具体实施方式

下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图 中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然 而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。 相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明 的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组 件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个 组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以 组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提 及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书 后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原 则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明提供了一种重组人胶原蛋白多肽，所述重组人胶原蛋白多肽的氨 基酸序列如SEQ ID NO:2所示或者是与SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

所述重组胶原蛋白多肽是发明人在胶原蛋白的基础上创造性地设计得 到，所述的重组胶原蛋白多肽可以用于抑制血管内皮细胞的生长以及能够促 进细胞的增殖和粘附，其中，

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列如下：

IKGDRGEIGPPGPRGEDGPEGPKGRGGPNGDPGPLGPPGEKGKLGVP GLPGYPGRQGPKGSIGFPGFPGANGEKGGRGTPGKPGPRGQRGPTGPRGE RGPRGITGKPGPKGNSGGDGPAGPPGERGPGEFYFDLRLKGDK

本发明提供了一种核酸分子，其中，所述核酸分子编码上述所述的重组 人胶原蛋白多肽。

所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如下：

CGGAATTCATCAAGGGTGATCGGGGGGAGATCGGCCCACCCGGT CCCAGGGGAGAAGATGGCCCTGAAGGCCCAAAGGGTCGCGGAGGTCC CAATGGTGACCCCGGTCCTCTGGGACCCCCTGGGGAGAAGGGAAAAC TCGGAGTCCCAGGGTTACCAGGGTATCCAGGAAGACAAGGACCAAAG GGCTCTATTGGATTCCCTGGATTTCCTGGCGCCAATGGAGAGAAGGGC GGCAGGGGGACCCCTGGAAAGCCAGGACCGCGGGGGCAGCGAGGCC CAACGGGTCCGAGGGGTGAAAGAGGCCCCCGGGGCATCACTGGGAA GCCTGGCCCCAAGGGCAACTCCGGAGGTGACGGCCCAGCTGGCCCTC CTGGTGAACGGGGACCCGGTGAGTTTTATTTCGACTTGCGGCTCAAAG GTGACAAAGCGGCCGCAA

所述核酸分子可以包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的那 些，例如包括具有骨架修饰的那些，所述核酸分子指的是核苷酸的聚合物， 核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于 DNA、RNA和PNA。核苷酸序列指的是构成核酸分子的线性序列。

在一些情况下，核酸分子含有cDNA，在一些情况下，可以修饰核酸分 子以用于本发明所述的构建体中，如用于密码子优化。在一些情况下，出于 克隆到载体的目的，可以将序列设计为含有末端限制性位点序列。

在一些情况下，编码所述重组人胶原蛋白多肽的核酸分子可以从多种来 源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分 离的编码核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。

在一个实施方案中，编码所述重组人胶原蛋白多肽的核苷酸序列是经密 码子优化的。通常，密码子优化涉及使所选择的密码子的百分比与已公开的 人类转移RNA的丰度平衡，使得没有一者过载或受限。在一些情况下，这 可能是必要的，因为大多数氨基酸由超过一种密码子编码，并且密码子使用 因生物而异。经转染的基因与宿主细胞之间的密码子使用差异可能会影响核 酸构建体的蛋白质表达和免疫原性。通常，对于密码子优化，选择密码子以 选择与人类使用频率平衡的那些密码子。通常，氨基酸密码子的冗余度使得 不同的密码子编码一种氨基酸。在一些实施方案中，在选择用于置换的密码 子时，可能需要所得突变是沉默突变，使得密码子改变不影响氨基酸序列。 通常，密码子的最后一个核苷酸可以保持不变而不会影响氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子用标签标记，优选的，所述标签为 6*His、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)或SUMO(小 泛素相关修饰物)。

本发明提供了一种载体，所述载体包含上述所述的核酸分子。

在一个实施方案中，所述载体为pPIC9k、pPICZαA、pGAPZA、pHIL-S1 或pYAM75P。

例如，将编码上述所述的重组人胶原蛋白多肽的一种或多种核酸克隆到 合适的一种或多种表达载体中，表达载体可以是任何合适的重组表达载体， 并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和 扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。

