一种c52结构脂的酶法合成方法
阅读说明：本技术 一种c52结构脂的酶法合成方法 (Enzymatic synthesis method of C52 structural lipid ) 是由 王小三 黄卓能 黄雅祺 王笑寒 时旺旭 江聪 于 2021-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种C52结构脂的酶法合成方法,属于食品加工技术领域。本发明利用一步法合成C52结构脂,采用蒸馏或吸附的方法降低棕榈硬脂或其分提产物的过氧化值至3mmol/kg以下,以实现维持脂肪酶的活性的目的,从而提高反应过程中脂肪酶的利用率。本发明提供了一种高产量、高效率、低成本的酶法合成C52结构脂的方法,避免了目前酶法合成C52结构脂成本高且利用率低的弊端,有巨大的潜力推动工业化大批量生产。(The invention discloses an enzymatic synthesis method of C52 structure lipid, belonging to the technical field of food processing. The invention utilizes a one-step method to synthesize C52 structure fat, and adopts a distillation or adsorption method to reduce the peroxide value of palm stearin or a separation product thereof to be below 3mmol/kg so as to achieve the purpose of maintaining the activity of lipase, thereby improving the utilization rate of the lipase in the reaction process. The invention provides a method for synthesizing C52 structure fat by an enzyme method with high yield, high efficiency and low cost, which avoids the defects of high cost and low utilization rate of C52 structure fat synthesized by the existing enzyme method and has great potential to promote industrial mass production.)
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种C52结构脂的酶法合成方法。
背景技术
母乳脂肪具有一定特殊性，母乳脂肪中有较高含量的1,3-二不饱和脂肪酸-2-饱和脂肪酸甘油三酯如OPO、OPL，它们不仅有利于婴幼儿消化吸收、减少便秘，还能在骨骼强化及肠胃成熟等方面起到积极的推动作用。正是因为母乳脂肪的这一特点，越来越多的婴幼儿配方奶粉生产商将“全价母乳替代脂”应用于婴幼儿配方奶粉的设计与生产，以母乳脂组成为模板、不断追求婴幼儿奶粉与母乳的高相似性，研发更适合中国婴幼儿的奶粉产品。近年来，合成OPO、OPL结构脂并将其用于母乳脂替代品中的研究较为火热，国外已有批准上市的OPO结构脂产品，但国内目前还在探索更优的生产方法及更适合中国宝宝体质的配方奶粉。
目前在工业化生产中合成OPO、OPL等C52型母乳替代脂的方法有化学催化法、溶剂分提法、酶法合成法等。相较于传统化学催化法，酶法催化具有活性高，反应条件温和，特异性强等特点，并且酶催化合成的母乳替代脂产品营养价值更接近母乳脂。但在实际的工业化应用中，酶的价格昂贵，大批量生产更需考虑成本问题，在酶成本无法降低的条件下，提高酶的生产和利用效率成为关键。
当前，生产C52型母乳替代脂使用的脂肪酶重复利用次数较少且提高脂肪酶利用率的方法也大多不利于连续化生产，至今国内还没有商业化的母乳替代脂产品上市，若能从源头解决脂肪酶利用率低的问题，将具有一定的现实意义。
发明内容
[技术问题]
现有用于生产C52型母乳替代脂(以下称C52结构脂)的脂肪酶的成本高、重复利用次数少或利用率低。
[技术方案]
本发明从源头上对所用棕榈油分提物进行降过氧化值处理，然后采用一步法合成C52结构脂，能够在保证高产量的同时大幅提升了酶的利用率，对于工业化生产具有重大意义。
具体的，本发明提供了如下技术方案：一种C52结构脂的酶法合成方法，所述方法包括以下步骤：
S1、原料处理：将碘值为8g/100g～30g/100g的棕榈油分提物进行降过氧化值处理，所述过氧化值需降到3mmol/kg以下；
