N-乙酰氨基葡萄糖类化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 N-乙酰氨基葡萄糖类化合物及其制备方法和应用 (N-acetylglucosamine compounds, and preparation method and application thereof ) 是由 张建龙 张兴晓 李有志 汤文利 姜琳琳 陈国忠 于馨 朱洪伟 黄清荣 于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖类化合物及其制备方法和应用,属于抑菌剂和微生物医药技术领域,其制备方法为：将海洋真菌杂色曲霉(Aspergillusversicolor)M-7-SW9于PDB真菌培养基中发酵培养获得发酵产物,然后对发酵产物进行提取、分离获得新的N-乙酰氨基葡萄糖类化合物。本发明的一种N-乙酰氨基葡萄糖类化合物及其制备方法和应用,经抑菌活性实验得出该化合物对水产病害细菌—迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的最小抑菌浓度为1.0微克/毫升,同时该化合物还对水产病害细菌—藤黄微球菌和副溶血性弧菌具有抑菌活性,可用于制备抗水产病害细菌的药物。(The invention relates to an N-acetylglucosamine compound and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of bacteriostatic agents and microbial medicines, wherein the preparation method comprises the following steps: fermenting and culturing marine fungus Aspergillus versicolor (Aspergillus versicolor) M-7-SW9 in PDB fungus culture medium to obtain fermentation product, extracting and separating the fermentation product to obtain new N-acetylglucosamine compounds. According to the N-acetylglucosamine compound and the preparation method and application thereof, the minimum inhibitory concentration of the compound on aquatic disease bacteria, namely Edwardsiella tarda and Vibrio harveyi is 1.0 microgram/ml, and the compound also has antibacterial activity on aquatic disease bacteria, namely micrococcus luteus and Vibrio parahaemolyticus, and can be used for preparing a medicament for resisting aquatic disease bacteria.)
技术领域
本发明涉及一种新型化合物及其制备方法和应用，尤其涉及一种从海洋真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9的发酵产物中提取、分离获得的N-乙酰氨基葡萄糖类化合物及其制备方法和应用，其属于抑菌剂和微生物医药
技术领域
。背景技术
随着水产养殖规模的扩大和水产养殖过程中抗生素的大量使用，水产养殖动物病害细菌的多重耐药现象日趋普遍，并且大量使用化学合成药物对水体和土壤都带来了严重的污染，对人类和生物健康也造成了危害，因此开发海洋生物源天然药物，将为解决目前水产养殖过程中的细菌性病害防治问题提供了新的思路。
海洋真菌能够产生具有丰富的化学结构多样性和显著的生物活性的次级代谢产物，是药物先导化合物的重要来源；N-乙酰氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有许多重要生理功能，还具有消炎、抗肿瘤及抗氧化作用，临床上是治疗骨关节炎、风湿性关节炎的药物，在食品、医药及化妆品等领域中均有广泛应用。
根据文献调研，本发明涉及的N-乙酰氨基葡萄糖类化合物是新化合物，之前鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是：为克服现有技术中存在的不足，提供一种N-乙酰氨基葡萄糖类化合物及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种N-乙酰氨基葡萄糖类化合物，N-乙酰氨基葡萄糖类化合物如式(I)所示，分子式为C9H15NO5；
一种基于N-乙酰氨基葡萄糖类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将海洋真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9于PDB真菌培养基中发酵培养，发酵产物经有机溶剂提取液反复浸泡提取并经乙酸乙酯萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；所述杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9于2021年4月25日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2021454；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱体系进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和薄层层析分离纯化，收集薄层层析分离纯化Rf值为0.6-0.7的组分，即得如式(I)所示的N-乙酰氨基葡萄糖类化合物；所述薄层层析分离纯化展开剂的体积比为2：1的石油醚-乙酸乙酯。
更进一步地，所述步骤1)中的有机溶剂提取液为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种。
更进一步地，所述步骤2)中的有机溶剂洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇或二氯甲烷-异丙醇中的一种或几种；所述有机溶剂洗脱体系的体积比为50-0：1。
更进一步地，所述步骤3)中反相硅胶柱层析洗脱液的体积比为4-0：1的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液的体积比为2-0：1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇。
更进一步地，所述PDB真菌培养基配方为：每升液体培养基中含土豆粉200克、葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克和海盐35克。
更进一步地，所述式(I)中所示N-乙酰氨基葡萄糖类化合物可用于制备新型抗水产病害细菌的药物；所述细菌为水产病害细菌的迟缓爱德华氏菌、哈氏弧菌、藤黄微球菌或副溶血性弧菌。
