一种制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法
阅读说明：本技术 一种制备(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法 (Method for preparing (R) -3-amino-4- (2,4, 5-trifluorophenyl) -butyric acid ) 是由 竺伟 张小飞 马斌祥 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法。本发明的方法以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯为底物,乙二醇为助溶剂,在弱碱性条件以及转氨酶的催化作用下,一锅法生成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸。本发明一步得到目标产物,操作简单,反应条件温和,适合工业化生产。(The invention discloses a method for preparing (R) -3-amino-4- (2,4, 5-trifluorophenyl) -butyric acid. The method takes 3-carbonyl-4- (2,4, 5-trifluorophenyl) -butyrate as a substrate and ethylene glycol as a cosolvent, and generates (R) -3-amino-4- (2,4, 5-trifluorophenyl) -butyrate by a one-pot method under the alkalescent condition and the catalytic action of transaminase. The method can obtain the target product in one step, is simple to operate, has mild reaction conditions, and is suitable for industrial production.)
技术领域
：本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种利用转氨酶一步催化制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法。
背景技术
：西他列汀磷酸盐是由默克公司开发的一种治疗Ⅱ型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，于2006年经美国FDA批准后上市，在全球多个国家被批准使用。该药主要通过抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)的活性，保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平。经临床研究表明，该药物是一个口服有效、单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用，具有口服安全，耐受性好，不良反应少等优点。由于受到专利对该产品的限制，多家医药公司从合成该药的重要手性氨基中间体着手研究，其中(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸就是合成西他列汀磷酸盐的一个重要的手性中间体，西他列汀磷酸盐的合成路线如Scheme 1所示。
围绕手性氨基中间体的酶法制备，中国专利CN105018440B公开一种从来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1中钓取新的转氨酶，对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯进行转化，获得具有高手性的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯产物。
中国专利CN10728616A公开一种利用来源节杆菌的转氨酶，对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸羟基酯类底物进行转化，获得对应的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸羟基酯，再经过LiOH强碱水解，获得(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸中间体。
中国专利CN108586346A公开一种利用来源节杆菌的转氨酶突变体，对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酰胺类底物进行反应，获得对应的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酰胺产物。
当前报道的西他列汀磷酸盐中间体酶法合成中，仍以手性氨基酯类产物为主，后续要经过强碱的处理，再水解为β-氨基酸终产物；另外，反应体系以DMSO为助溶剂的转化效率不高，且反应过程也受到底物的抑制，这些现实问题都影响该中间体的生产效率和成本。因此，针对于西他列汀磷酸盐中间体(I)的酶法制备，仍有待于进一步改进和提高。
发明内容
：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简单易于产业化的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
其中，R1为C1-C4的烷基取代基。
本发明提供一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法，具体包括如下步骤：以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯为底物，乙二醇为助溶剂，在弱碱性条件下，在转氨酶的催化作用下一锅法生成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸。
进一步，一锅酶法制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的操作步骤为：用乙二醇为助溶剂，溶解3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类底物，配制成一定浓度，在2h内加入反应体系；配制一定浓度的缓冲溶液为反应介质，向反应介质中投加一定量的异丙胺、磷酸吡哆醛、乙二醇和转氨酶；在一定温度下搅拌反应，利用一定浓度的异丙胺控制反应过程中的pH；反应结束利用高效液相色谱法分析转化率和产物的光学纯度。
