一种抑制血管内皮生长因子受体2基因表达的干扰rna及其应用
阅读说明：本技术 一种抑制血管内皮生长因子受体2基因表达的干扰rna及其应用 (Interfering RNA for inhibiting vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression and application thereof ) 是由 王根宇 林美娜 于 2020-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制血管内皮生长因子受体2基因表达的干扰RNA及其应用。特别是,上述干扰RNA为siRNA,其包含GGAGUGAGAUGAAGAAAUU和/或AAUUUCUUCAUCUCACUCC的核苷酸序列,其可有效抑制VEGFR2基因表达,为预防或治疗VEGFR2相关疾病(特别是VEGFR2相关的癌症)提供了新的选择。(The invention discloses an interfering RNA for inhibiting the expression of a vascular endothelial growth factor receptor 2 gene and application thereof. In particular, the interfering RNA is siRNA comprising GGAGUGAGAUGAAGAAAUU and/or AAUUUCUUCAUCUCACUCC nucleotide sequences, can effectively inhibit VEGFR2 gene expression, and provides a new choice for preventing or treating VEGFR2 related diseases (particularly VEGFR2 related cancers).)
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物医药
技术领域
，具体涉及一种抑制血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2)mRNA表达的干扰RNA，特别是siRNA，及其应用。背景技术
血管内皮生长因子受体是由包括VEGFR1(FLT、FLT1)、VEGFR2(FLK-1、KDR)和VEGFR3(FLT4、PCL)的三种密切相关的受体酪氨酸激酶构成的VEGF受体亚家族的细胞表面受体。其共同特点是催化域内有酪氨酸激酶插入区，该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，由受体磷酸化而引起细胞内许多酶和其他反应。但在细胞的生长和分化中起重要作用而与内皮细胞的增殖和血管生成有关的只有VEGFR2(FLK-1，含激酶插入区受体：kinase insert domain-containing receptor，KDR)。它在胚胎血管内皮细胞中表达较高，而在成熟血管内皮细胞表达下降。VEGFR2与配体(如VEGF A、C、D或E)结合将诱导受体二聚合以及VEGFR2 C端结构域中若干酪氨酸(Y)残基的自体磷酸化。这一自体磷酸化引起若干信号转导级联的下游活化，从而引起内皮细胞增殖和迁移、血管渗透性增加和血管生成。VEGF/VEGFR2在多种癌症和疾病中表达异常，具体为表达上调，而抑制VEGF/VEGFR2的表达被认为可以缓解或治疗疾病。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发展起来的一项新的基因沉默技术，siRNA是RNAi的效应分子，体外合成siRNA则是RNA干扰技术的最新发展，尤其是在特异性抑制哺乳动物细胞基因表达方面，为基因治疗开创了新的道路。
发明内容
本发明提供一种抑制VEGFR2 mRNA表达的干扰RNA。
具体地，上述干扰RNA包含正义链和与其反向互补配对的反义链。
具体地，上述干扰RNA选自：siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA、miRNA及其组合。
在本发明的一个实施方式中，上述干扰RNA为siRNA。
在本发明的一个实施方式中，上述干扰RNA是化学合成的。
具体地，上述干扰RNA包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。
具体地，上述干扰RNA包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。
具体地，上述干扰RNA的正义链包含如下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：5′-GGAGUGAGAUGAAGAAAUU-3′。
具体地，上述干扰RNA的反义链包含如下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：5′-AAUUUCUUCAUCUCACUCC-3′。