本发明的有益效果是：通过将海水样品中的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9于培养基中培养发酵，然后对获得的发酵产物进行提取、分离获得新的N-乙酰氨基葡萄糖类化合物，目前尚未见该化合物在水产病害细菌抑制活性方面的报道，市场上也尚未见有与此相关的药物，经抑菌活性实验得出该化合物对水产病害细菌—迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的最小抑菌浓度为1.0微克/毫升，同时该化合物还对水产病害细菌—藤黄微球菌和副溶血性弧菌具有抑菌活性，可用于制备抗水产病害细菌的药物。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明通过将真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9于培养基中培养发酵，并对发酵产物进行提取、分离获得如下实施例中所指的化合物—N-乙酰氨基葡萄糖类化合物，其化学结构如式(I)所示：
真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9分离于渤海海域采集的海水样品，其特征表现为：在PDA培养基上长有白色气生菌丝，后长出灰绿色孢子，在PDB液体培养基上前期为白色气生菌丝，后期菌膜变为深绿色。
实施例1
如式(I)所示的N-乙酰氨基葡萄糖类化合物的制备方法：
(1)取生长于平板培养基中的海洋真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M-7-SW9(大小1.5厘米×1.5厘米)接种于250mL PDB液体培养基中，28℃下使用摇床(200转/分钟)发酵7天，所得菌液接入到300L PDB液体培养基中，使用500L发酵罐发酵7天，发酵产物使用乙醇浸泡提取，并使用乙酸乙酯反复萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
所述PDB液体培养基配方为：每升水中土豆粉200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克和海盐35克。
(2)将粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为50：1至1：1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为50：1至1：1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇10：1(v/v)得到的洗脱组分，进行反相硅胶柱层析，以4-0：1的水-甲醇洗脱；收集上述步骤水-甲醇1：1(v/v)的洗脱组分，再用高效液相色谱(HPLC)纯化，使用水-甲醇1：1(v/v)为流动相，收集210nm波长下18.5min的吸收峰，得到纯化目标化合物，其结构鉴定为如式(I)所示：
所述化合物具有以下理化和波谱特性：
白色粉末状固体；比旋光度[α]20 D–18(c 0.15，MeOH)；核磁共振氢谱(溶剂为氘代甲醇)δH 5.69(dd，4.1，0.7)，6.33(br s)，4.87(ddd，3.5，1.5，0.7)，3.55(dd，5.2，3.5)，3.66(dd，10.7，3.5)，3.58(dd，10.7，5.2)，2.05(s)，3.33(s)；核磁共振碳谱(溶剂为氘代甲醇)δC 107.5(CH)，133.9(C)，111.7(CH)，86.9(CH)，75.8(CH)，64.4(CH2)，172.0(C)，23.1(CH3)，53.4(CH3)；高分辨质谱m/z 240.08519[M+Na]+，C9H15NO5Na+计算值为240.084244。
实施例2
水产病害细菌抑制剂活性：
用最小抑菌浓度法检测式(I)所示化合物的抗水产病害细菌活性，选择以下4株水产病原菌株：迟缓爱德华氏菌、哈氏弧菌、藤黄微球菌和副溶血性弧菌进行抗菌活性测试。
(1)抗菌活性测试(MIC法)：
最小抑菌浓度(MIC)，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。在96微孔板中，通过将不同浓度的药物加入到待测菌的菌悬液中，培养后观察，如果指示菌在某孔内生长，表示该孔的药物浓度不能抑制该菌的生长，该孔内液体浑浊，透光度明显下降；反之，该孔内液体澄清，透光度下降不显著。小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。
(2)菌悬液的制备
上述供试细菌分别接种于培养基(迟缓爱德华氏菌用TSB培养基，哈氏弧菌、藤黄微球菌和副溶血性弧菌分别用LB培养基)上于28℃培养24小时后，吸取4mL无菌的0.85％NaCl溶液(8.5g氯化钠定容到1000mL水中)洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下；用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中，然后用0.85％NaCl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5×108CFU/mL)，并进一步用0.85％NaCl溶液稀释至5×105CFU/mL；
0.5麦氏浊度标准为：将0.5mL 0.048mol/L的BaCl2(1.175％w/v BaCl2·2H2O)加到99.5mL 0.18mol/L(0.36N)的H2SO4(1％v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。
(3)样品的配制
分别取1mg左右待测样品(上述所得N-乙酰氨基葡萄糖类化合物)和阳性对照(氯霉素)，溶解于100μL左右DMSO中，充分混匀后，使其最终浓度为2560μg/mL，吸取50μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50μL DMSO，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，总共得到11组浓度依次减半的样品溶液(2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL)。
(4)空白对照：选择溶解待测样品的纯溶剂(DMSO)作为空白对照。
(5)MIC测定流程
5.1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔加样品溶液，每孔5μL，第12孔不加样品作为生长对照。
5.2)将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经液体培养基(迟缓爱德华氏菌用TSB培养基，哈氏弧菌、藤黄微球菌和副溶血性弧菌LB培养基)稀释1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至第11孔的样品终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃培养箱中，细菌培养24h。
5.3)在600nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。(注意：当阴性对照孔内指示菌明显生长实验才有意义；当实验出现单一的跳孔时，应记录抑制菌株生长的最高药物浓度；如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。)
实验结果为N-乙酰氨基葡萄糖化合物分别对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌具有较强的抑制活性，MIC值均为1.0μg/mL。
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对水产病害细菌具有较强抑制作用，可用于制备新型抗水产病害细菌药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。