进一步，所述底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯浓度为50～300mM，优选100mM。
更进一步，所述3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类底物为3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸叔丁酯等，优选3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯。
进一步，所述乙二醇在反应体系中的浓度为5～50％(V/V)，优选反应体系浓度为20％
进一步，所述弱碱性条件为pH＝7.5～10.0，优选pH＝9.0。
进一步，所述转氨酶来自于节杆菌Arthrobacter sp。
进一步，该反应在反应温度为30～60℃条件下进行，优选50℃。
本发明的有益效果在于，通过对转氨酶有机溶剂的优化，发现乙二醇作为助溶剂，不仅提高了转氨酶对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类的催化效率，同时反应结束后，可以直接获得(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸产物，光学纯度>99％，转化率>96％。
附图说明
图1转氨酶的蛋白电泳图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1节杆菌转氨酶蛋白在大肠杆菌中的表达
借助NCBI网站，获取转氨酶的野生型基因序列，通过密码子优化后，人工设计并全基因合成，在基因的两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点，并克隆到pET-24a载体上。将上述构建好的重组质粒经过化学转化方法，转入DH5α感受态细胞，在含有Kan+抗性的LB平板上37℃隔夜倒置培养。挑选阳性单克隆进行基因测序，确定序列正确后，将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，提出单克隆细胞，获得可以诱导表达的节杆菌转氨酶基因工程菌株。
将含有目的基因的BL21(DE3)细胞接种到含有Kan+抗性的LB试管中，于37℃培养过夜，得到一级种子培养液。将种子培养液按照1％的接种比例转接到含有抗性的2YT液体培养基中，置于摇床中，37℃下，200rpm转速培养3-5h，测OD达到0.6～0.8时，降温至20℃，加入IPTG，浓度控制在0.2mM，进行隔夜诱导表达。发酵液通过离心并收集菌体，用磷酸盐缓冲液将收集的菌体进行溶解，并在高压均质机中进行破碎细胞，再次12000rpm离心10min后，得到的上清液即为转氨酶蛋白，通过电泳可以看见蛋白的表达情况，见附图1。
实施例2转氨酶细胞在不同有机溶剂下的转氨反应
先用1mL不同的有机溶剂溶解3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯底物各0.26g，配制成100mM的底物浓度。所有反应体系都控制在10mL，依次向反应釜中加入1mL 1M的pH 9.0三乙醇胺缓冲液，1mL 10mM的磷酸吡哆醛，1mL 3M的异丙胺和0.5g酶细胞，每个反应釜对应不同有机溶剂各加1mL。反应在50℃下运行，利用3M的异丙胺控制反应过程的pH维持在9.0。底物以匀速滴加的方式控制在2h内加入反应体系，每个反应体系中有机溶剂的终浓度在20％(V/V)。反应24h后，分别取样离心，用液相分析不同条件下的转化率和产物手性纯度，具体结果见表1。
表1不同有机溶剂对反应体系的影响
有机溶剂
转化率
(R)产物手性纯度
20％乙醇
75.1％
98.2％
20％DMSO
84.3％
97.8％
20％乙二醇
96.4％
99.1％
20％甲醇
75.1％
94.2％
20％四氢呋喃
73.1％
98.1％
20％乙腈
85.6％
90.5％
20％MTBE
82.9％
97.9％
20％甲苯
49.5％
98.0％
20％异丙醇
81.7％
98.3％
20％叔丁醇
66.5％
95.2％
20％正丁醇
57.2％
/
20％乙酸乙酯
70.3％
96.8％
20％乙酸丁酯
25.3％
/
20％DMF
21％
61％
20％正己烷
25.4％
97.5％
20％正庚烷
19.7％
95.4％
20％环己烷
31.8％
98.2％
实施例3转氨酶细胞对不同浓度乙二醇的转化效率
用有机溶剂乙二醇溶解3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯底物各0.78g，配制成300mM的底物浓度。每个反应体系都控制在10mL，依次向反应釜中加入1mL 1M的pH 9.0三乙醇胺缓冲液，1mL 10mM的磷酸吡哆醛，1mL 3M的异丙胺和0.5g酶细胞，每个反应釜加入不同量的乙二醇，保持反应体系中乙二醇的比例分别为5％、10％、20％、30％、50％。反应在50℃下运行，利用3M的异丙胺控制反应过程的pH维持在7.5。底物以匀速滴加的方式控制在2h内加入反应体系。反应24h后，分别取样离心，用液相分析不同条件下的转化率和产物手性纯度，具体结果见表2。
表2不同乙二醇用量对反应体系的影响
有机溶剂
转化率
(R)产物手性纯度
5％乙二醇
89.3％
98.8％
10％乙二醇
89.8％
98.8％
20％乙二醇
96.4％
99.1％
30％乙二醇
87.2％
98.6％
50％乙二醇
71.6％
99.0％
实施例4不同酯类底物的转化效率
用乙二醇分别溶解3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯和3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸叔丁酯底物为0.24g、0.26g、0.27g和0.29g，配制成100mM的底物浓度。每个反应体系都控制在10mL，依次向反应釜中加入1mL 1M的pH 9.0三乙醇胺缓冲液，1mL 10mM的磷酸吡哆醛，1mL 3M的异丙胺和0.5g转氨酶酶细胞，1mL乙二醇助溶剂，保持反应体系中乙二醇的比例为20％。反应在50℃下运行，利用3M的异丙胺控制反应过程的pH维持在9.0。底物以匀速滴加的方式控制在2h内加入反应体系。反应24h后，分别取样离心，用液相分析不同条件下的转化率和产物手性纯度，具体结果见表3。
表3不同底物对反应体系的影响
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：苏氨酸生产菌种的构建及生产苏氨酸的方法