具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

此外，在未特殊说明情况下，本发明所示的氨基酸序列左端为羧基端，右端为氨基端。

第一方面，本发明提供了短肽LBD-Q在制备抗病毒感染产品中的应用，所述短肽LBD-Q的氨基酸序列包括如SEQ ID No.2所示序列，SEQ ID No.2所示序列是对MjALF-D的LBD短肽进行设计和改造获得的人工序列，所述MjALF-D的LBD短肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示序列。ALF是甲壳动物中具有广谱抗菌活性的效应分子，在对虾中发现的抗脂多糖因子命名为MjALF，目前已见报道多种MjALF，包括MjALF-A、MjALF-B、MjALF-D2和MjALF-E等，现有报道多为对已发现的天然存在的多种MjALF的抗菌以及抗病毒活性进行的研究，而鲜见对MjALF进行有目的的人工设计和改进，本发明即在MjALF-D的基础上，以提高抗病毒能力为目的，对MjALF-D的LBD-ALF进行了重新设计和改造，得到一种新的LBD-Q，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在可选的实施方式中，所述SEQ ID No.2所示序列中的两个半胱氨酸通过二硫键连接。

在可选的实施方式中，所述SEQ ID No.2所示序列的两端具有保护性修饰；优选地，所述保护性修饰包括化学修饰。

在可选的实施方式中，所述SEQ ID No.2所示序列的氨基端进行了乙酰化修饰。

在可选的实施方式中，所述SEQ ID No.2所示序列的羧基端进行了酰胺化修饰。

上述二硫键连接和保护性化学修饰，能够显著提高短肽对抗外界因素影响的稳定性，使得其作为饲料或药物添加剂时，不易被降解，保证其稳定吸收并发挥抗病毒作用。

在可选的实施方式中，所述病毒包括WSSV病毒。

WSSV病毒是一种无包涵体病毒，由于不同学者研究方法及侧重点不同，对此病毒的叫法也不尽相同，但已达成的基本共识是，该病毒是造成对虾爆发性流行病的病原体，目前，已初步建成了多种早期快速检测技术，包括巢式PCR检测技术的应用，但至于防治措施，目前仅能通过加强清淤消毒、环境管理和巡池观察等措施尽量减少对虾的染病风险，而无有效药物能够实现防治，为此，本发明将上述提供的短肽LBD-Q用于制备对虾饲养的抗病毒感染产品中，以实现对虾爆发性流行病的有效防治。

在可选的实施方式中，所述抗病毒感染产品包括药物或饲料。

第二方面，本发明提供了一种饲料，包括主料、辅料和添加剂，所述添加剂包括前述实施方式任一项所述的短肽LBD-Q。

优选地，所述主料包括籽实类、糠麸类或饼粕类中至少一种。

优选地，所述辅料包括粘合剂、防霉剂或抗氧化剂中的至少一种。

粘合剂能使某些本身不具有粘性或粘性较小的药物粉末粘合起来。粘合剂例如可以为，但不限于酒精、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮K15或淀粉浆。

防霉剂是能抑制霉菌生长和杀灭霉菌的一类添加剂，包括但不限于过硫酸铵、磷酸钙、锌离子、银离子或铜离子化合物。

抗氧化剂能够保护药物成分受氧化损伤而变质。抗氧化剂例如可以为，但不限于亚硫酸钠、硫代硫酸钠或EDTA-2Na。

优选地，所述添加剂还包括矿物元素类添加剂、动物源蛋白质类添加剂、维生素类添加剂、氨基酸类添加剂、大蒜素类添加剂或生长因子添加剂中的至少一种。

上述饲料主要用于饲养对虾，在对虾饲料常用原料的基础上，通过添加抗病毒短肽LBD-Q，以提高饲养过程中对虾的抗病毒能力。

优选地，所述短肽LBD-Q和外膜蛋白偶联。

优选地，所述外膜蛋白来源于沙门氏菌。

沙门氏菌的外膜蛋白是众多噬菌体尾丝蛋白的靶向蛋白，将短肽LBD-Q和外膜蛋白偶联，能够使得短肽LBD-Q能够迅速靶向WSSV病毒，显著提高短肽LBD-Q降解前的有效率。

优选地，所述饲料包括虾养殖饲料。

优选地，所述虾包括日本囊对虾。

日本囊对虾是日本最重要的对虾养殖品种，在日本养到25克左右出售价格最高，主要销售活虾。我国福建、广东等南方沿海近几年来也已开始养殖。养殖180天体重可达20～25克。产卵群体体长为12～20厘米，体重为20～95克，该虾甲壳较厚，耐干露，适于活体运销，利润较高，营养价值与其他主要虾类相近。

