一种野外条件下收集果树花粉种质资源的方法及密封盒
阅读说明：本技术 一种野外条件下收集果树花粉种质资源的方法及密封盒 (Method for collecting fruit tree pollen germplasm resources under field condition and sealing box ) 是由 吴永杰 李玉生 陈龙 赵艳华 吴雅琴 程和禾 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种野外条件下收集果树花粉种质资源的方法及密封盒。本发明提供的密封盒具有轻便、密封特性,在密封盒的内部空间设有干燥剂,所述干燥剂包括无水氯化钙或硅胶。本发明提供的在野外条件下利用密封盒收集果树花粉种质资源的方法解决了野外艰苦条件下果树等植物花粉种质资源的搜集和活力保持问题,能够在野外条件下简便快速高效收集和保持果树花粉活力。(The invention provides a method for collecting fruit tree pollen germplasm resources under a field condition and a sealing box. The sealing box provided by the invention has the characteristics of portability and sealing, and the drying agent is arranged in the inner space of the sealing box and comprises anhydrous calcium chloride or silica gel. The method for collecting the fruit tree pollen germplasm resources by using the sealing box under the field condition solves the problems of collection and activity maintenance of the fruit tree pollen germplasm resources and other plant pollen germplasm resources under the field hard condition, and can simply, conveniently, quickly and efficiently collect and maintain the activity of the fruit tree pollen under the field condition.)
技术领域
本发明涉及果树花粉种质资源搜集和保存领域，具体涉及一种野外条件下收集果树花粉种质资源的方法及密封盒。
背景技术
植物种质资源是人类社会生存与发展的战略性资源，是维系生物安全的重要保证，是植物进化、遗传学研究及育种的物质基础。植物种质资源大可指植物的种群，小可指植株、根、茎、种子、花粉等，对植物种质资源的收集、保存和利用研究十分重要。但随着城镇化和工业化的高速发展，果树种质资源的安全性仍受到严重威胁，尤其是野生近缘种的丧失令人触目惊心，而且开展种源技术攻关首先解决的问题是种质资源的搜集保护和利用问题，加强对地方品种和野生果树种质资源的收集、保存意义深远。果树的花粉是携带果树遗传信息的重要载体，它不仅含有该物种的所有遗传信息，而且具有丰富的遗传多样性，是种质交换和保存的重要材料。它除了可以使早熟和晚熟品种以及异地亲本实现杂交育种外，还可以在小规模范围内储存多种种质资源，是有效利用珍贵稀有种质的简捷高效途径，因而花粉在果树种质资源的搜集和保护过程中历来受到重视。
