照，每种病毒均使用108.0TCID50，混合后直接进行注射，每组免疫5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
不免疫攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日（以第二次免疫第一天记作第1日）采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒（每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株）。观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图24所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，其他免疫组5头猪全部健活。
实施例6、重组腺病毒和重组狂犬病病毒的免疫和攻毒试验
ASFV MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组腺病毒和重组狂犬病病毒的免疫和攻毒试验，具体如下：
1、免疫
实验组：rAdv-MGF 110-5L-6L、rAdv-DP96R、rAdv-B119L、rAdv-DP71L、rAdv-K196R、rAd-O61R、rAdv-E199L、rAdv-MGF 505-5R基因重组腺病毒和SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-DP96R、SRV9-B119L、SRV9-O61R、SRV9-DP71L、SRV9-K196R、SRV9-E199L、SRV9-MGF 505-5R基因重组狂犬病病毒两组重组病毒组合；两组疫苗组合先（重组腺病毒）后（重组狂犬病病毒）肌肉注射猪颈部肌肉，间隔14日。每种重组腺病毒的滴度为108.5TCID50/ml，等比例混合，每种病毒取0.1ml，混合后直接进行免疫；每种重组狂犬病病毒的滴度为108.0TCID50/ml，等比例混合，每种取0.1ml，混合后直接使用进行免疫。共免疫5头猪。
不免疫攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后14日，免疫猪连同不免疫攻毒对照猪每头口服103.0TCID50/2mlASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图25所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡。免疫组5头猪全部健活。
实施例7、重组腺病毒和重组狂犬病病毒的免疫和攻毒试验
ASFV MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组腺病毒和重组狂犬病病毒的免疫和攻毒试验如下：
实验组：rAdv-MGF 110-9L、rAdv-MGF 110-5L-6L、rAdv-B119L、rAdv-DP96R、rAdv-I329L、rAdv-E199L、rAdv-M448R、rAdv-MGF 505-7R、rAdv-A137R基因重组腺病毒和SRV9-MGF 110-5L-6L、SRV9-B119L、SRV9-DP96R、SRV9-I329R、SRV9-E199L、SRV9-M448R、SRV9-MGF505-7R、SRV9-A137R基因重组狂犬病病毒两组重组病毒组合，两组疫苗组合先（重组腺病毒）后（重组狂犬病病毒）肌肉注射猪颈部肌肉，间隔14日。每种重组腺病毒的滴度为108.5TCID50/ml，等比例混合，每种病毒取0.1ml，混合后直接进行免疫；每种重组狂犬病病毒的滴度为108.0TCID50/ml，等比例混合，每种取0.1ml，混合后直接使用进行免疫。共免疫5头猪。
不免疫攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后14日，免疫猪连同不免疫攻毒对照猪每头口服103.0TCID50/2mlASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图26所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡。免疫组5头猪全部健活。
实施例8、重组PRRSV和重组PRV的免疫和攻毒试验
ASFV MGF 110-9L、MGF 110-5L-6L、B119L、DP96R、I329L、MGF 505-5R、B438L、O61R、E199L、M448R、MGF 505-7R、A137R、I177L、I226R、DP71L、K196R基因重组PRRSV和重组PRV的免疫和攻毒试验
1、免疫
实验组：基因重组PRRSVs：PRRSV-MGF 110-5L-6L、PRRSV-B119L、PRRSV-DP96R、PRRSV-I329L、PRRSV-MGF 505-5R、PRRSV-I226R、PRRSV-B438L、PRRSV-E199L、PRRSV-K196R和基因重组PRVs：PRV-MGF 110-5L-6L、PRV-B119L、PRV-DP96R、PRV-I329L、PRV-MGF 505-5R、PRV-B438L、PRV-O61R、PRV-E199L、PRV-K196R两组重组病毒组合，每种重组PRRSV的滴度为105.5TCID50/ml，等比例混合，每种病毒0.1ml，混合后直接使用；每种重组PRV的滴度为106.5TCID50/ml，等比例混合，每种重组病毒0.1ml，混合后冻干。两组疫苗组合先（重组PRRSV）后（重组PRV）肌肉注射猪颈部肌肉，间隔14日。共免疫5头猪。
不免疫攻毒对照组：以不注射任何病毒作为攻毒对照，每组5头。
按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后14日，免疫猪连同不免疫攻毒对照猪每头口服103.0TCID50/2mlASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图27所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡。死亡猪检测为ASFV阳性。免疫组5头猪全部健活。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种非洲猪瘟病毒ASFV基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgttggtga tcttcttggg aattcttggc cttctggcca gccaggtttc aagtcagctc 60
gttggacaac ttcgtccaac agaggagcct ccagaggaag aactcgaata ctggtgtgcc 120
tacatggaaa gttgccaatt ttgctgggac tgccaagacg gcacttgtat aaacaaaata 180
gatgggtcag taatttacaa gaatgagtat gtgaaatcat gtctggtttc ccgttggctg 240
gataaatgta tgtatgattt agataagggt atctaccata ccatgaattg caaccaggtc 300
ttagggctac ctaatcaacc agctggacaa cttcatccaa cggataatcc tccacaagaa 360
gaacttgaat actggtgcac ttatacagaa aactgcaagt tttgctggaa ttgtcaaaat 420
ggcctttgtg agggcaaatt ggagaataca acaattcttg aaaatgagta tgtgcaatca 480
tgtatagttt cccgctggct aaataaatgt atgtatgatc taggacaggg gattcaccat 540
gtaatggcct gttctgaacc aaagccctgg aatccttaca aaatcttaaa gagagagtgg 600
aaagaaaata atagttaa 618
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atgttgcatt ggggacctaa atactggcga tccttgcatc tatatgctat ctttttttca 60
gacgctccta gctggaaaga aaaatatgaa gccatccaat ggatactgaa ctttatcgag 120
tctctgccat gcaccaggtg ccagcaccac gccttttcgt atcttacaaa aaatcccttg 180
acattaaaca actcggagga ctttcagtac tggaccttcg cgttccataa caacgtaaat 240
aaccggctta ataaaaaaat aatttcttgg tcagagtata aaaatattta tgaacaatca 300
atccttaaaa caatagaata tgggaaaacc gactttattg gagcctggtc atctctataa 360
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atgtctacac atgattgttc tctaaaagag aaaccggttg atatgaacga tatatctgag 60
aaatcagttg tcgtggataa tgcacccgag aaaccagctg gagcgaatca tatacctgag 120
aagtcggccc gcgaaatgac atcatcagaa tggattgctg aatattggaa aggtataaaa 180
cgtggaaatg acgtgccatg ttgttgtcca agaaaaatga ccagtgcaga caaaaagttt 240
tcagtatttg gtaagggatc cctaatgcgc tccatccaga agaataatta a 291
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atgtatcatg attatgcttc aaagctgtta gccgattata ggtcagatcc acctctttgg 60
gaaagcgatt tgccgcgtca taaccggtat tctgataata tactaaattc ccggtactgc 120
ggcaacaaaa atggagctgc gcctgtatac aatgaataca ctaatagtcc tgaaaaggct 180
gaaaagggat tgcaactcag tgatctacgt aacttttctt ttatgctgaa ccctcagcac 240
aaaaacattg gttacggcga tgcgcaagat ctggagccgt acagctccat tccaaaaaat 300
aaacttttta atcattttaa aaatcatcgt cctgcttttt caacccatac ggaaaaccta 360
