具体实施方式

实施例1 重组抗菌肽TrSub基因的易错PCR

以GenBank: ACE07988.1中公布的抗菌肽Sublancin168的氨基酸序列为原始序列，使用DNAMAN软件翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成。对该人工合成的片段进行易错PCR反应，使用的PCR扩增酶为PrimeSTAR^®高保真扩增酶，PCR反应体系（50 μL）为：5 × PrimeSTAR^® Buffer 10 μL；dNTP 4 μL；PrimeSTAR^® 0.5 μL；pf 2 μL；pr2 μL；合成模板 1μL；ddH₂O 30.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min预变性；95 ℃ 30 sec变性、56 ℃ 30 sec退火、72 ℃ 1 min延伸、35循环；72 ℃ 10 min总延伸；4℃。PCR反应完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测抗菌肽TrSub的基因扩增目的条带，如图1所示。将验证的PCR产物进行模板消化，使用的酶为DpnI酶，消化体系为DpnI 1 μL、Fast Digest Buffer 5 μL，于37 ℃反应2 h。PCR消化产物使用Cycle Pure Kit PCR纯化试剂盒进行回收纯化，回收得到的产物为抗菌肽Sublancin168易错PCR基因片段。

实施例2 抗菌肽Sublancin168基因的易错PCR产物插入木霉Tu6表达载体，构建重组表达载体Sub168-PCBHG

使用木霉Tu6载体的线性化引物对F：5’-gctccgtggcgaaagcct-3’和R：5’-agcacgagctgtggccaag-3’通过PCR反应对其进行线性化，PCR使用的酶为Phanta^® Super-Fidelity DNA Polymerase，PCR反应体系（50 μL）为：5 × SF Buffer 25 μL；dNTP 1 μL；Phanta^® 0.5 μL；pf 2 μL；pr 2 μL；载体PCBHG1μL；ddH₂O μL；18.5 μL。PCR反应条件为：95℃ 3 min预变性；95 ℃ 30 sec变性、58 ℃ 30 sec退火、72 ℃ 8 min延伸、35循环；72 ℃10 min总延伸；4℃。经核酸电泳检验后，对其进行模板消化及使用Cycle Pure Kit PCR纯化试剂盒回收纯化，获得线性化载体回收片段。将实施例1中回收片段与线性化载体进行体外同源重组连接，使用的同源重组连接酶为Exnase Ⅱ，连接体系（50 μL）为：CE Ⅱ Buffer2 μL；Exnase Ⅱ 0.5 μL；线性化载体0.5 μL；Sublancin168易错PCR基因1 μL；ddH₂O 1 μL。连接条件为：37 ℃，30 min。之后将同源重组连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布后于37 ℃培养14-16 h，挑取单菌落进行菌落PCR及测序验证，比对后完成重组表达载体Sub168-PCBHG的构建，其组成示意如图2所示。

实施例3 抗菌肽TrSub的木霉重组表达载体的转化

将里氏木霉宿主菌株在PDA+U固体培养基平板上传代培养，条件为30 ℃5-6天。将成熟的里氏木霉宿主菌株接种至YEG+U培养基，30 ℃、180 rpm的条件下培养20 h作为表达宿主。过滤培养成熟的菌液，收集滤布上的菌丝体至灭菌的锥形瓶中，加入裂解酶后在30℃、90 rpm的条件下裂解2 h，期间每间隔30 min于无菌工作台中取样，使用血球计数板在显微镜下观察裂解生成原生质体的形态和数目，直至达到10⁸ CFU/mL时停止裂解。锥形瓶中的裂解液过滤并离心，用1M的山梨醇溶液重复洗涤并重悬3次，收集最终的原生质体沉淀。

实施例4 抗菌肽TrSub在木霉中的发酵表达

将实施例2中构建的重组质粒使用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit Ⅰ 试剂盒进行质粒提取，将提取的重组质粒转移至制备的木霉原生质体中进行混合，混合液中加入聚乙二醇溶液并于冰上孵育30 min，之后于PDA固体培养基中在30 ℃条件下培养5-6天。

PDA固体培养基中生长的转化子挑取至新的平板上进行筛选，生长出菌丝及孢子后进行基因组提取并对其目的基因进行验证，筛选的阳性转化子接种至木霉发酵培养基中于30 ℃、180 rpm的条件下发酵表达5-6天，期间在菌体明显生长后调低温度。将发酵产物于96孔板中进行初步筛选，具体筛选过程为：初步以大肠杆菌为指示菌，将其培养至生长对数期并使用LB液体培养基稀释至菌浓度为10⁵ CFU/mL，取1 ml稀释后的菌悬液加入等量的抗菌肽发酵产物中，将96孔板置于37 ℃摇床中培养14 h左右，使用肉眼观察澄清度并测定其OD_600nm，初步筛选得出OD_600nm值较低且肉眼观察较为澄清的样品，即筛选出一株重组抗菌肽TrSub，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码的核苷酸如SEQ ID NO. 2所示。将其产物过滤并收集，使用SDS-PAGE进行检测及分析。选择其中的样品进行后续的纯化及蛋白浓度测定。SDS-PAGE检测如图3所示。