所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对 待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性， 酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。

本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述所述的载体。

为了产生重组人胶原蛋白多肽，可以将编码重组人胶原蛋白多肽的核酸 分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达。 可以使用常规技术(例如，通过使用能够与编码重组胶原蛋白的基因特异性 结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。

所述宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主 细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑 传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。

对于载体导入宿主细胞中的方法是公知的，例如使用电击将载体导入宿 主细胞中或者使用CaCl₂法将外源DNA导入到原核细胞中或者采用脂质体 介导的转染法将外源DNA导入到真核细胞中或者采用病毒载体感染法将基 因转入到宿主细胞中。

在一个实施方案中，所述宿主细胞为酵母宿主细胞，优选为毕赤酵母， 进一步优选为巴斯德毕赤酵母，例如为GS115、KM71菌株。

本发明提供了制备上述所述重组人胶原蛋白多肽的方法，其包括下述步 骤：

将上述所述的宿主细胞进行表达，然后进行分离纯化得到。

所述将宿主细胞进行表达指的将宿主细胞进行培养，培养基和培养条件 对于本领域技术人员来说是公知的，例如使用YPD、BMGY、BMMY、YNB 等培养基进行培养。

对于表达方式，本发明不作任何限制，其可以根据需要进行确认，例如 表达为诱导表达，对于诱导表达，其诱导剂可以为IPTG、β-半乳糖苷、甲 醇、乙醇等，优选为甲醇。

对于分离纯化的方法，本发明不作任何限制，其可以根据进行确定，例 如可以使用Ni-镍亲和层析法、还原型谷胱甘肽亲和层析法、麦芽糖亲和层 析法或SUMO亲和层析法。

本发明所提供的重组人胶原蛋白多肽，其可以用于抑制血管内皮细胞生 长，并且能够促进细胞的增殖和粘附。

本发明所提供的重组胶原蛋白多肽，其是在胶原蛋白的基础上经过设计 所得到的氨基酸序列，具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组胶原蛋白多 肽可以用于抑制血管内皮细胞生长，并且能够促进细胞的增殖和粘附，其与 市售的胶原蛋白相比，能够显著抑制血管内皮细胞生长，以及显著促进细胞 的增殖和粘附。

本发明提供了上述所述的重组人胶原蛋白多肽在生物化工或化妆品中 的应用。

本发明提供了一种抑制血管内皮细胞生长的活性剂，其包含上述所述的 重组人胶原蛋白多肽或上述所述的核酸分子所编码的重组人胶原蛋白多肽 或由上述所述的载体所表达的重组人胶原蛋白多肽或由上述所述的宿主细 胞生产的重组人胶原蛋白多肽。

本发明提供了一种促细胞生长剂，其包含上述所述的重组人胶原蛋白多 肽或上述所述的核酸分子所编码的重组人胶原蛋白多肽或由上述所述的载 体所表达的重组人胶原蛋白多肽或由上述所述的宿主细胞生产的重组人胶 原蛋白多肽。

本发明提供了一种促细胞粘附剂，其包含上述所述的重组人胶原蛋白多 肽或上述所述的核酸分子所编码的重组人胶原蛋白多肽或由上述所述的载 体所表达的重组人胶原蛋白多肽或由上述所述的宿主细胞生产的重组人胶 原蛋白多肽。

本发明所述的重组人胶原蛋白多肽或上述所述的核酸分子所编码的重 组人胶原蛋白多肽或由上述所述的载体所表达的重组人胶原蛋白多肽或由 上述所述的宿主细胞生产的重组人胶原蛋白多肽在制备制备抑制血管内皮 细胞生长的活性剂、促细胞增殖剂或促细胞粘附剂中的应用。

实施例

本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描 述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分 数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂 产品。

实施例1重组人胶原蛋白多肽的制备

1.重组人胶原蛋白多肽表达载体的构建

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组胶原蛋白肽的核苷酸序 列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2)。以该 核苷酸序列片段为模板，设计含有酶切位点的上下游引物进行PCR反应。 其中，上游引物加入6*His标签方便后续的纯化。