attaggcgca atgttgttcg tacggaaaaa aaaacatttc cgcaggtggc tagcttaaag 420
ggcacacaga aaaattgtct gacccagcct tcctcattgc cttccttaaa aaacccaaaa 480
aatagttcgg ttccttctac gaggttcagc gagcacacaa aatttttttc gtacgaggat 540
cttcctaaac tcagaacaaa gggtaccatt aagcatgagc agcaccttgg cgatcagatg 600
ccgggccagc actataacgg atatattccg cacaaagacg tgtacaatat tttgtgttta 660
gcgcacaatc tacctgcgtc ggtagaaaaa gggattgcag gtagaggtat tcctttagga 720
aatccacatg tcaaaccgaa catagagcag gaactcataa aatccaccag tacctacacg 780
gacgtgccga tgcttggtcc ccttccgccc aaagattcgc aacacggcag agaataccag 840
gaattttccg caaatagaca tatgctacaa gtatctaata tactacattc tgtgtttgct 900
aatcattcta taaagccaca aatcctagaa gacataccgg tactcaatgc acaactaaca 960
agcataaagc cggtaagccc atttttaaac aaagcgtatc aaacccatta tatggaaaat 1020
attgttacct tggtgccccg gtttaagagt attgccaact actcaagccc tataccgaat 1080
tattctaaaa gaaatagcgg tcaggctgaa tattttgata cctcaaagca aacaatttct 1140
agacacaata attatatacc taaatatacg ggaggaattg gagattccaa actagacagc 1200
acctttccta aagatttcaa cgcctcctcg gtaccgttaa caagcgcgga aaaggaccat 1260
tccctgcggg gagacaactc agcatgttgc atctcatcta tatctccatc attgtag 1317
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atggcacttg atggttcaag tggtggaggc tctaatgtag aaacattact tatagtagca 60
atcattgtgg ttattatggc aatcatgctt tactattttt ggtggatgcc ccgccagcaa 120
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atgtcttgca tgccagtttc cacgaaatgc aatgatattt gggtcgactt tagctgtaca 60
ggcccttcga tttccgagct gcaaaaaaag gagcccaagg cctgggccgc tattttacgc 120
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ggcaccctat gggctgaatg tgcgtttgct ccgtgtaatg gaaataaaaa tgcctataaa 300
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atattaatca ttttgattct tataattatt taccgtttga tgtcttccag tgggggtaaa 540
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ggcatttcat gcacttgtca tgacatagat tatttacaaa aaaataacat aagtattcac 240
tacaatacaa gtattttaaa gacgtttcag gacatccgta ttatccgctg cgggatgaaa 300
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atgttctccc tccaggagat ctgtcgaaag aacatctact ttctacctga ctggctcggt 60
gagcatgtga ttcagcgact aggtctgtac tgggaaaaac atggttctct tcagcgaatc 120
ggagacaact atgtacttat acaacaggac ctcatcatcc ccatcaatga agccctaaga 180
atggcagggg aggaggggaa tgatgaggtg gtacaactcc tattactatg ggagggaaac 240
attcattatg ccatcatagg agctttggag agtgaccatt atagcctaat acgtaagctc 300
tatgaccaaa tcgaagactg tcacgacatc cttcccttga ttcaagaccc aaaactcttt 360
gaaaaatgcc atgaattaga taaatcttgt aacattttat gtctcgtatt acacgccgta 420
aaaaacgata tgctttgcat tcttcaagag tataaaatgc atctaagtgg agaggatatt 480
caagtggtgt ttgaaacagc atgccgttca caaaaaaacg atattgtgtc atggatggga 540
caaaatattg caatatacaa ccccgaagtt atttttgata ttgcctttga taagatgaat 600
gtgtccttat tatctatagg gtatacgctt cttttcaatc atcatataaa taatacgaac 660
gaaaatatta attctttatt gacacaacat cttgaatggg ctgccggcat gggccttctt 720
cattttatgc tggaaacttt aaagtatggc ggggatgtaa cgataatagt cttgtctgag 780
gccgtaaaat atgaccacag aaagatttta gattattttc tccgtcgaaa aaacttgtac 840
caagaagatc ttgaagaact attattgttg gcgatacgtg cagattgttc taaaaagacc 900
ttaaacttgt tattatctta cttaaactat tccataaaca atatccgtaa aaaaatatta 960
caatgtgtaa aagaatatga aacgaccgtt attataaaaa ttttacggaa aagaaagata 1020
aatctgatag agcccatttt ggcagacttt ataggatatc atagctatac ctatatggta 1080
gattttatgc gtgagttttc catccatccg gaaaaaatga tcaaaatggc tgcacgagaa 1140
tcgagggagg acttgatcat aaaattttcc aaaaaagttt gcaaagagcc taaagataga 1200
cttcactatc tcaaaagctt agtgtatact atgcgacata aagaaggcaa acaactgtta 1260
atttatacaa tccataactt atacaaagct tgtcatctag agagtaaaga aatgtttaat 1320
ttggcacgat tttatgcacg gcataatgca gtgatccagt tcaaatcgat ttgccacgat 1380
ctctccaagc tcaatattaa tatcaaaaac ttgttgttag aatgtttagg tattgctatt 1440
aaaaaaaatt actttcaact tatcaaaaca atagaaacgg atatgcgtta tgagtaa 1497
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<213> Artificial sequence
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atggggaggc ggcgcaaaaa acggacgaac gacgcgaagc atgtccattt tgccacagcc 60
gtcgaggtgt gggaagccga cgacatcgag cgcaagggtc cctgggagca ggtggcggtc 120
gatcggttcc gcttccagcg ccggatcgcg agcgtggagg agctcctatc cgcggtgctc 180
ctgcggcaaa aaaagctact ggagcagcag taa 213
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
atgaatataa tcaggaaact taagcctgga acaattagcc ttgtgctggg acccatgttt 60
gccggcaaaa ctacgtttct tattcattgc atttacatgc tcgaacgttt ggaaaaaaaa 120
gtagtcttca taaaatctac caaaaacacc cgagacaaaa ctattaaaac acactccggt 180
atacagctac gacccaaaca atgtaaaatc atagaaagca cacagttatc tgacgtgggt 240
tctctcaccg atatccatgc agttgtcgta gatgaagcgc atttttttga cgatttaatc 300
acatgccgca cttgggcaga ggaagaaaaa attattattc ttgcgggact caatgcttcc 360
ttcgagcaga aaatgtttcc gcccatcgtt cgtatttttc cttactgcag ctgggttaag 420
tatattggcc gcacctgtat gaaatgtaac caacataatg catgctttaa tgtgcgtaag 480
aacgcagaca agacgcttat ccttgcggga ggaagtgaac tgtacgtaac atgttgtaac 540
aactgtctaa aaaatacatt tattaagcag ttgcaaccta ttaaatatta a 591