防病是日本囊对虾的养殖中的关键步骤，传统的做法是，日本囊对虾养成中后期，每10天～15天用生石灰化水全池泼洒1次，改善池水的理化因子，预防病害发生，生石灰用量为15ppm～20ppm。在饵料中添加土霉素制成药饵，可预防细菌病，添加量一般为配饵的1‰。近几年来，在日本囊对虾的养成过程中病毒性白斑病也时有发生，对病毒性疾病尚缺乏有效的治疗手段，只能通过预防的手段来减缓发生，如投喂优质饵料，增强对虾体质，在饵料中添加维生素C、维生素E、人参皂苷等免疫增强物质，提高对虾的免疫能力。而虾白斑症病毒病的病原体是一种无包涵体病毒，经过验证，本发明提供的短肽LBD-Q对于虾病毒具有显著的抑制作用。

第三方面，本发明提供一种药物，含有前述实施方式任一项所述的短肽LBD-Q和药学上可接受的辅料。

优选地，所述短肽LBD-Q和外膜蛋白偶联。

优选地，所述外膜蛋白来源于沙门氏菌。

优选地，所述药物的剂型包括悬浮剂、颗粒剂、喷剂、乳剂或药浴液。

在可选的实施方式中，所述药物的辅料包括助溶剂、抗氧化剂、pH调节剂、溶剂和渗透剂。

助溶剂与难溶性药物形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加药物在溶剂中的溶解度。颗粒剂的助溶剂例如可以为，但不限于精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、葡甲胺、倍他环糊精、吐温80、聚乙二醇400或聚乙二醇600。

pH调节剂用以维持或改变药物酸碱度的物质。pH调节剂例如可以为，但不限于氢氧化钠。

溶剂的理化性质稳定，可以增大药物的溶解度，能与身体组织在生理上相适应，吸收快。

渗透剂能够帮助一些功效性的成分渗透进肌肤的角质层，发挥功效。渗透剂例如可以为，但不限于乙醇或月桂氮卓酮。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1基于MjALF-D进行抗菌肽LBD短肽的改造

根据对MjALF-D的LBD短肽的理化性质以及结构信息进行分析，分析软件使用Expert Protein Analysis Software(ExPASy)网站中的ProtParam在线分析软件(http://www.expasy.org/tools/protparam)以及The Antimicrobial Peptide Database(APD，http://aps.unmc.edu/AP/main.php)在线分析软件，得到多肽的相关参数。短肽的亲水疏水氨基酸的排布分析以及螺旋轮投影均使用在线分析软件Heliquest analysis(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py)(Gautier et al.,2008)进行。对MjALF-D的LBD短肽(LBD-ALF)在APD抗菌肽系统中进行序列比对，根据比对结果以及得到的所有相关参数，进行氨基酸的替换，从而改善短肽活性并改造设计新的LBD短肽，设计得到的新的短肽LBD-Q的理化性质如表1所示。

LBD-ALF和LBD-Q的氨基酸序列如下：

LBD-ALF：CTYNVKPDLQRFELYFLGTVTC(SEQ ID NO.1)；

LBD-Q：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC(SEQ ID NO.2)。

表1 LBD-Q短肽的理化性质分析

实施例2短肽LBD-Q短肽的人工合成

对已改造设计完成的LBD短肽进行合成。合成方法是按照固相化学合成，合成方向为从LBD-Q短肽的C端至N端，且在N端进行乙酰化修饰，在C端进行酰胺化修饰，形成末端封闭以起到增强合成多肽的稳定性的作用。两个半胱氨酸之间形成了一个二硫键，合成的LBD-Q短肽经反相高效液相色谱法进行纯化并检测其纯度，使用质谱法对LBD-Q短肽进行质谱鉴定，结果分别如图1和图2所示，根据图1的计算得到本实施例提供的LBD-Q短肽的纯度为95.97％，由图2所示的质谱图检测结果可以看出，本实施例提供的LBD-Q短肽的分子质量为2886.52。

实施例3短肽LBD-Q对WSSV病毒清除能力

为了证实LBD-Q短肽的抗病毒活性，首先制备WSSV病毒溶液，使用Taqman探针法对病毒拷贝数进行绝对定量检测，合成的TaqMan probe-WSSV32706质谱检测结果如图3所示，可以看出DNA序列正确，且纯度符合要求。