在本发明的一个实施方式中，上述干扰RNA(如siRNA)分子的正义链和/或反义链的末端(如3′末端)还可设有n个悬挂碱基(Over-hang)，以增加该干扰RNA的活性。其中，悬挂碱基可以为相同或不同的脱氧核苷(如脱氧胸苷(dT)、脱氧胞苷(dC)、脱氧尿苷(dU)等)，n为1-10的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，特别是2-4的整数；在本发明的一个实施例中，n＝2，悬挂碱基可以为dTdT、dTdC或dUdU，等等。
在本发明的一个实施例中，上述干扰RNA分子的正义链和反义链的3′末端)均设有悬挂碱基dTdT。
具体地，上述干扰RNA的正义链包含如下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：5′-GGAGUGAGAUGAAGAAAUU dTdT-3′。
具体地，上述干扰RNA的反义链包含如下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：5′-AAUUUCUUCAUCUCACUCC dTdT-3′。
在一些实施方案中，上述干扰RNA分子中还可包含至少一个修饰的核苷酸，修饰的干扰RNA具有比相应未修饰的干扰RNA具有更佳的性质，如更高的稳定性，更低的免疫刺激性等。
本发明还提供一种上述干扰RNA的递送系统，其包含上述干扰RNA和载体。
具体地，上述载体可以采用任何适于将本发明上述干扰RNA递送于靶组织或靶细胞等的载体，如现有技术(例如陈中华，朱德生，李军，黄展勤.“非病毒siRNA载体研究进展”.中国药理学通报.2015，31(7)：910-4；王锐，曲炳楠，杨婧.“载siRNA的纳米制剂研究进展”.中国药房.2017，28(31)：4452-4455)中公开的那些。
在本发明的一个实施方式中，上述载体为病毒载体，具体如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。
在本发明的另一个实施方式中，上述载体为非病毒载体，具体如脂质体、聚合物、多肽、抗体、适配体等或其组合；其中，上述干扰RNA与非病毒载体的重量比可以为1:1-50(如1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50)。
具体地，上述脂质体可以为阳离子脂质(如Invitrogenn公司的lipofectamine系列、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP))、中性离子脂质体(如二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇等)、阴离子脂质体(如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等)或其混合物。
具体地，上述聚合物可以为合成型聚合物(如聚乙烯亚胺、环糊精等)或天然型聚合物(如壳聚糖、端胶原等)或其混合物。
具体地，上述多肽可以为细胞穿透肽(CPP)(如鱼精蛋白、Tat肽、transportan肽、penetratin肽、寡聚精氨酸肽等)。
具体地，上述抗体可以为单链抗体(如scFv-tp、scFv-9R等)。
本发明还提供一种药物组合物，其包括上述干扰RNA或其递送系统，以及药学上可接受的辅料。
本发明还提供一种上述干扰RNA或其递送系统、药物组合物在制备预防和/或治疗VEGFR2相关的疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种上述干扰RNA或其递送系统在设计用于预防和/或治疗VEGFR2相关的疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种上述干扰RNA或其递送系统、药物组合物在抑制活细胞中VEGFR2基因表达的应用。
本发明还提供一种在需要其的受试者中抑制VEGFR2基因表达的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本发明上述干扰RNA或其递送系统、药物组合物的步骤。
本发明还提供一种预防和/或治疗VEGFR2相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明上述干扰RNA或其递送系统、药物组合物的步骤。
具体地，上述疾病包括，但不限于，癌症、眼部疾病、炎症等。
具体地，上述癌症包括，但不限于，肺癌(如非小细胞肺癌)、肝癌、食管癌、白血病、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤等。
具体地，上述眼部疾病包括，但不限于，增生性糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、单纯疱疹病毒性基质角膜炎、老年黄斑变性、葡萄膜炎、虹膜红变、结膜炎、角膜炎、睑缘炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、黄斑退化和视网膜病等。
本发明还提供一种将本发明上述干扰RNA引入细胞的方法，其包括使该细胞与该干扰RNA的递送系统接触的步骤。
具体地，上述细胞在受试者体内。
具体地，上述使细胞与干扰RNA的递送系统接触的步骤为将干扰RNA的递送系统通过全身途径或局部途径施用至受试者体内来接触所述细胞的步骤。