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgtcaaatg aaagttttcc cgaaacgttg gaaaacttac tttcaatgtt acagaccaaa 60
cagcaaaacg caattcagtc agaggtgatt gaatggctgc acagcttttg tgaaaccttt 120
cacttaaaaa tacactgcca taaacagttt attcctagcg gggaaaaaaa acgagctaaa 180
atacccgctc aagaaacaca gggaaacacg cagccctccc accatgtgta ccgggttgtt 240
ctctccagag cacagccagt caaagcacag gaatctctgc taacaaccat gtgcaacgga 300
ctggtgctag atgcaaacac atggacatgc ctagccattc ctccgcctgc gccctttcaa 360
caggcgaccc gccaggtcca acacttttac cgtaacaatt tctacgaagt ggttcccatc 420
caggatggca cccttctcac aatctaccac tgggatgacc ctgaatatgg cccctcctgg 480
tgcctagcaa gtacccacgg atatgatgtg agtaactact gttggatagg cgacaaaacc 540
ttcgccgagc ttgtatacga attgctgcag cagcactcta cctgcgacgt caccctggaa 600
aaaaataaaa cgcggggaac gcgtcttttc tttgataact taaatcccga ttactgctat 660
acgattggaa tccggcacca taatttacag ccgctcatct atgaccctca aaatatttgg 720
gcgattcaat ctacaaacct aaaaacgctt aaaacggtat atccagaata ctacggctat 780
ataggcattc caggaattca gagtcaagtt cctgagcttc cccagtatga tttaccttat 840
ctaatacgat cttataaaac tgctatgaat caagccaaaa atgctataaa aaatggcaaa 900
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aaaagtactt ctaatgtttt gttaaaatcg cctctgctgg tatttttaca aaaaagtgtg 1020
taccagaaaa aacacaatat ctctaacagc cagcgactag aatttattat actgcaaaac 1080
tacttgatgc agcattttcg agatcatttc attgctctat ttccgcagta catatcctat 1140
tatacgaaat accaaaacat gttgaatatg attatccata gtattgcaac taaagataaa 1200
gatcatccct ttgcaggagc cgtggtaaaa aaagtgttgg aagatattga aaacgccgaa 1260
aacattattg atcatacaac cattcaaaac tatgcccatc aaagcaagta cgccatgctt 1320
tacttgtcaa ttatttccca tttttaa 1347
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgttctccc ttcaggacct ctgtcggaag aacaccttct tccttccaag tgattttagc 60
aagcataccc tgcatttgct ggggttatac tggaaggggc atggatctat ccaaaggata 120
aagaatgatg gtgtgcttat agagcatgat cttactcttt ccatcaatga agccttaatt 180
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catagtcaaa ttcaggactg gcatgttctc ctccctttga ttcaagatcc agaaacattc 360
gaaaaatgtc atgatttaag ccttgaatgt gatctttcat gccttctcca acatgctgta 420
aaatataaca tgctttcgat tcttgttaaa tataaagagg atctactaaa tgtactattt 480
aggcaacaaa ttcaaggact atttatttta gcatgtgaaa atcggaagct tgagattctt 540
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aaccaaggac ttcatttaac ccaggtagtt cgtatggtta tgctaaatca tcactttggc 720
atggtaataa ataaaggact tttacccttt gtgctggaaa ttttaaatta tggtgggaat 780
gtaaatagag ccttatctta tgctgtcaca caaaataaaa gaaagatttt agaccatgtt 840
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Ser Ser Gln Leu Val Gly Gln Leu Arg Pro Thr Glu Glu Pro Pro Glu
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Glu Glu Leu Glu Tyr Trp Cys Ala Tyr Met Glu Ser Cys Gln Phe Cys
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Trp Asp Cys Gln Asp Gly Thr Cys Ile Asn Lys Ile Asp Gly Ser Val
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Asp Lys Cys Met Tyr Asp Leu Asp Lys Gly Ile Tyr His Thr Met Asn
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Pro Thr Asp Asn Pro Pro Gln Glu Glu Leu Glu Tyr Trp Cys Thr Tyr
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130 135 140
Gly Lys Leu Glu Asn Thr Thr Ile Leu Glu Asn Glu Tyr Val Gln Ser
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Cys Ile Val Ser Arg Trp Leu Asn Lys Cys Met Tyr Asp Leu Gly Gln
165 170 175
Gly Ile His His Val Met Ala Cys Ser Glu Pro Lys Pro Trp Asn Pro
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Tyr Lys Ile Leu Lys Arg Glu Trp Lys Glu Asn Asn Ser
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Met Leu His Trp Gly Pro Lys Tyr Trp Arg Ser Leu His Leu Tyr Ala
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Ile Phe Phe Ser Asp Ala Pro Ser Trp Lys Glu Lys Tyr Glu Ala Ile
20 25 30
Gln Trp Ile Leu Asn Phe Ile Glu Ser Leu Pro Cys Thr Arg Cys Gln
35 40 45
His His Ala Phe Ser Tyr Leu Thr Lys Asn Pro Leu Thr Leu Asn Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> Artificial sequence
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Met Ser Thr His Asp Cys Ser Leu Lys Glu Lys Pro Val Asp Met Asn
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Asp Ile Ser Glu Lys Ser Val Val Val Asp Asn Ala Pro Glu Lys Pro
20 25 30
Ala Gly Ala Asn His Ile Pro Glu Lys Ser Ala Arg Glu Met Thr Ser
35 40 45
Ser Glu Trp Ile Ala Glu Tyr Trp Lys Gly Ile Lys Arg Gly Asn Asp
50 55 60
Val Pro Cys Cys Cys Pro Arg Lys Met Thr Ser Ala Asp Lys Lys Phe
65 70 75 80
Ser Val Phe Gly Lys Gly Ser Leu Met Arg Ser Ile Gln Lys Asn Asn
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Pro Pro Leu Trp Glu Ser Asp Leu Pro Arg His Asn Arg Tyr Ser Asp
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Asn Ile Leu Asn Ser Arg Tyr Cys Gly Asn Lys Asn Gly Ala Ala Pro
35 40 45
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50 55 60
Gln Leu Ser Asp Leu Arg Asn Phe Ser Phe Met Leu Asn Pro Gln His
65 70 75 80
Lys Asn Ile Gly Tyr Gly Asp Ala Gln Asp Leu Glu Pro Tyr Ser Ser
85 90 95