S2、C52结构脂合成：将S1处理后的棕榈油分提物与富含油酸和亚油酸的游离脂肪酸进行混合，在脂肪酶的催化下进行反应，反应一定时间后，去除脂肪酶和游离脂肪酸，得到富含C52的结构脂，对所得结构脂进行脱臭处理即可。
优选地，S1步骤中，所述棕榈油分提物碘值范围为10g/100g～18g/100g。
优选地，S1步骤中，原料降过氧化值处理方法包括蒸馏法和吸附法中的任一种或两种。
优选地，所述蒸馏法包括脱臭、分子蒸馏中的任一种或两种。
优选地，所述脱臭的温度为230～265℃，时间为30～120min，操作压力不高于6mbar。
优选地，所述分子蒸馏的蒸发面温度为230～270℃，操作压力为4～10mbar。
优选地，所述吸附法的反应时间为50min以下。
优选地，所述吸附法的吸附剂包括硅胶、活性白土、活性炭、沸石、硅藻土、二氧化硅和凹凸棒土中的一种或几种，优选硅胶、活性炭。
优选地，所述S2步骤中富含油酸和亚油酸的游离脂肪酸来源于天然油脂。
优选地，所述天然油脂包括植物油脂和动物油脂。
优选地，所述植物油脂包括但不限于高油酸葵花籽油、大豆油、花生油、玉米油、米糠油、芝麻油和橄榄油中的任一种或多种。
优选地，所述动物油脂包括但不限于驴油、马油、猪油和鸡油中的任一种或几种。
优选地，所述S2步骤使用的脂肪酶包括以米根霉(Rhizopus oryzea)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkaholderiacepacia)、米黑根霉菌(Rhizomucormiehei)为来源的脂肪酶中的任一种或多种。
优选地，所述脂肪酶包括来源于米根霉(Rhizopus oryzea)的Lipase DF IM，来源于洋葱伯克霍尔德菌(Burkaholderiacepacia)的Lipase PS和/或Lipase AK，来源于米黑根霉菌(Rhizomucormiehei)的Lipozyme RM IM和/或Lipozyme RM。
优选地，所述脂肪酶的加入量为反应物总质量的4％～16％，优选为6％～14％。
优选地，所述S2步骤合成C52结构脂反应温度为45℃～75℃，优选为50～65℃；反应时间为2h～14h，优选为4～8h。
优选地，步骤S2中，棕榈油分提物与富含油酸和亚油酸的游离脂肪酸摩尔比为1:6～1:18，优选为1:10～1:14。
优选地，步骤S2中，富含油酸和亚油酸的游离脂肪酸中油酸与亚油酸摩尔比为1:0.3～1:3，优选为1:0.6～1:1.2。
本发明还提供了上述方法在制备配方奶粉领域中的应用。
本发明的有益效果：
本发明对酶法合成C52结构脂所需的原料进行降过氧化值处理，进而更好的保留酶法合成C52结构脂过程中脂肪酶的活性，可有效增加酶的重复利用次数，克服了工业化生产过程中脂肪酶成本高、利用率低的弊端。
附图说明
图1为脂肪酶在经或未经吸附处理的原料中使用3次后得到的C52甘油三酯液相色谱图(蒸发光检测器)，其中，图1a为实施例4中脂肪酶在经吸附处理的原料中使用3次得到的C52结构脂液相色谱图，图1b为实施例4中脂肪酶在未经处理的原料中使用3次得到的C52结构液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
1.C52结构脂分析方法：
HPLC-ELSD检测的操作方法和参数：参考高亮{高亮,余旭伟,邹凤,等.酶法合成1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯结构脂的研究[J].中国油脂,2020,45(08):66-70.}的方法。
C52结构脂包括OPO、OPL、LPL和POS。
2.过氧化值分析方法：参照《GB5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》的方法测定过氧化值。
实施例1：(反应温度优化)
(1)原料处理：对过氧化值为5.8mmol/kg、碘值为14g/100g的棕榈油分提物进行脱臭处理，脱臭条件为265℃，4mbar，90min；处理后的原料过氧化值降为2.4mmol/kg。
(2)C52结构脂合成：往处理后的棕榈油分提物中加入富含油酸、亚油酸的游离脂肪酸混合物(按棕榈硬脂分提物:油酸:亚油酸＝1:8:6摩尔比称取)，然后加入来源于米黑根霉菌(Rhizomucormiehei)的脂肪酶Lipozyme RM IM，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL间歇式酶夹层反应器中，快速升至一定温度，反应8h。待反应结束后，回收脂肪酶并去除游离脂肪酸，得到富含C52的结构脂，对所得结构脂进行脱臭处理，条件如(1)，最后使用HPLC-ELSD检测C52甘油三酯含量。
探究第(2)步中反应温度对酯交换合成产物中C52结构脂含量的影响，结果见表1，可见，酶催化温度升高有利于提高C52结构脂含量，当温度提高至60℃以上时，继续提高反应温度对C52结构脂含量的提升效果不明显。