实施例5 抗菌肽TrSub的抗菌活性测定

最小抑菌浓度（MIC）的测定

本实施例所使用的指示菌为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌。

MIC的具体测定方法为微量二倍稀释法：将三种细菌使用其液体培养基培养至生长对数期，并收集各菌体稀释至菌体浓度为10⁵ CFU/mL备用，此步骤为菌悬液的制备。将纯化收集的抗菌肽TrSub溶液在96孔板的第一列中与菌悬液的液体培养基一起等量混合至抗菌肽样品起始浓度为200 μg/mL，在后续列中进行连续二倍稀释，呈浓度梯度。在96孔板浓度梯度的样品中均加入等量的稀释后的菌悬液，并于37 ℃培养箱中孵育16 h，培养之后肉眼观察各孔洞的浑浊程度，其中能使孔洞澄清的最小浓度为抗菌肽TrSub对各细菌的MIC。结果如表1所示，重组抗菌肽TrSub对三种细菌均有较好的抑制活性，且对比原序列抗菌肽，重组抗菌肽TrSub对革兰氏阴性菌的抑制活性更强，对大肠杆菌的MIC为37.5 μg/mL，而原序列抗菌肽对其的抗菌活性大于100 μg/mL。

表1 重组抗菌肽TrSub不同细菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度

最小杀菌浓度（MBC）的测定

根据MIC测定过程的结果，抗菌肽TrSub能使各细菌呈现澄清的浓度分别取样涂至各细菌相应的固体培养基中，培养16 h后观察平板上生长的菌落，能抑制99.9%细菌生长的样品浓度为抗菌肽TrSub对各细菌的MBC，结果如表1所示。

实施例6 重组抗菌肽TrSub的热稳定性测定

将重组抗菌肽TrSub样品在沸水中分别加热处理5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，经过热处理的样品作为待测样品，未经热处理的样品作为对照。将三种指示菌分别培养至生长对数期并稀释至菌浓度为10⁵ CFU/mL备用。经过不同时间热处理的抗菌肽样品与稀释后的各菌悬液混合，于37 ℃下孵育18 h，并在600 nm处测定其吸光值，以未经热处理的样品为对照，计算热处理不同时间后样品对各细菌的抑制率。

热稳定性结果如图4所示，重组抗菌肽TrSub经不同时间的高温处理对各细菌的抑制率几乎无明显的变化，沸水中处理20 min时对各细菌的抑制率几乎没有变化，处理25min时对各细菌的抑制率仍能达到80%左右，说明重组抗菌肽TrSub具有良好的热稳定性，且能够耐受工业化加工过程的高温处理过程。

实施例7 重组抗菌肽TrSub的胃蛋白酶稳定性测定

对重组抗菌肽TrSub进行消化酶稳定性测定，评价其对消化酶的耐受性。本实施例使用的消化酶为胃蛋白酶，使用pH为2.0的Gly-HCl缓冲液稀释胃蛋白酶至3000 U/mL。抗菌肽TrSub溶液使用稀释制备的胃蛋白酶溶液稀释至其MIC，此处及后续实例，未经说明均指对大肠杆菌的MIC。将稀释后的抗菌肽TrSub溶液置于37 ℃下孵育30 - 180 min作为待测样品。待测样品与稀释的三种菌悬液混合后置于37 ℃培养18 h，并在600 nm处测定其吸光值，以未经胃蛋白酶处理的样品为对照，计算胃蛋白酶处理不同时间后对各细菌的抑制率。

经过测定，重组抗菌肽TrSub对胃蛋白酶的稳定性较好，经胃蛋白酶处理后对各细菌的抑制率能仍保持较高水平（80%以上）（图5）。对胃蛋白酶良好的耐受性意味着重组抗菌肽TrSub具有通过动物的胃消化道进而发挥抗菌活性的潜力，这是其想要应用为饲料添加剂的基础。

实施例8 重组抗菌肽TrSub的溶血活性测定

使用购买的兔血红细胞进行重组抗菌肽TrSub的溶血活性测定。使用PBS溶液对兔血细胞进行洗涤及重悬2-3次，收集最终的血细胞与在96孔板中连续二倍稀释的抗菌肽TrSub溶液进行混合，并置于37 ℃孵育1 h。孵育后的混合样品在1200 rpm下离心10 min，收集并转移上清液至新的96孔板中，在570 nm处测定其吸光度。本实施例使用0.1% TritonX-100为阳性对照，其溶血率为100%；使用PBS溶液为阴性对照，其溶血率为0。根据公式定义，溶血率（%）=（TrSub的OD570 nm – PBS的OD570 nm）/（0.1% Triton X-100的OD 570 nm– PBS的OD 570 nm）*100%。

结果如图6所示，重组抗菌肽TrSub在MIC浓度及2MIC浓度时的溶血活性在10%以下，说明筛选得到的重组抗菌肽TrSub具有较低的溶血活性，该特性使得其应用的安全性进一步提升。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Gly Lys Ala Gln Cys Ala Ala Ala Trp Leu Gln Cys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Leu Gly Cys Gly Gly Gly Ala Val Ala Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Arg Gln Phe Cys Arg

35

<210> 2

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagctggaa aggctcaatg tgctgctgct tggttgcaat gtgcttcagg aggtactttg 60

ggatgtggag gaggagctgt tgcttgtcaa aactacagac aattttgtag a 111

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

Gly Leu Gly Lys Ala Gln Cys Ala Ala Leu Trp Leu Gln Cys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Ile Gly Cys Gly Gly Gly Ala Val Ala Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Arg Gln Phe Cys Arg

35

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctccgtggc gaaagcc 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcacgagct gtggccaag 19