Ile Pro Lys Asn Lys Leu Phe Asn His Phe Lys Asn His Arg Pro Ala
100 105 110
Phe Ser Thr His Thr Glu Asn Leu Ile Arg Arg Asn Val Val Arg Thr
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asn Ser Ser Val Pro Ser Thr Arg Phe Ser Glu His Thr Lys Phe Phe
165 170 175
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Glu Gln His Leu Gly Asp Gln Met Pro Gly Gln His Tyr Asn Gly Tyr
195 200 205
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Pro Ala Ser Val Glu Lys Gly Ile Ala Gly Arg Gly Ile Pro Leu Gly
225 230 235 240
Asn Pro His Val Lys Pro Asn Ile Glu Gln Glu Leu Ile Lys Ser Thr
245 250 255
Ser Thr Tyr Thr Asp Val Pro Met Leu Gly Pro Leu Pro Pro Lys Asp
260 265 270
Ser Gln His Gly Arg Glu Tyr Gln Glu Phe Ser Ala Asn Arg His Met
275 280 285
Leu Gln Val Ser Asn Ile Leu His Ser Val Phe Ala Asn His Ser Ile
290 295 300
Lys Pro Gln Ile Leu Glu Asp Ile Pro Val Leu Asn Ala Gln Leu Thr
305 310 315 320
Ser Ile Lys Pro Val Ser Pro Phe Leu Asn Lys Ala Tyr Gln Thr His
325 330 335
Tyr Met Glu Asn Ile Val Thr Leu Val Pro Arg Phe Lys Ser Ile Ala
340 345 350
Asn Tyr Ser Ser Pro Ile Pro Asn Tyr Ser Lys Arg Asn Ser Gly Gln
355 360 365
Ala Glu Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Gln Thr Ile Ser Arg His Asn Asn
370 375 380
Tyr Ile Pro Lys Tyr Thr Gly Gly Ile Gly Asp Ser Lys Leu Asp Ser
385 390 395 400
Thr Phe Pro Lys Asp Phe Asn Ala Ser Ser Val Pro Leu Thr Ser Ala
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Glu Lys Asp His Ser Leu Arg Gly Asp Asn Ser Ala Cys Cys Ile Ser
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Ser Ile Ser Pro Ser Leu
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Met Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asn Val Glu Thr Leu
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Leu Ile Val Ala Ile Ile Val Val Ile Met Ala Ile Met Leu Tyr Tyr
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Phe Trp Trp Met Pro Arg Gln Gln Lys Lys Cys Ser Lys Ala Glu Glu
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Cys Thr Cys Asn Asn Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Ser
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Met Ser Cys Met Pro Val Ser Thr Lys Cys Asn Asp Ile Trp Val Asp
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Phe Ser Cys Thr Gly Pro Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Pro
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Lys Ala Trp Ala Ala Ile Leu Arg Ser His Thr Asn Gln Gln Thr Ala
35 40 45
Glu Asp Asp Asn Ile Ile Gly Ser Ile Cys Asp Lys Gln Gly Leu Cys
50 55 60
Ser Lys Asp Glu Tyr Ala Tyr Ser Gln Tyr Cys Ala Cys Val Asn Ser
65 70 75 80
Gly Thr Leu Trp Ala Glu Cys Ala Phe Ala Pro Cys Asn Gly Asn Lys
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Asn Ala Tyr Lys Thr Thr Glu Gln Arg Asn Ile Leu Thr Asn Lys Gln
100 105 110
Cys Pro Ser Gly Leu Thr Ile Cys Gln Asn Ile Ala Glu Tyr Gly Gly
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Ser Gly Asn Ile Ser Asp Leu Tyr Gln Asn Phe Asn Cys Asn Ser Val
130 135 140
Ile Asn Thr Phe Leu Ile Asn Val Met Asn His Pro Phe Leu Thr Leu
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Ile Leu Ile Ile Leu Ile Leu Ile Ile Ile Tyr Arg Leu Met Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Gly Lys His Asn Asp Asp Lys Leu Pro Pro Pro Ser Leu Ile
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Met Leu Arg Val Phe Ile Phe Phe Val Phe Leu Gly Ser Gly Leu Thr
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Gly Arg Ile Lys Pro Gln Val Thr Cys Lys Tyr Phe Ile Ser Glu Asn
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Asn Thr Trp Tyr Lys Tyr Asn Val Thr Ile Leu Asn Ser Ser Ile Val
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Thr Cys His Asp Ile Asp Tyr Leu Gln Lys Asn Asn Ile Ser Ile His
65 70 75 80
Tyr Asn Thr Ser Ile Leu Lys Thr Phe Gln Asp Ile Arg Ile Ile Arg
85 90 95
Cys Gly Met Lys Asn Ile Ser Glu Ile Ala Gly Gly Phe Gly Lys Glu
100 105 110
Leu Lys Phe Leu Asp Leu Arg Tyr Asn Asp Leu Gln Val Ile Asp Tyr
115 120 125
Asn Ile Leu Arg Lys Leu Ile Arg Ser Asn Thr Pro Thr Tyr Leu Tyr
130 135 140
Tyr Asn Asn Leu Met Cys Gly Lys Arg Asn Cys Pro Leu Tyr Tyr Phe
145 150 155 160
Leu Leu Lys Gln Glu Gln Thr Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Gln Phe Phe
165 170 175
Leu Arg Arg Ile Asn Phe Ser Asn Asn Asn Thr Phe Leu Tyr His Phe
180 185 190
Leu Ser Cys Gly Asn Lys Pro Gly His Glu Phe Leu Glu Tyr Gln Thr
195 200 205
Lys Tyr Cys Arg Thr Lys Phe Pro Glu Ile Asn Ile Thr Val Asn Gln
210 215 220
Leu Ile Ala Lys Lys Asn Thr Glu Arg Tyr Lys Ser Cys Tyr Pro Leu
225 230 235 240
Val Phe Ile Ser Ile Leu Cys Ser Cys Ile Ser Phe Leu Phe Leu Phe
245 250 255
Ile Cys Leu Leu Arg Ser Ile Cys Lys Lys Tyr Ser Cys Thr Lys Gln
260 265 270
Asp Lys Ser Ser His Asn Tyr Ile Pro Leu Ile Pro Ser Tyr Thr Phe
275 280 285
Ser Leu Lys Lys His Arg His Pro Glu Thr Ala Val Val Glu Asp His
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Thr Thr Ser Ala Asn Ser Pro Ile Val Tyr Ile Pro Thr Thr Glu Glu