上游引物P1的序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸序列为： 5'-CGGAATTCATCAAGGGTGATCG-3'，其含有EcoRI限制性内切酶酶切位 点；

下游引物P2的序列如SEQ ID NO:4所示，其核苷酸序列为： 5'-TTGCGGCCGCTTTGTCACCT-3'，其含有NotI限制性内切酶酶切位点。

PCT的反应条件如下：98℃预变性1min，98℃变性10s，60℃退火10s， 72℃延伸10s，进行30循环后72℃延伸10min，反应体系如表1所示：

表1 PCR反应体系

用限制性内切酶EcoRⅠ和Not I对回收的PCR产物和表达载体pPIC9K (购自于Invitrogen公司)进行酶切。酶切反应体系如表2所示：

表2表达载体以及胶原蛋白多肽PCR产物的酶切反应

酶切产物经胶回收试剂盒回收后用T4 DNA连接酶(购自于赛默飞世尔 科技(中国)有限公司)连接，连接温度为16℃，连接时间为30min，连接 反应如表3所示：

表3表达载体与胶原蛋白多肽的连接反应

将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自于赛默飞世尔科技 (中国)有限公司)中，混匀，冰浴30min，42℃水浴60s(不能摇动)，再 冰浴1-2min；加入500μL LB培养基，37℃摇床孵育1h；摇匀菌液，取100μL 涂布于氨苄青霉素琼脂平板(LB/AP+)上，倒置于37℃培养12～16小时。 琼脂平板上挑取单菌落作为模板，然后以上游引物P1(SEQ ID NO:3)和下 游引物P2(SEQ ID NO:4)进行PCR。PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限 制性酶EcoRI、NotI进行酶切反应鉴定。两者都为阳性结果的克隆子进行测 序分析。测序引物是针对质粒pPIC9K的通用测序引物，若DNA测序结果 与设计的基因序列相符则确定此表达载体构建成功，同时构建转化空载体 pPIC9K的重组大肠杆菌做对照。

2.重组人胶原蛋白多肽的表达和纯化

接种DNA测序正确的转化子于含100mg/mL Amp的LB液体培养基中， 37℃，220rpm振荡培养过夜，进行pPIC9k-COL-S质粒大量提取(采用质粒 大提试剂盒，购自于天根生化科技(北京)有限公司)，取适量进行梯度稀 释后琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度。用Sacl I单酶切pPIC9k-COL-S，线性 化载体，其酶切体系如表4所示：

表4重组胶原蛋白多肽的线性化酶切反应

在上述酶切后的DNA进行纯化后，取10μL线性化DNA pPIC9k-COL-S 加入到80μLGS115酵母感受态细胞中，其操作示意图如图1所示，并转移 到预冷的0.2cm电极杯中，冰浴5min。将电极杯上的冰仔细擦干后放到电极 槽中拧紧，放下玻璃罩，调节电压1500V，电阻200Ω，电容50μF进行转化。 电击完后马上打开盖子加入1mL冰上预冷的1M山梨醇，轻轻混合后将液体 全部转移到1.5mL灭菌离心管中，涂MD板。将平板在30℃生化培养箱中 倒置培养2～5天，直到出现单菌落。以COL-S引物(上游引物P1和下游引 物P2)进行菌落PCR阳性筛选，在超净工作台中将长出目的条带的菌落依 次点到含0.25mg/mL～4.0mg/mL G418的YPD平板上，进行高拷贝筛选。

取高拷贝单菌落接种于YPD培养基中30℃，220rpm振荡培养过夜，取 适量培养液转接BMGY培养基30℃，220rpm振荡过夜至OD600达到2～8， 取适量培养物中转移至50mL灭菌离心管中，室温4000rpm离心3min后弃 上清，用BMMY培养基将菌体重新悬浮至OD600等于1以后，30℃，250rpm 诱导培养，酵母菌株GS115以及转化了空载体pPIC9k的酵母菌株GS115用 同样方法诱导培养。每24h加250μL甲醇。每24h取1mL样，12000rpm离 心1min后将上清和菌体分别保存于-20℃中以便后续的检测。诱导5天后停 止培养，将发酵液离心，分别保存上清液和菌体。