果树花粉本身是富含淀粉与脂肪以及某些激素的有生命的颗粒。在自然状态下，花粉寿命不长，以甜樱桃为例发明人采集十个品种的花朵，在室温环境下放置1天后其平均活力损失约40％，放置两天后就有70％的活力丧失。当然果树花粉的活力除取决于其自身的遗传特性外，环境因素特别是温、湿度条件也是主要影响因子。同样以甜樱桃为例，采集花朵后立即剥离花粉，将花粉在室温干燥环境下放置1天，其活力仅损失约10％，放置1周后仍有50％活力保持。而干燥处理的花粉在5度环境下放置1周可保持原有活力的50％以上，在-80度条件下可保存1年，在-196度条件下则可长期保存。但是在野外果树种质资源收集过程中，由于野外环境恶劣，加之条件简陋，因此果树花粉的收集和保存工作困难重重。本发明研究发现，野外采集的花朵，由于条件简陋大多只能先放到采集袋里面，而在野外晴好天气条件下采集的花朵在采集袋内活力丧失是以小时计的。放置2小时活力丧失约20％，放置8小时活力则丧失50％以上。若是碰上雨天后或潮湿条件下，采集的花朵4-6小时后就开始腐烂变质，如图1-2所示。这使得果树种质资源搜集过程中野外采集花粉资源的价值和意义大打折扣甚至变得无效。由于野外果树种质资源搜集工作受到环境和条件的限制，时间、人力及物力的限制较多，不能对花粉进行及时适宜的处理，因此如何在野外环境下收集和保持果树花粉活力成为种质资源搜集工作的一个难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种野外条件下收集果树花粉种质资源的方法及密封盒，该收集方法能够在野外条件下简便快速高效收集和保持果树花粉活力。
具体而言，本发明首先提供一种密封盒，包括：在密封盒的内部空间设有干燥剂，所述干燥剂包括无水氯化钙或硅胶。本发明发现，本发明选取轻便材料和吸水能力高的干燥剂如无水氯化钙等更适合野外艰苦条件；密封盒既便于携带，其后续处理也非常简便，既可以室温放置也可以直接快递邮寄，最大限度的减少了野外处理花朵的需求。
根据本发明提供的的密封盒，所述密封盒的容积为1200～1800cm3，底面积为550～850cm2；所述密封盒优选为密封塑料盒。本发明采用轻薄的密封塑料盒既能保证花朵与干燥剂的充分接触，同时可以更好的固定花朵，减少野外采集活动过程中对花朵的摩擦损伤。优选的，所述密封塑料盒为A4密封塑料盒，所述A4密封塑料盒的长×宽×高为31cm×22.8cm×2.2cm。本发明采用一至两个A4密封塑料盒采集的果树花粉种质资源即可满足授粉和研究用量，大大提高野外果树种质资源的收集效率。
根据本发明提供的的密封盒，所述干燥剂为无水氯化钙。
根据本发明提供的的密封盒，所述干燥剂的重量为180～220g；和/或，所述干燥剂与所述容积的比例为180～220g：1200～1800cm3。
根据本发明提供的的密封盒，所述干燥剂被分为至少两份，其中至少80～95wt％的干燥剂能从密封盒中取出。
根据本发明提供的的密封盒，所述干燥剂的放置方式为平铺放置于密封盒内：优选的，装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放置于密封盒内，在所述尼龙纱网袋与花朵的接触面上放置滤纸；优选所述尼龙纱网袋为500目。本发明采用尼龙网袋和滤纸首先可充分隔离花朵与干燥剂的接触，最大程度减少野外采集携带过程中对花朵造成的摩擦损伤等，此外滤纸可保证干燥剂对花朵的稳定均匀脱水过程，避免出现花朵干燥不均衡对花粉活力造成的影响。
本发明还提供一种野外条件下利用密封盒收集果树花粉种质资源的方法，包括采用所述的密封盒对采集到的花朵进行处理。
根据本发明提供的野外条件下利用密封盒收集果树花粉种质资源的方法，所述花朵以单层方式平铺到密封盒上；优选的，当花朵的含水量降至30～45％时，取出80～95wt％的干燥剂。
本发明中，采集花朵时，优选将花梗留1～2cm。
根据本发明，优选干燥剂为装有无水氯化钙的尼龙纱网袋，所述尼龙纱网袋为400～600目，所述尼龙纱网袋优选设有袋口，尼龙纱网袋中装有200g无水氯化钙；采集的花朵放入密封盒，当花朵的含水量降至30～45％时，保留20g无水氯化钙。
根据本发明提供的野外条件下利用密封盒收集果树花粉种质资源的方法，还包括花粉的收集和保存：取出密封盒内的花朵，手工剥取花药或进行粉碎处理，所述粉碎处理的转速为8000～12000r/min，时间为1～5min，粉碎处理后过30～70目筛，得到花药。
本发明中，优选将所述花药在18～30℃下干燥处理4～6h，然后低温保存；优选的，所述低温保存为-60～-90℃冷藏或液氮中保存。
本发明中，放入密封盒内的花朵可在野外采集过程中随身携带。当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24-36h，随后将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒可采用快递邮到专门单位进行花粉收集后长期保存，也可在驻地室温条件下存放5-6天，等资源收集任务结束后回到单位进行花粉收集后长期保存。