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Lys Lys Val Ser Cys Ser Arg Arg Lys
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Met Phe Ser Leu Gln Glu Ile Cys Arg Lys Asn Ile Tyr Phe Leu Pro
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Asp Trp Leu Gly Glu His Val Ile Gln Arg Leu Gly Leu Tyr Trp Glu
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Lys His Gly Ser Leu Gln Arg Ile Gly Asp Asn Tyr Val Leu Ile Gln
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Gln Asp Leu Ile Ile Pro Ile Asn Glu Ala Leu Arg Met Ala Gly Glu
50 55 60
Glu Gly Asn Asp Glu Val Val Gln Leu Leu Leu Leu Trp Glu Gly Asn
65 70 75 80
Ile His Tyr Ala Ile Ile Gly Ala Leu Glu Ser Asp His Tyr Ser Leu
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Ile Arg Lys Leu Tyr Asp Gln Ile Glu Asp Cys His Asp Ile Leu Pro
100 105 110
Leu Ile Gln Asp Pro Lys Leu Phe Glu Lys Cys His Glu Leu Asp Lys
115 120 125
Ser Cys Asn Ile Leu Cys Leu Val Leu His Ala Val Lys Asn Asp Met
130 135 140
Leu Cys Ile Leu Gln Glu Tyr Lys Met His Leu Ser Gly Glu Asp Ile
145 150 155 160
Gln Val Val Phe Glu Thr Ala Cys Arg Ser Gln Lys Asn Asp Ile Val
165 170 175
Ser Trp Met Gly Gln Asn Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Glu Val Ile Phe
180 185 190
Asp Ile Ala Phe Asp Lys Met Asn Val Ser Leu Leu Ser Ile Gly Tyr
195 200 205
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210 215 220
Ser Leu Leu Thr Gln His Leu Glu Trp Ala Ala Gly Met Gly Leu Leu
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His Phe Met Leu Glu Thr Leu Lys Tyr Gly Gly Asp Val Thr Ile Ile
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Val Leu Ser Glu Ala Val Lys Tyr Asp His Arg Lys Ile Leu Asp Tyr
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Leu Leu Ala Ile Arg Ala Asp Cys Ser Lys Lys Thr Leu Asn Leu Leu
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Lys Arg Lys Ile Asn Leu Ile Glu Pro Ile Leu Ala Asp Phe Ile Gly
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Met Gly Arg Arg Arg Lys Lys Arg Thr Asn Asp Ala Lys His Val His
1 5 10 15
Phe Ala Thr Ala Val Glu Val Trp Glu Ala Asp Asp Ile Glu Arg Lys
20 25 30
Gly Pro Trp Glu Gln Val Ala Val Asp Arg Phe Arg Phe Gln Arg Arg
35 40 45
Ile Ala Ser Val Glu Glu Leu Leu Ser Ala Val Leu Leu Arg Gln Lys
50 55 60
Lys Leu Leu Glu Gln Gln
65 70
<210> 26
<211> 196
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 26
Met Asn Ile Ile Arg Lys Leu Lys Pro Gly Thr Ile Ser Leu Val Leu
1 5 10 15
Gly Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Phe Leu Ile His Cys Ile Tyr
20 25 30
Met Leu Glu Arg Leu Glu Lys Lys Val Val Phe Ile Lys Ser Thr Lys
35 40 45
Asn Thr Arg Asp Lys Thr Ile Lys Thr His Ser Gly Ile Gln Leu Arg
50 55 60
Pro Lys Gln Cys Lys Ile Ile Glu Ser Thr Gln Leu Ser Asp Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Thr Asp Ile His Ala Val Val Val Asp Glu Ala His Phe Phe
85 90 95
Asp Asp Leu Ile Thr Cys Arg Thr Trp Ala Glu Glu Glu Lys Ile Ile
100 105 110
Ile Leu Ala Gly Leu Asn Ala Ser Phe Glu Gln Lys Met Phe Pro Pro
115 120 125
Ile Val Arg Ile Phe Pro Tyr Cys Ser Trp Val Lys Tyr Ile Gly Arg
130 135 140
Thr Cys Met Lys Cys Asn Gln His Asn Ala Cys Phe Asn Val Arg Lys
145 150 155 160
Asn Ala Asp Lys Thr Leu Ile Leu Ala Gly Gly Ser Glu Leu Tyr Val
165 170 175
Thr Cys Cys Asn Asn Cys Leu Lys Asn Thr Phe Ile Lys Gln Leu Gln
180 185 190
Pro Ile Lys Tyr
195
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<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 27
Met Ser Asn Glu Ser Phe Pro Glu Thr Leu Glu Asn Leu Leu Ser Met
1 5 10 15
Leu Gln Thr Lys Gln Gln Asn Ala Ile Gln Ser Glu Val Ile Glu Trp
20 25 30
Leu His Ser Phe Cys Glu Thr Phe His Leu Lys Ile His Cys His Lys
35 40 45
Gln Phe Ile Pro Ser Gly Glu Lys Lys Arg Ala Lys Ile Pro Ala Gln
50 55 60
Glu Thr Gln Gly Asn Thr Gln Pro Ser His His Val Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Lys Ala Gln Glu Ser Leu Leu Thr Thr
85 90 95
Met Cys Asn Gly Leu Val Leu Asp Ala Asn Thr Trp Thr Cys Leu Ala
100 105 110
Ile Pro Pro Pro Ala Pro Phe Gln Gln Ala Thr Arg Gln Val Gln His
115 120 125
Phe Tyr Arg Asn Asn Phe Tyr Glu Val Val Pro Ile Gln Asp Gly Thr
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Tyr His Trp Asp Asp Pro Glu Tyr Gly Pro Ser Trp
145 150 155 160
Cys Leu Ala Ser Thr His Gly Tyr Asp Val Ser Asn Tyr Cys Trp Ile
165 170 175
Gly Asp Lys Thr Phe Ala Glu Leu Val Tyr Glu Leu Leu Gln Gln His
180 185 190
Ser Thr Cys Asp Val Thr Leu Glu Lys Asn Lys Thr Arg Gly Thr Arg
195 200 205
Leu Phe Phe Asp Asn Leu Asn Pro Asp Tyr Cys Tyr Thr Ile Gly Ile
210 215 220
Arg His His Asn Leu Gln Pro Leu Ile Tyr Asp Pro Gln Asn Ile Trp
225 230 235 240
Ala Ile Gln Ser Thr Asn Leu Lys Thr Leu Lys Thr Val Tyr Pro Glu
245 250 255
Tyr Tyr Gly Tyr Ile Gly Ile Pro Gly Ile Gln Ser Gln Val Pro Glu
260 265 270
Leu Pro Gln Tyr Asp Leu Pro Tyr Leu Ile Arg Ser Tyr Lys Thr Ala
275 280 285