将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测，其中浓缩胶浓度为5％，分离 胶浓度为15％，上清液上样量为15μL。60V电压下跑胶30min后将其调至 100V继续电泳1～2h左右直到溴酚蓝达到胶板底部停止电泳，考马斯亮蓝 R-250染色30min后用脱色液脱色1h左右，更换几次脱色液，直至蛋白条 带清晰显现。结果表明，空载体pPIC9k在酵母菌株蛋白没有表达，而 pPIC9k-COL-S胶原蛋白多肽在酵母菌株GS115中表达，如图2所示。

重组蛋白利用Ni-镍亲和层析，将发酵上清液加入到Ni-镍亲和层析介质 中混合使目的蛋白与Ni-镍亲和层析胶充分结合，结合流速为0.6mL/min。 用NTA-10mM咪唑缓冲液清洗基线，流速为1mL/min；之后用NTA-40mM 咪唑缓冲液洗杂蛋白，流速为1mL/min，NTA-200mM咪唑缓冲液洗脱目的 蛋白，流速为1mL/min；在上清液以及NTA-200mM洗脱后的回收液中发现 目标蛋白，大小约为14KD，与预期结果吻合。纯化后的蛋白经超滤离心后， 上样20μg，基本上无杂带，蛋白纯度超过95％，如图2所示。

实验例1重组人胶原蛋白多肽在抑制血管内皮细胞中的应用

将实施例1所述的重组人胶原蛋白多肽作用于VEC(人血管内皮细胞) 细胞进行细胞抑制实验。具体步骤如下：将人HUVEC细胞(购自于ATCC 细胞库，产品目录号为：CRL-1730)接种于无菌96孔板中，每孔200μl培 养基，细胞培养使用M199完全培养液，每孔分别加入0.25mg/mL、0.5mg/mL、 1mg/mL、2mg/mL重组人(COL-S)胶原蛋白多肽。每个组浓度设置三个复 孔，空白对照组加入等体积的培养液，置于37℃培养箱培48h。弃上清，每 孔加入100μL培养液和50μL MTT溶液，摇匀，放进培养箱中孵育4h，4h 后吸出混合液，加入150μLDMSO来溶解紫色晶体甲瓒，震荡10min，放进 酶标仪中，检测波长570nm，测定每孔的吸光度值，重组人胶原蛋白多肽抑 制HUVEC内皮细胞数据如表5所示，其与市售胶原蛋白(购自于Abcam 公司)对血管内皮细胞的抑制作用示意图如3-1所示，抑制生长曲线如图3-2 所示，其中，

抑制率＝(空白组OD-实验组OD)×100％/空白组。

表5不同浓度的重组人胶原蛋白多肽以及市售胶原蛋白对血管内皮细 胞的抑制作用的吸光度值

从表5及图3-1至图3-2可以看出，本发明所述的重组胶原蛋白对血管 内皮的抑制率在60％以上，而市售胶原蛋白的抑制率在40％以下，说明本发 明所述的重组胶原蛋白对血管内皮细胞具有很强的抑制作用。

实验例2重组人胶原蛋白多肽在促细胞增殖中的应用

使用实施例1所述的重组人胶原蛋白多肽作用于HSF(人皮肤成纤维细 胞)细胞进行细胞增殖实验。具体步骤如下：将人HSF细胞(购自于ATCC 细胞库，产品目录号为HTX2132)接种于无菌96孔板中，每孔200μL培养 基，细胞培养使用DMEM/F12完全培养液，每孔分别加入0.25mg/mL、 0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL重组人(COL-S)胶原蛋白多肽。每个组浓度 设置三个复孔，空白对照组加入等体积的培养液，置于37℃培养箱培养48h。 弃上清，每孔加入100μL培养液和50μL MTT溶液，摇匀，放进培养箱中孵 育4h，4h后吸出混合液，加入150μL DMSO来溶解紫色晶体甲瓒，震荡10min， 放进酶标仪中，检测波长570nm，测定每孔的吸光度值，重组胶原蛋白多肽 促HSF(人皮肤成纤维细胞)细胞增殖数据如表6所示，其与市售胶原蛋白 (购自于Abcam公司)对人皮肤成纤维细胞增殖作用示意图如4-1所示，增 殖率曲线如图4-2所示，其中，