本发明利用上述方法可以快速收集野外果树花粉种质资源，通过对花朵进行简单的处理，最大限度的减少外界环境对花朵和花粉活力的影响。同时该方法具有处理方法简单、体积小和携带方便，可以在较小空间内收集尽可能多的种类的果树种质资源。此外采用本发明收集的果树花粉种质资源的后期处理简单方便，进一步解决了野外种质资源搜集保存过程中由于条件简陋所遭遇的各种难题。
根据本发明提供的野外条件下利用密封盒收集果树花粉种质资源的方法，包括以下步骤：
1)事前材料准备：
A4密封塑料盒，长×宽×高：31cm×22.8cm×2.2cm；
500目尼龙纱网制作的尼龙纱网袋，一个宽边留1/2做袋口，装入200g无水氯化钙，将袋口封住；
将装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放到A4密封盒内，尼龙纱网袋上面放A4纸尺寸的滤纸，密封备用；
2)花朵采集：
于野外采集果树花朵，花梗留1～2cm；打开A4密封盒，将花朵以单层方式平铺到滤纸上，密封保存；
3)花朵的携带和后期处理：
放入密封盒内的花朵在野外采集过程中随身携带；当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24～36h，随后将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒采用快递邮到专门单位进行花粉收集后长期保存，或在驻地室温条件下存放5-6天，收集任务结束后进行花粉的收集和保存；
4)花粉的收集和保存：
将密封盒内的花朵取出，采用手工剥取花药或采用粉碎处理，以10000r/min粉碎2min，将粉碎物过50目筛去除杂质，收集花药；将花药在25℃条件下干燥处理4～6h后，收集花粉并用硫酸纸包好后于-80℃超低温冰箱或液氮中保存备用。
本发明还提供所述的密封盒或所述野外条件下收集果树花粉种质资源的方法，在野外条件下果树花粉种质资源搜集和保存中的应用；优选的，所述果树包括甜樱桃、苹果、梨和草莓中的一种或多种。
本发明的有益效果至少在于：
1.所用材料最少、质量最轻，最大限度减轻野外采集活动对体力的消耗。
2.处理方法简单，将繁琐的工作放到野外收集活动前和活动后进行，减少采集活动中对时间的需求，利于提高野外采集效率。
3.对花朵种质的脱水干燥处理采用吸水能力强的无水氯化钙，且花朵采用单层平铺处理，与干燥剂接触面积大，干燥效果最好。
4.对花朵种质的保护效果最好，除密封效果好外，A4密封盒对单层平铺花朵进行了较好的固定，减少了野外携带过程中对花朵造成的摩擦损伤。
5.便于搜集尽可能多的果树种质资源，从花粉采集量来说，一到两个A4密封盒搜集的果树花粉资源即可满足大部分科研和授粉需求。实现一次野外考察收集最多的果树种质资源。
6.收集到的果树花朵种质便于后期处理，若野外种质资源收集时间短(<6天)，则采集的花朵可于A4密封盒内在驻地室温条件下放置，可待收集活动结束后回到单位进行花粉的收集和保存；若野外种质资源收集时间较长(>6天)，则可将A4密封盒直接采用快递邮寄回单位进行花粉的收集和保存。
7.利用本发明提供的果树花粉种质搜集和保持活力方法既能够提高野外果树种质资源的收集效率，又能够保证果树种质的花粉活力，进而保证收集的效果，可实现一次野外普查，多年多种果树种质研究工作受益的目的，对于果树种质资源的搜集、保存和利用工作具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中需要使用的附图作简单介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中密封袋内放置时间对果树花朵花粉活力的影响图。
图2为本发明中潮湿条件下采集的果树花朵密封袋内室温放置6小时图。
图3为本发明实施方式中野外条件下采集果树花粉种质资源的密封盒图，其中A为密封塑料盒(长╳宽╳高：31cm╳22.8cm╳2.23cm)；B为500m尼龙网袋及袋口；C为采集果树花粉种质资源前备用密封盒(含滤纸、尼龙网袋、200g无水氯化钙)。
图4为本发明实施方式中野外采集的果树花粉种质资源平铺于密封盒内图。
图5为本发明实施例1中野外采集的草莓花朵种质资源在密封盒内放置24小时图。
图6为本发明实施例2中野外采集的甜樱桃花朵种质资源在密封盒内放置6天图。
图7为本发明实施例3中野外采集的苹果花朵种质资源在密封盒内放置7天。