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290 295 300
Tyr Phe Asn Tyr Gly Tyr Leu Leu Ile Ser Arg Ala Pro Ala Ile Thr
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ser Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Leu Leu Val Phe Leu
325 330 335
Gln Lys Ser Val Tyr Gln Lys Lys His Asn Ile Ser Asn Ser Gln Arg
340 345 350
Leu Glu Phe Ile Ile Leu Gln Asn Tyr Leu Met Gln His Phe Arg Asp
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp His Pro Phe Ala Gly Ala Val Val Lys Lys Val Leu Glu Asp Ile
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His Gln Ser Lys Tyr Ala Met Leu Tyr Leu Ser Ile Ile Ser His Phe
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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Met Phe Ser Leu Gln Asp Leu Cys Arg Lys Asn Thr Phe Phe Leu Pro
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Ser Asp Phe Ser Lys His Thr Leu His Leu Leu Gly Leu Tyr Trp Lys
20 25 30
Gly His Gly Ser Ile Gln Arg Ile Lys Asn Asp Gly Val Leu Ile Glu
35 40 45
His Asp Leu Thr Leu Ser Ile Asn Glu Ala Leu Ile Leu Ala Gly Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Leu His Tyr Ala Ile Ile Gly Ala Leu Arg Thr Glu Asn Tyr Asn Leu
85 90 95
Val Cys Glu Tyr His Ser Gln Ile Gln Asp Trp His Val Leu Leu Pro
100 105 110
Leu Ile Gln Asp Pro Glu Thr Phe Glu Lys Cys His Asp Leu Ser Leu
115 120 125
Glu Cys Asp Leu Ser Cys Leu Leu Gln His Ala Val Lys Tyr Asn Met
130 135 140
Leu Ser Ile Leu Val Lys Tyr Lys Glu Asp Leu Leu Asn Val Leu Phe
145 150 155 160
Arg Gln Gln Ile Gln Gly Leu Phe Ile Leu Ala Cys Glu Asn Arg Lys
165 170 175
Leu Glu Ile Leu Thr Trp Met Gly Gln Asn Leu Pro Ile Pro Asp Pro
180 185 190
Glu Pro Ile Phe Ser Ile Ala Val Val Thr Lys Asp Leu Glu Met Phe
195 200 205
Ser Leu Gly Tyr Lys Ile Val Phe Glu Tyr Met Glu Asn Gln Gly Leu
210 215 220
His Leu Thr Gln Val Val Arg Met Val Met Leu Asn His His Phe Gly
225 230 235 240
Met Val Ile Asn Lys Gly Leu Leu Pro Phe Val Leu Glu Ile Leu Asn
245 250 255
Tyr Gly Gly Asn Val Asn Arg Ala Leu Ser Tyr Ala Val Thr Gln Asn
260 265 270
Lys Arg Lys Ile Leu Asp His Val Val Arg Gln Lys Asn Ile Pro His
275 280 285
Lys Thr Ile Glu Arg Met Leu His Leu Ala Val Lys Lys His Ala Pro
290 295 300
Arg Lys Thr Leu Asn Leu Leu Leu Ser Tyr Ile Asn Tyr Lys Val Lys
305 310 315 320
Asn Val Lys Lys Leu Leu Glu His Val Val Lys Tyr Asn Ser Thr Leu
325 330 335
Val Ile Arg Leu Leu Leu Glu Lys Lys Lys Asn Leu Leu Asp Ala Thr
340 345 350
Leu Thr Arg Tyr Val Lys Asp Ser Thr Tyr Phe Gln Val Lys Glu Phe
355 360 365
Met Gln Asp Phe Ser Ile Ser Pro Glu Lys Phe Ile Lys Ile Ala Val
370 375 380
Arg Glu Lys Arg Asn Val Leu Ile Lys Gly Ile Ser Glu Asp Ile Trp
385 390 395 400
Glu Asn Pro Ala Glu Arg Ile Arg Asn Leu Lys Gln Ile Val Cys Thr
405 410 415
Ile Lys Tyr Glu Ser Gly Arg Gln Phe Leu Ile Asn Ile Ile His Thr
420 425 430
Ile Tyr Gln Ser Tyr Ser Leu Lys Pro Glu Glu Ile Leu Lys Leu Ala
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450 455 460
Lys Tyr Leu Trp Leu Asn Arg Arg Thr Glu Ser Lys Lys Leu Phe Leu
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Glu Cys Leu Glu Ile Ala Asp Lys Lys Glu Phe Pro Asp Ile Lys Ser
485 490 495
Ile Val Ser Glu Tyr Ile Asn Tyr Leu Phe Thr Ala Gly Ala Ile Thr
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Met Glu Ala Val Leu Thr Lys Leu Asp Gln Glu Glu Lys Lys Ala Leu
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Gln Asn Phe His Arg Cys Ala Trp Glu Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asn
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Ile Gly Lys Met Asn Ile Lys Glu Gly
130 135
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Met Tyr Glu Ile Ile Leu Ala Ile Ile Ile Ile Leu Leu Thr Ile Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Lys Leu Gln Pro Leu Thr Thr Lys Ser Asn Val Thr Ser Gly Asp
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100 105 110
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Lys Phe Asn Leu Ile Ala Ile Thr Gly Lys Leu Gly Phe Tyr Thr Asp
130 135 140
Pro Pro Ser His Leu Ile Ile Met Pro Leu Lys Phe Phe Pro Val His
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Lys Phe Ser Lys Asn Glu Pro Asn Lys Lys Gln Lys Arg Phe Ile Tyr
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Phe
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 31
Met Lys Met Glu Thr Phe Leu Val Cys Leu Phe His Asn Ala Asp Gly
1 5 10 15
Leu His Gln Gln Ile Gln Glu Ile Leu Tyr Leu Leu Arg Met His Ile
20 25 30
Tyr Glu Thr Asn Leu Tyr Leu Lys Gln Glu Leu Ser Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Pro Asn Arg Gln Leu Ser Phe Val Leu Leu Met Pro Leu Ser Leu Leu
50 55 60
Arg Asn Trp Asp Asp Ile Glu Tyr Leu Thr Asp Val Val Asp Asp Lys
65 70 75 80
Gln Thr Leu His Tyr Ala Ala Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Val Leu His
85 90 95
Leu Ser Met Phe Gln Lys Leu Thr Lys Pro Tyr Phe Leu Leu Ala Val
100 105 110
Lys Arg Val Ser Glu Lys Leu Asn Lys Lys Gln Arg His Ser Phe Tyr
115 120 125