本发明的发明人通过设计、合成，得到一种干扰RNA(例如，siRNA)，其可有效抑制VEGFR2基因表达，为预防或治疗VEGFR2相关疾病(特别是VEGFR2相关的癌症)提供了新的选择。
附图说明
图1所示为实施例1合成的siRNA正义链质谱图谱。
图2所示为实施例1合成的siRNA反义链的质谱图谱
图3所示为KDR mRNA在细胞中的表达水平结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
如在本文中所使用的术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”包括单链RNA(例如，成熟miRNA、ssRNAi寡核苷酸、ssDNAi寡核苷酸)或双链RNA(即，双链体RNA如siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA、或前体miRNA)，其在当干扰RNA与靶基因或序列处于相同细胞中时，能够降低或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导降解和抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译)。干扰RNA因此是指与靶mRNA序列互补的单链RNA或者由两条互补链或由单条自互补链形成的双链RNA。具体地，干扰RNA分子是化学合成的。
短语“抑制靶基因的表达”是指本发明的干扰RNA(例如，siRNA)沉默、降低、或抑制靶基因(例如，VEGFR2基因)的表达的能力。为了检验基因沉默的程度，使测试样品(例如，来自表达靶基因的目标生物体的生物样品或在培养物中的表达靶基因的细胞的样品)与沉默、降低、或抑制靶基因的表达的干扰RNA(例如，siRNA)接触，将测试样品中靶基因的表达与未与干扰RNA(例如，siRNA)接触的样品中靶基因的表达进行对比，可以将对照样品(例如，表达靶基因的样品)设定为100％的值。在具体的实施方式中，当测试样品相对于对照样品的值为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、10％、5％、或0％时，实现靶基因的表达的沉默、抑制或降低。适合的测定包括但不限于，利用本领域技术人员已知的技术检验蛋白质或mRNA水平，诸如，例如点印迹、Northern印迹、real-time RT-PCR、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能、以及本领域技术人员已知的表型测定。
干扰RNA包括“小干扰RNA”或“siRNA”，siRNA分子的每条链包含长度为约15至约60的核苷酸(例如，长度为约15-60、15-50、15-40、15-30、15-25、或19-25的核苷酸，或者长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25的核苷酸)。在一个具体实施方式中，siRNA是化学合成的。本发明的siRNA分子能够体外和/或体内沉默靶序列的表达。在其他实施方式中，siRNA包含至少一个修饰的核苷酸，例如siRNA在双链区中包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个修饰的核苷酸。
如在本文中所用，术语“dsRNA”或“前体RNAi分子”意在包括在体内由核酸内切酶加工以产生活性siRNA的任何前体分子。
如在本文中所用，术语“小发夹RNA”或“短发夹RNA”或“shRNA”包括产生紧密发夹转角(hairpin turn)的短RNA序列，所述发夹转角可以用于通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA发夹结构可由细胞机器裂解为siRNA。
通常，微RNA(miRNA))是长度为约21-23个核苷酸的调节基因表达的单链RNA分子。
本发明中，术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的活性成分的量：当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据活性成分、待治疗的疾病及其严重程度、以及受试者的年龄、体重、性别等而变化。
本发明中，受试者可以为哺乳动物，如，人类、猴、狗、兔、小鼠、大鼠等；在本发明的一个实施例中，上述受试者为人类。
本发明中，术语“VEGFR2”与“KDR”均代表血管内皮生长因子受体2(VascularEndothelial Growth Factor Receptor 2)，可互换使用。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：siRNA的合成