表1第(2)步反应温度对合成产物中C52结构脂含量的影响
实施例2：(反应时间优化)
(1)原料处理：对过氧化值为6.3mmol/kg、碘值为16g/100g的棕榈油分提物进行脱臭处理，脱臭条件为265℃，4mbar，90min；处理后的原料过氧化值降为2.7mmol/kg。
(2)C52结构脂合成：往处理后的棕榈油分提物中加入富含油酸、亚油酸的游离脂肪酸混合物(按棕榈硬脂分提物:油酸:亚油酸＝1:8:6摩尔比称取)，然后加入来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶LipaseDF IM，加酶量为12％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL间歇式酶夹层反应器中，快速升温至65℃，反应一定时间。待反应结束后，回收脂肪酶并去除游离脂肪酸，得到富含C52的结构脂，对所得结构脂进行脱臭处理，条件如(1)，最后使用HPLC-ELSD检测C52甘油三酯含量。
探究第(2)步中反应时间对酯交换合成产物中C52结构脂含量的影响，结果见表2，可见，增加反应时间能够提高产物中C52结构脂含量。
表2第(2)步反应时间对合成产物中C52结构脂含量的影响
实施例3：(原料处理方法)
(1)原料处理：对过氧化值为5.4mmol/kg、碘值为15g/100g的棕榈油分提物进行降过氧化值处理，降过氧化值的方法见表3(过氧化值均降至3mmol/kg以下)。
(2)C52结构脂合成：往处理后的棕榈油分提物中加入富含油酸、亚油酸的游离脂肪酸混合物(按棕榈硬脂分提物:油酸:亚油酸＝1:8:6摩尔比称取)，然后加入来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶LipaseDF IM，加酶量为12％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL间歇式酶夹层反应器中，快速升温至65℃，反应8h。待反应结束后，回收脂肪酶并去除游离脂肪酸，得到富含C52的结构脂，对所得结构脂进行脱臭处理，条件为265℃，4mbar，90min。
将第(2)步回收后的脂肪酶加入下一次酶法合成C52结构脂的反应中，其余条件与第一次反应一致，经过12次重复使用后，采用HPLC-ELSD检测C52结构脂含量。
探究原料经不同的降过氧化值方法处理即分子蒸馏、脱臭和吸附后对所用脂肪酶活性维持情况的影响，同时优化了各方法下的各个条件，分别测得各方法不同条件下脂肪酶重复利用12次后得到的C52结构脂含量，见表3。对照组中使用的是相同的原料，但不进行任何处理，同样重复使用12次。
表3实施例3中的酶在使用12次后得到的C52结构脂含量(反应底物经或不经降过氧化值处理)
从表3中可知，使用蒸馏和吸附方法处理原料均能有效提高酶重复利用率，在使用12次后仍保留有一定程度的酶活性。
实施例4：
(1)原料处理：对过氧化值为4.6mmol/kg、碘值为17g/100g的棕榈油分提物进行吸附处理，吸附条件为添加1％硅胶，在室温下吸附20min；处理后的原料过氧化值降为1.2mmol/kg。
(2)C52结构脂合成：往处理后的棕榈硬脂分提物中加入富含油酸、亚油酸的游离脂肪酸混合物(按棕榈硬脂分提物:油酸:亚油酸＝1:8:6摩尔比称取)，然后加入来源于米黑根霉菌(Rhizomucormiehei)的脂肪酶Lipozyme RM IM，加酶量为10％(w/w，相对于反应物总质量)，一起混合于50mL间歇式酶夹层反应器中，快速升温至65℃，反应8h。待反应结束后，回收脂肪酶并去吃游离脂肪酸，得到富含C52的结构脂，对所得结构脂进行脱臭处理，条件为265℃，4mbar，90min。
将第(2)步回收后的脂肪酶加入下一次酶法合成C52结构脂的反应中，其余条件与第一次反应一致，经过3次重复使用后，采用HPLC-ELSD检测C52结构脂含量。
探究原料经吸附处理和未经吸附处理对第(2)步的酶重复利用效果的影响：分别测得在上述两种条件下酶重复利用3次后得到的C52结构脂含量，见表4。
表4原料经或未经吸附处理对C52结构脂含量的影响
如图1所示，图1a为实施例4中脂肪酶在经吸附处理的原料中使用3次后得到的C52结构脂液相色谱图，图1b为实施例4中脂肪酶在未经吸附处理的原料中使用3次后得到的C52结构脂液相色谱图。数据归纳于表4中，可见脂肪酶在吸附处理后的原料中使用3次后合成C52结构脂的含量较高，说明原料的过氧化值越低，对酶活性的维持越有利，得到的C52结构脂含量更高，如此酶的重复利用次数可以更多。可预测在工业化生产中做如此处理能大幅提高酶的处理量，降低成本。
当采用本发明的其他脂肪酶时，利用本发明的方法也能够有效的维持酶的活性，增加酶的重复利用次数，从而实现酶利用率的提高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。