Glu Val Leu Val Thr Ser Glu Thr Leu Asn Asn Tyr Glu Asn Leu Ser
130 135 140
Lys Asn Ile Leu Asn Thr Leu Met Phe Ala Val Arg Tyr Val Phe Lys
145 150 155 160
Pro Thr Pro Asn Tyr Ser Glu Ile Leu Ala Glu Leu Glu Lys Lys Asn
165 170 175
Lys Ile His His Ile Ile Phe Asn Met Val Ile Thr Asp Phe Ala Gln
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Ile Arg Glu Gln Gln Met Asp Lys His Leu Cys Glu Thr Asn Asn Glu
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Leu Arg Gln Glu Cys Lys Glu Thr Ile Phe Asp Leu Lys Val Val Gly
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Asn Val
225
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 32
Met Lys Val Ile Val Phe Leu Leu Val Leu Ala Val Met Gln Pro Val
1 5 10 15
Ile Gln Ser Gln Ser Phe Pro Gly Thr Gly Glu Leu Pro Met Thr Arg
20 25 30
Arg Pro Pro Lys Arg Glu Leu Glu Tyr Trp Cys Thr Tyr Ala Lys Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Ser Arg Tyr Asn Glu Arg Cys Ser Tyr Phe Thr Asp Ser Arg
85 90 95
Ile Arg Arg Phe His Ile Met Ser Cys Thr Asn Pro Thr Tyr Tyr Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ile Ser Tyr Val Arg Lys Gln Tyr Ser Arg Met Arg Met Gln Ala Ala
145 150 155 160
Thr Arg Leu Leu Ile Phe Leu Gly Phe Tyr Val Leu Leu Gly Ile Leu
165 170 175
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180 185 190
Gln Met Arg Arg Pro Pro Glu Arg Asp Leu Lys Phe Trp Cys Thr Tyr
195 200 205
Ala Lys His Cys Asp Phe Cys Trp Thr Cys Lys Asp Gly Met Cys Lys
210 215 220
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245 250 255
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275 280 285
Asp Leu
290
<210> 33
<211> 15541
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
tatacgtcat ctgatgagtc cgtgaggacg aaactatagg aaaggaattc ctatagtcat 60
gacgtatagg tgttggctct atgccacggc atttgtattg tcaggagctg tgaccattgg 120
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aggggtctgt ccctaacacc ttgcttccgg agttgcactg ctttacggtc tctccacccc 240
tttaaccatg tctgggatac ttgatcggtg cacgtgtacc cccaatgcca gggtgtttgt 300
ggcggagggc caggtctact gcacacgatg tctcagtgca cggtctctcc ttcctctgaa 360
tctccaagtt cctgagcttg gggtgctggg tctattttat aggcccgaag agccactccg 420
gtggacgttg ccacgtgcat tccccactgt cgagtgctcc cccgccgggg cctgctggct 480
ttctgcgatc tttccgattg cacgaatgac tagtggaaac ctgaactttc aacaaagaat 540
ggtgcgggtc gcagctgaaa tctacagagc cggccaactc acccctacag ttctaaagac 600
tctacaagtt tatgaacgag gttgtcgttg gtaccccatt gtcgggcccg tccctggggt 660
gggcgtttac gccaactccc tgcatgtgag tgacaaacct ttcccgggag ctactcatgt 720
gttaaccaac ttgccgctcc cgcagaggcc caaacctgag gacttttgcc cttttgagtg 780
tgctatggct gacgtctatg acattggtcg tggcgccgtc atgtatgtgg ccggaggaaa 840
ggtctcttgg gcccctcgtg gtgggaatga agtgaaattt gaacctgtcc ccaaggagtt 900
gaagttggtt gcgaaccgac tccacacctc cttcccgccc catcacgtag tggacatgtc 960
caagtttacc ctcatgaccc ctgggagtgg tgtctccatg cgggttgagt accaacacgg 1020
ctgcctcccc gctgacactg tccctgaagg aaactgctgg tggcgcttgt ttgactcgct 1080
cccaccggaa gttcagtaca aagaaattcg ccatgctaac caatttggct atcaaaccaa 1140
gcatggtgtc cctggcaagt acctacagcg gaggctgcaa gttaatggtc ttcgagcagt 1200
gaccgacaca catggaccta tcgtcataca gtacttctct gttaaggaga gttggatccg 1260
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ggttgagccc aatacgtcac cactggctgg aaaggatgag aagattttcc ggtttggcag 1380
tcataagtgg tacggtgccg gaaagagagc aaggaaaaca cgctctggtg cgactactat 1440
ggtcgctcat cacgcttcgt ccgctcatga aacccggcag gccacgaagc acgagggtgc 1500
cggcgctaac aaggctgagc atctcaagcg ctactctccg cctgccgaag ggaactgtgg 1560
ttggcactgc atttccgcca tcgccaaccg gatggtgaat tccaactttg agaccaccct 1620
tcctgaaaga gtaaggcctt cagatgactg ggccactgac gaggatcttg tgaacaccat 1680
ccaaatcctc aggctccctg cggccctgga caggaacggc gcttgcggta gcgccaagta 1740
cgtgcttaaa ctggagggtg agcattggac tgtctctgtg atccctggga tgtcccctac 1800
tttgctcccc cttgaatgtg ttcagggttg ttgtgagcat aagggcggtc ttgtttcccc 1860
ggatgcggtc gaaatttccg gatttgatcc tgcctgcctt gaccgactgg ctaaggtaat 1920
gcacttgcct agcagtacca tcccagccgc tctggccgga ttgtccgacg actccaaccg 1980
tccggtttcc ccggccgcta ctacgtggac tgtttcgcaa ttctatgctc gtcatagagg 2040
aggagatcat catgaccagg tgtgcttggg gaaaatcatc agcctttgtc aagttattga 2100
ggattgctgc tgccatcaga ataaaaccaa ccgggctact ccggaagagg tcgcggcaaa 2160
gattgatcag tacctccgtg gcgcaacaag tcttgaggaa tgcttggcca aacttgagag 2220
agtttccccg ccgagcgctg cggacacctc ttttgattgg aatgttgtgc ttcctggggt 2280
tgaggcggcg aatcagacaa ccgaccaacc tcacgtcaac tcatgctgca ccctggtccc 2340
tcccgtgact caagagcctt tgggcaagga ctcggtccct ctgaccgcct tctcactgtc 2400
caattgctat taccctgcac aaggtgacga ggttcatcac cgtgagaggt taaattccgt 2460
actctctaag ttggaagagg ttgtcctgga agaatatggg ctcatgtcca ctggacttgg 2520
cccgcgaccc gtgctgccga gcgggctcga cgagcttaaa gaccagatgg aggaggatct 2580
gctaaaacta accaacaccc aggcgacttc agaaatgatg gcctgggcgg ctgagcaggt 2640
cgatttaaaa gcttgggtca aaagctaccc gcggtggaca ccaccacccc ctccaccaag 2700
agttcaacct agaagaacaa agtctgtcaa aagcttgcca gagggcaagc ctgtccctgc 2760