称取1μmol通用固相支持物3’-胆固醇修饰CPG(Chemgenes产品)，2’-O-TBDMS保护RNA亚磷酰胺的单体溶解于无水乙腈溶液中，使其浓度达到0.2M。配制5-乙硫基-1H-四唑(Chemgenes产品)乙腈溶液作为活化剂(0.25M)，配制0.02M碘的吡啶/水溶液作为氧化剂，以及3％三氯乙酸二氯甲烷溶液作为脱保护试剂，放置于ABI 394型号DNA/RNA自动合成仪对应的试剂指定位置。设置合成程序输入指定的寡聚核苷酸碱基序列，开始循环寡聚核苷酸合成，每步偶合时间6分钟，半乳糖配体对应L和S单体偶合时间10-20分钟。经自动循环后，完成寡核苷酸固相合成。以干燥氮气吹干CPG，转移到5ml EP管中，加入氨水/乙醇溶液(3/1)2ml，55℃加热16～18小时。在10000rpm的转速下离心10min，取上清液，抽干浓氨水/乙醇后得到白色胶状固体。将固体溶于200μl 1M TBAF THF溶液，室温震荡20小时。加入0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，室温震荡15分钟，置于离心抽干机抽至体积为原体积1/2，除去THF。溶液用0.5ml氯仿萃取2次，加入1ml0.1M TEAA上样液，将混合溶液倒入固相萃取柱，在HTCS LC-MS system(Novatia))系统上，完成质谱检测分析。正义链和反义链的质谱图分别如图1和2所示。一级扫描后以Promass软件归一化计算核酸分子量。上述方法分别合成两条单链，质谱鉴定正确后，两条单链以等摩尔比例混合，70℃孵育10min，室温放置20min，退火成双链，即为siRNA。
siRNA正义链序列为：5′-GGAGUGAGAUGAAGAAAUU dTdT-3′
siRNA反义链序列为：5′-AAUUUCUUCAUCUCACUCC dTdT-3′。
实施例2：siRNA的抑制效果
1、细胞培养
细胞名称：293T
a)将293T细胞于DMEM完全培养基在37℃，5％的CO2培养箱常规培养。
b)取50μL OPTI-MEM培养基稀释5μL siRNA(或siRNA NC，浓度20μM)，50μL OPTI-MEM培养基稀释3μL Lipofectamine TM 3000转染试剂，二者混合，轻轻摇匀，静置15min。此外，设置Mock及Blank对照组。
c)各孔加入上述108μL混合液。
d)取对数生长期的293T细胞，以每孔1.2×105细胞接种于12孔板中，每孔体积892μL，最终每孔总体积1000μL。siRNA(或siRNA NC)转染浓度均为100nM。
e)转染24h后将12孔板从37℃，5％CO2的培养箱中取出，用于提取RNA进行后续检测
2、RNA提取
a)Trizol裂解：彻底去除细胞培养液，加入1mL Trizol TM Reagent，移液枪吸打3-5次，让细胞充分裂解，室温放置3～5分钟；
b)加入0.2体积(0.2mL/1mL Trizol)的氯仿，votex震荡15s，室温静置5min；
c)4℃，12000rpm离心15min，出现分层，小心吸取上层水相(水相体积约占Magzol体积的60％)到新的1.5mL离心管中；
d)加入与上清等体积的异丙醇(约0.6mL)，上下颠倒混匀，-20℃沉淀1h以上；
e)4℃，12000rpm离心30min，管底可见白色沉淀，去掉上清；
f)加75％的乙醇1mL，轻轻吹吸使沉淀飘浮，4℃12000rpm离心5min；
g)重复步骤f；
h)去掉上清后短暂离心，使用10μL枪吸干，将离心管盖打开干燥，待沉淀干燥至半透明状即加入适量RNase-free H2O溶解。
I)RNA质检，Nanodrop检测RNA含量，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
3、Q-PCR检测流程
3.1RNA反转录
a)以样品提取的总RNA作为模板，建立如下反应体系：
表1 反应体系
b)将以上体系混匀，离心收集液体至管底，42℃ 60min，72℃ 10min；产物即为cDNA模板。
3.2定量PCR
a)按下表建立反应体系：
表2 反应体系
其中KDR引物和内标基因GAPDH引物序列见表3。
表3 引物序列
b)按如下程序进行PCR扩增：
95℃预变性10min，然后进入如下循环：
*95℃ 10s
60℃ 20s
70℃ 10s
读板
返回*共进行40个循环
制作熔解曲线：70℃至95℃之间，每0.5℃读板一次并停5s。
4、抑制效果
以GAPDH为内标基因，通过ΔΔCt计算KDR mRNA的相对表达量。与转染NC siRNA相比，KDR siRNA对KDR mRNA的抑制率达77％。各组细胞mRNA的表达水平见表4，图3。
表4 mRNA表达水平
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本文描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中，仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
序列表
<110> 北京键凯科技股份有限公司
<120> 一种抑制血管内皮生长因子受体2基因表达的干扰RNA及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggagugagau gaagaaauu 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aauuucuuca ucucacucc 19
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