图8为本发明实施对比例2中甜樱桃花朵放置在较大(12L)密封盒内干燥24小时图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
作为本发明的一种优选方案，本发明提供的野外高效收集和保持果树花粉活力的方法，包括如下步骤：
1.事前准备：
A4密封塑料盒(长×宽×高：31cm×22.8cm×2.2cm)；
500目尼龙纱网制作的袋子，一个宽边留二分之一做袋口，野外种质资源收集出发前装入200g无水氯化钙，将袋口用钉书钉封住；
将装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放到A4密封盒内，上面放一张A4纸大小的滤纸，合上密封盒备用。如图3所示，密封盒内从上到下为滤纸、尼龙网袋、网袋内的无水氯化钙。
2.花朵采集：
于野外采集果树大气球期花朵，花梗留1-2cm。打开A4盒，将花朵以单层方式平铺到滤纸上，约250朵花每盒，合上密封盒，放入背包内。如图4所示，野外采集的不同树种果树花粉种质资源平铺于不同密封盒内易于堆叠携带。
3.花朵的携带和后期处理：
放入密封盒内的花朵可在野外采集过程中随身携带。当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24-36小时，随后将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒可采用快递邮到专门单位进行花粉收集后长期保存，也可在驻地室温条件下存放5-6天，等资源收集任务结束后回到单位进行花粉收集后长期保存。
4.花粉的收集和保存
将密封盒内的花朵取出，可采用手工剥取花药；也可采用小型粉碎机，以10000转/分粉碎2分钟，将粉碎物过50目筛去除杂质，收集花药。将花药在25℃条件下恒温干燥处理4-6小时后，收集花粉用硫酸纸包好后于超低温冰箱(-80℃)或液氮中(-196℃)保存备用。
作为本发明的一种优选方案，在密封盒的内部空间内设有干燥剂，所述干燥剂包括无水氯化钙；所述密封盒的容积为1200～1800cm3，底面积为550～850cm2；所述干燥剂的重量为180～220g。所述干燥剂被分为两份，其中80～95wt％的干燥剂能从密封盒中取出。所述干燥剂的放置方式为平铺放置于密封盒内：优选装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放置于密封盒内，在所述尼龙纱网袋与花朵的接触面上放置滤纸；优选所述尼龙纱网袋为500目。
实施例1适用于野外收集和保持草莓花粉活力的方法
本实施例提供一种适用于野外收集和保持草莓花粉活力的方法，具体步骤如下：
1.事前准备：
A4密封塑料盒(长×宽×高：31cm×22.8cm×2.2cm)；
500目尼龙纱网制作的袋子，装入200g无水氯化钙，将袋口用钉书钉封住；
将装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放到A4密封盒内，上面放一张A4纸大小的滤纸，合上密封盒备用。
2.花朵采集：
于冀南太行山区采集草莓大花蕾花朵，花梗留1-2cm。打开A4盒，将花朵以单层方式平铺到滤纸上，约300朵花每盒，合上密封盒，放入背包内。
3.花朵的携带和后期处理：
放入密封盒内的花朵在野外采集过程中随身携带约6小时。当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24小时，花朵的含水量降为32％，将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒采用快递方式寄回单位。如图5所示，在密封盒内放置24小时的草莓花朵种质资源。
4.花粉的收集和保存
将密封盒内的花朵取出，采用手工剥取花药，将花药在25℃条件下恒温干燥处理4小时后，收集花粉测定花粉活力(采集5天后，65.67％)，同时用硫酸纸包好后于液氮中(-196℃)保存备用。
实施例2适用于野外收集和保持甜樱桃花粉活力的方法
本实施例提供一种适用于野外收集和保持甜樱桃花粉活力的方法，具体步骤如下：
1.事前准备：
A4密封塑料盒(长×宽×高：31cm×22.8cm×2.2cm)；
500目尼龙纱网制作的袋子，装入200g无水氯化钙，将袋口用钉书钉封住；
将装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放到A4密封盒内，上面放一张A4纸大小的滤纸，合上密封盒备用。