tccgcgcagg aaggtcagat ccgattgcgg cagcccggtt ttgatgggcg acaatgtccc 2820
caacggttcg gaagaaactg tcggtggtcc cctcaatttt ccgacaccat ccgagccgat 2880
gacacctatg agtgagcccg tacttgtgcc cgcgtcgcga cgtgtcccca agctgatgac 2940
acctttgagt gggtcggcac cagttcctgc accgcgtaga actgtgacaa caacgctgac 3000
gcaccaggat gagcctctgg atttgtctgt gtcctcacag acggaatatg aggctttccc 3060
cctagcacca tcgcagaaca tgggcatcct ggaggcgagg gggcaagaag ttgagggagt 3120
cctgagtgaa atctcggata tactaaatga caccaaccct gcacctgtgt catcaagcag 3180
ctccctgtca agtgttaaga tcacacgccc aaaatactca gctcaagcca tcatcgactc 3240
tggcgggcct tgcagtgggc atctccaaaa ggaaaaagaa gcatgcctca gcatcatgcg 3300
tgaggcttgt gatgcgtcca agcttggtga tcctgctacg caggagtggc tctctcgcat 3360
gtgggatagg gttgacatgc tgacttggcg caacacgtct gcttaccagg cgtttcgcat 3420
cttaaatggc atgtttgagt ttctcccaaa gatgattctc gagacaccgc cgccccaccc 3480
gtgcgggttt gtgatgttac ctcgcacgcc cgcaccttcc gtgagtgcag agagtgacct 3540
caccattggt tcagtggcca ccgaggatgt tccacgcatc ctcgggaaaa taggagacac 3600
tgacgagctg cttgaccggg gtccctcggc tccctccaag ggagaaccgg tctgtgacca 3660
acctgccaaa gatccccgga tgtcgccacg ggagtctgac gagagcatga tagctccgcc 3720
cgcagataca ggtggtgtcg gctcattcac tgatttgccg tcttcagatg gtgtggatgt 3780
ggacgggggg gggccgttaa gaacggtaaa aacaaaagca ggaaggctct tagaccaact 3840
gagctgccag gtttttagcc tcgtttccca tctccctatt ttcttctcac acctcttcaa 3900
atctgacagt ggttattctc cgggtgattg gggttttgca gcttttactc tattttgcct 3960
ctttctatgt tacagttacc cattcttcgg ttttgctccc ctcttgggtg tattttctgg 4020
gtcttctcgg cgtgtgcgaa tgggggtttt tggctgctgg ttggcttttg ctgttggtct 4080
gttcaagcct gtgtccgacc cagtcggcac tgcttgtgag tttgactcgc cagagtgtag 4140
gaacgtcctt cattcttttg agcttctcaa accttgggac cctgtccgca gccttgttgt 4200
gggccccgtc ggtctcggcc ttgccattct tggcaggtta ctgggcgggg cacgctacat 4260
ctggcacttt ttgcttaggc ttggcattgt tgcagactgt atcttggctg gagcttatgt 4320
gctttctcaa ggtaggtgta aaaagtgctg gggatcttgt gtaagaactg ctcctaatga 4380
gatcgccttc aacgtgttcc cttttacacg tgcgaccagg ttgtcactca tcgacctgtg 4440
cgatcggttc tgcgcaccaa aaggcatgga ccccattttt ctcgccactg ggtggcgtgg 4500
gtgctggacc ggccggagtc ccattgagca accttctgaa aaacccatcg cgttcgccca 4560
gctggatgag aagaggatta cggctagaac tgtggtcact cagccttatg atcccaacca 4620
ggccgtaaag tgcttgcggg tattacaggc gggcggggcg atggtggccg aggcagtccc 4680
aaaagtggtc aaagtttccg ccattccatt ccgagctcct ttctttcccg ctggagtgaa 4740
agttgatcct gagtgcagaa tcgtggttga tcccgatact tttactacag ccctccggtc 4800
tggctattcc accgcgaacc tcgtccttgg tacgggggac tttgcccagc tgaatggact 4860
aaagatcagg caaatttcca agccttcagg gggaggccca cacctcattg ctgccttgca 4920
tgttgcctgc tcgatggcgt tacacatgct tgctggtgtt tatgtaactg cagtggggtc 4980
ctgcggtacc ggtactaacg atccgtggtg cactaacccg tttgccgtcc ctggctacgg 5040
acctggctct ctttgcacgt ctagattgtg catctcccaa cacggcctca ccttgccctt 5100
gacagcactt gtggcgggat tcggccttca agatattgcc ttggtcgttt tgatttttgt 5160
ctccatcgga ggcatggctc ataggttgag ttgtaaggct gacatgttgt gcatcttact 5220
cgcaatcgct agttatgttt gggtacctct tacctggttg ctttgtgtgt ttccttgttg 5280
gttgcgctgg ttctctttgc accccctcac catcctgtgg ttggtgtttt tcttgatttc 5340
tgtaaatata ccctcgggaa tcttggccgt ggtgttattg gtttctctct ggcttctagg 5400
tcgttatact aacattgctg gtctcgtcac cccctatgac attcatcatt acaccagtgg 5460
cccccgcggt gttgccgcct tggccaccgc accagatgga acctacttgg ctgccgtccg 5520
ccgtgctgcg ctgactggtc gtaccatgct gttcaccccg tctcagctcg ggtccctcct 5580
tgagggcgct ttcagaactc aaaagccctc actgaacacc gtcaatgtgg tcgggtcctc 5640
catgggctct ggcggagtgt tcactattga cgggaaaatc aagtgcgtga ctgccgcaca 5700
tgtccttacg ggtaactcag ctagggtttc cggggtcggc ttcaatcaaa tgcttgactt 5760
tgatgtaaaa ggggacttcg ccatagctga ttgcccgaat tggcaagggg ttgctcccaa 5820
ggcccagttc tgcgaggatg ggtggactgg tcgcgcctat tggctgacat cctctggcgt 5880
tgaacccggt gttattggga atgggttcgc cttctgcttc accgcgtgtg gcgattctgg 5940
atccccagtg attaccgaag ccggtgagct tgtcggcgtt cacacaggat caaacaaaca 6000
aggaggaggc attgtcacgc gcccctcagg ccagttttgt aatgtgaagc ccatcaagct 6060
gagcgagttg agtgaattct tcgctggacc taaggtcccg ctcggtgatg tgaaaattgg 6120
cagtcacata attaaagaca catgcgaggt gccttcagat ctttgtgccc tgcttgctgc 6180
caaacccgaa ctggaaggag gcctttccac agttcaactt ctgtgtgtgt ttttcctcct 6240
gtggagaatg atggggcatg cctggacgcc cttggttgct gtggggtttt tcatcctgaa 6300
tgagattctc ccagctgtcc tggtccggag tgttttctcc tttgggatgt ttgtgctatc 6360
ttggctcaca ccatggtctg cgcaagtcct gatgatcagg cttctgacag cagcccttaa 6420
cagaaacaga tggtctcttg gtttttacag ccttggtgca gtaaccagtt ttgtcgcaga 6480
tcttgcggta actcaagggc atccgttaca ggtggtaatg aacttaagca cctatgcctt 6540
cctgccccgg atgatggttg tgacctcgcc agtcccagtg atcgcgtgtg gtgttgtgca 6600
cctccttgcc ataattttgt acttgtttaa gtaccgctgc cttcacaatg tccttgttgg 6660
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aagaattgaa cttgctcagt tggtacaggt tgataaggtc cgaggcacca tggccaaact 6960
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a 15541
<210> 34
<211> 6289
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
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