增殖率＝(实验组OD-空白组OD)×100％/空白组。

表6不同浓度的重组胶原蛋白多肽以及市售胶原蛋白对皮肤成纤维细 胞的增殖作用的吸光度值

从表6及图4-1至4-2可以看出，本发明所述的重组胶原蛋白促细胞增 值率接近于80％，而市售胶原蛋白的促细胞增值率低于40％，说明本发明所 述的重组胶原蛋白能够显著促进细胞的增殖。

实验例3重组人胶原蛋白多肽在促细胞粘附中的应用

使用实施例1所述的重组人胶原蛋白多肽作用于HSF(人皮肤成纤维细 胞)细胞进行促细胞粘附实验。具体步骤如下：将人HSF细胞接种于无菌 96孔板中，每孔200μL培养基，空白对照组只加PBS，37℃放置2h后用PBS 清洗各组3遍，洗去未粘附的细胞，每孔加入100μL培养液和50μL MTT溶 液，摇匀，放进培养箱中孵育4h，后吸出混合液，加入150μL DMSO来溶 解紫色晶体甲瓒，震荡10min，放进酶标仪中，检测波长570nm，测定每孔 的吸光度值。

胶原蛋白多肽促HSF(人皮肤成纤维细胞)细胞粘附数据如表7所示， 其与市售胶原蛋白(购自于Abcam公司)对人皮肤成纤维细胞的粘附作用 示意图如5-1所示，粘附率曲线如图5-2所示，其中，

促细胞粘附率＝(实验组OD-空白组OD)×100％/空白组。

表7不同浓度的重组胶原蛋白多肽以及市售胶原蛋白对皮肤成纤维细 胞的促粘附作用的吸光度值

从表7以及图5-1至图5-2可以看出，本发明所述的重组胶原蛋白的促 细胞粘附率为80％，而市售胶原蛋白的促细胞粘附率低于60％，说明本发明 所述的重组胶原蛋白能够显著促进细胞的粘附。

综上所述，本发明所提供的重组人胶原蛋白多肽能够抑制血管内皮细胞 的生长，能够促进细胞的增殖和粘附，从而可以将所述的重组人胶原蛋白多 肽应用于生物化工或者化妆品领域。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式 的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更 或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依 据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型， 仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 陕西巨子生物技术有限公司

<120> 重组人胶原蛋白多肽及其应用

<130> TPE01527

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 1

cggaattcat caagggtgat cggggggaga tcggcccacc cggtcccagg ggagaagatg 60

gccctgaagg cccaaagggt cgcggaggtc ccaatggtga ccccggtcct ctgggacccc 120

ctggggagaa gggaaaactc ggagtcccag ggttaccagg gtatccagga agacaaggac 180

caaagggctc tattggattc cctggatttc ctggcgccaa tggagagaag ggcggcaggg 240

ggacccctgg aaagccagga ccgcgggggc agcgaggccc aacgggtccg aggggtgaaa 300

gaggcccccg gggcatcact gggaagcctg gccccaaggg caactccgga ggtgacggcc 360

cagctggccc tcctggtgaa cggggacccg gtgagtttta tttcgacttg cggctcaaag 420

gtgacaaagc ggccgcaa 438

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 2

Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu

1 5 10 15

Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro

20 25 30

Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe

50 55 60

Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro

65 70 75 80

Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly

85 90 95

Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn

100 105 110

Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Gly

115 120 125

Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys

130 135 140

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 3

cggaattcat caagggtgat cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 4

ttgcggccgc tttgtcacct 20