而后将LBD-Q短肽与WSSV病毒溶液共同孵育，步骤如下：

(1)WSSV病毒液浓度使用灭菌生理盐水调整为2.5×10⁴copy/μL；

(2)溶解短肽LBD-Q至浓度为80μM；

(3)WSSV病毒液与等体积的短肽LBD-Q溶液在室温摇床共孵1h，即得到待注射的混合液并及时进行后续注射实验，命名为WSSV+LBD-Q组。

对比例1

本对比例与实施例3的区别仅在于，将短肽LBD-Q溶液替换为生理盐水，命名为WSSV+sterilesaline组。

对比例2

本对比例与实施例3的区别仅在于，将短肽LBD-Q溶液替换为pGFP溶液，命名为WSSV+pGFP组。

对比例3

本对比例与对比例1的区别仅在于，未加入病毒，命名为sterilesaline组。

实验例1注射实验

将400尾日本囊对虾平均随机分为10组，每组40尾，按照实施例3和对比例1～3设置分组，向各组对虾的第二腹节注射50μL的已制备好的待注射混合液，最终WSSV阳性对照、阴性对照以及实验组的每尾虾体内分别含1.25×10⁶copy WSSV。对上述实施例3和对比例1～3得到的日本囊对虾的死亡率的影响绘制曲线，结果如图4所示，可以看出，WSSV与LBD-Q孵育后的实验组的累计死亡率远低于空白对照组及阴性对照组的累计死亡率。

所述绘制曲线的方法为，WSSV组注射后，每隔4h进行死亡数量统计，并及时捞出死虾。使用GraphPad Prism 8软件中的Kaplan-Meier plot(log-rankχ2test)方法对实验组和对照组之间的死亡率差异进行统计学显著性检验，并统计每组的累计死亡率，绘制图表，得到图4。

实验例2

在WSSV组注射后，分别于96h各取4只日本囊对虾的肌肉样于乙醇中，通过海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行样品的DNA提取。WSSV的病毒拷贝检测的绝对定量步骤参照Qiu等的报道(Qiu W,Zhang S,Chen Y,et al.Litopenaeus vannamei NF-κB isrequired for WSSV replication[J].Developmental&Comparative Immunology,2014,45(1):156-162)，并做适当改动：

(1)根据WSSV IE1(WSSV069)序列设计引物WSSV32678-F，如SEQ ID No.3所示，及WSSV32753-R，如SEQ ID No.4所示(见表2)进行PCR扩增，并将目的片段构建于pMD19-T质粒中。

(2)将测序正确的菌液进行后续的重组质粒的提取。

(3)设计探针WSSV32706序列，如SEQ ID No.5所示(见表2)，探针的纯化方式采用HPLC，并进行5’端的6-FAM及3’端的TAMRA修饰。

表2探针及引物序列

(4)按照10倍的梯度进行重组质粒的稀释作为标准溶液模板，将提取的对虾肌肉样品的DNA按照100ng的质量添加到体系中作为样品模板，以WSSV32678-F以及WSSV32753-R作为引物，进行绝对定量法检测攻毒后日本囊对虾肌肉中WSSV的拷贝数，具体反应体系及操作程序如下：

表3 PCR反应体系

反应程序为：95℃预变性30s，而后95℃，延伸5s，再60℃，荧光采集34s，延伸和荧光采集步骤重复40个循环。

每个样本进行三次重复。根据软件显示的样品的标准曲线，得到斜率、R²值以及扩增效率，并根据公式：拷贝数＝质量/DNA分子量×6.0×10²³得出拷贝数。得到每0.1μg虾组织DNA中的病毒拷贝数。

同时在感染96h后，对上述实施例3和对比例1和2得到的WSSV病毒的拷贝数进行检测，结果如图5所示，在感染96h后，通过绝对定量检测病毒拷贝数，与对比例2阴性对照组以及对比例1空白对照组相比，实施例3的处理组的虾WSSV拷贝数显著降低(p<0.05)，对WSSV的抗性增强。

实施例4

本实施例提供了一种对虾饲料，包括主料、辅料和添加剂，按照质量份数由以下原料组成：

主料包括豆粕20份，花生粕10份；

辅料包括淀粉浆25份，硫酸铵0.05份，亚硫酸钠0.05份；

添加剂包括复合矿物质2.5份，鱼油1.5份，复合维生素0.15份，偶联外膜蛋白的短肽LBD-Q 3份；

外膜蛋白与短肽LBD-Q的摩尔比例为1:1。

实施例5

本实施例提供了一种药浴液，按照质量份数由以下组分组成：

偶联外膜蛋白的短肽LBD-Q 10份，精氨酸5份，聚乙二醇400 1份，吐温80 1份，EDTA-2Na 0.5份，亚硫酸钠0.5份，甘油5份，乙醇5份，使用注射用水补充至100份，并调节pH值为7.0左右。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京师范大学珠海校区

<120> 短肽LBD-Q在制备抗病毒感染产品中的应用、饲料及药物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> marsupenaeus japonicus（日本囊对虾）

<400> 1

Cys Thr Tyr Asn Val Lys Pro Asp Leu Gln Arg Phe Glu Leu Tyr Phe

1 5 10 15

Leu Gly Thr Val Thr Cys

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Thr Tyr Lys Val Lys Pro Lys Leu Gln Arg Phe Lys Leu Tyr Phe

1 5 10 15

Leu Gly Thr Val Thr Cys

20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgttttctgt atgtaatgcg tgtaggt 27

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccactccat ggccttca 18

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagtaccca ggcccagtgt catacgtt 28