2.花朵采集：
于燕山秦皇岛山区采集樱桃大气球期花朵，花梗留1-2cm。打开A4盒，将花朵以单层方式平铺到滤纸上，约250朵花每盒，合上密封盒，放入背包内。
3.花朵的携带和处理：
放入密封盒内的花朵在野外采集过程中随身携带约6小时。当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24小时，花朵的含水量降为42％，将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒在驻地室温条件下存放5天。
4.花粉的收集和保存
5天后野外资源搜集结束回到单位后，将密封盒内的花朵取出，采用小型粉碎机，以10000转/分粉碎2分钟，将粉碎物过50m筛去除杂质，收集花药。将花药在25℃条件下恒温干燥处理4小时后，收集花粉测定花粉活力(采集7天后，72.15％)，同时用硫酸纸包好后于液氮中(-196℃)保存备用。如图6所示为在密封盒内放置6天的甜樱桃花朵种质资源。
实施例3适用于野外收集和保持苹果花粉活力的方法
本实施例提供一种适用于野外收集和保持苹果花粉活力的方法，具体步骤如下：
1.事前准备：
A4密封塑料盒(长×宽×高：31cm×22.8cm×2.2cm)；
500目尼龙纱网制作的袋子，装入200g无水氯化钙，将袋口用钉书钉封住；
将装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放到A4密封盒内，上面放一张A4纸大小的滤纸，合上密封盒备用。
2.花朵采集：
于燕山秦皇岛山区采集苹果大气球期花朵，花梗留1-2cm。打开A4盒，将花朵以单层方式平铺到滤纸上，约200朵花每盒，合上密封盒，放入背包内。
3.花朵的携带和处理：
放入密封盒内的花朵在野外采集过程中随身携带约6小时。当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24小时，将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒在驻地室温条件下存放5天。
4.花粉的收集和保存
5天后野外资源搜集结束回到单位后，将密封盒内的花朵取出，采用手工剥离花药。将花药在25℃条件下恒温干燥处理4小时后，收集花粉测定花粉活力(采集7天后，81.4％)，同时用硫酸纸包好后于液氮中(-196℃)保存备用。如图7所示为在密封盒内放置7天的苹果花朵种质资源。
实施例4适用于野外收集和保持梨树花粉活力的方法
本实施例提供一种适用于野外收集和保持梨花粉活力的方法，具体步骤如下：
1.事前准备：
A4密封塑料盒(长×宽×高：31cm×22.8cm×2.2cm)；
500目尼龙纱网制作的袋子，装入200g无水氯化钙，将袋口用钉书钉封住；
将装有无水氯化钙的尼龙纱网袋平铺放到A4密封盒内，上面放一张A4纸大小的滤纸，合上密封盒备用。
2.花朵采集：
于冀南太行山区采集梨大气球期花朵，花梗留1-2cm。打开A4盒，将花朵以单层方式平铺到滤纸上，约200朵花每盒，合上密封盒，放入背包内。
3.花朵的携带和后期处理：
放入密封盒内的花朵在野外采集过程中随身携带约6小时。当天资源收集结束回到驻地后，将密封盒在室温放置24小时，花朵的含水量降为45％，将密封盒内尼龙网袋内的无水氯化钙取出，仅剩20g无水氯化钙，重新盖上盒子。密封盒采用快递方式寄回单位。
4.花粉的收集和保存
将密封盒内的花朵取出，采用手工剥取花药，将花药在25℃条件下恒温干燥处理4小时后，收集花粉测定花粉活力(采集5天后，75.4％)，同时用硫酸纸包好后于液氮中(-196℃)保存备用。
对比例1
对花朵的花粉活力进行连续观察发现，在野外田间晴好天气下采集的甜樱桃花朵，在密封袋内放置2小时活力丧失约20％，放置8小时活力则丧失50％以上(如图1所示)。
若是碰上雨天后或潮湿条件下，在野外田间采集的花朵在密封袋内放置4-6小时后就开始腐烂变质(如图2所示)。
对比例2
在野外采集的甜樱桃花朵，在较大密封盒(12L，400g变色硅胶，40g花朵)内放置24小时，由于空间较大，花朵干燥速度慢，干燥不均一，导致花朵花瓣张开散粉，不利于花粉活力的保持和花粉收集工作。(如图8所示)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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