一种高纯度番泻苷的制备方法及其制备的番泻苷或衍生物
阅读说明：本技术 一种高纯度番泻苷的制备方法及其制备的番泻苷或衍生物 (A method for preparing high purity sennoside and sennoside or its derivatives ) 是由 吴佳佳 池玉梅 谈悦 杨兴乐 王建强 袁玉 俞恒 傅和亮 于 2021-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高纯度番泻苷的制备方法及其制备的番泻苷或衍生物。所述的制备方法包括以下步骤：(1)药材提取；(2)离子交换柱层析：离子交换层析柱使用3-5倍柱体积平衡液A平衡；将步骤(1)中得到的调酸上清液上样层析柱,并用3-5倍柱体积平衡液A复平衡,再使用3-5倍柱体积洗脱液B洗脱,得洗脱液；(3)大孔吸附柱层析：将步骤(2)得到的洗脱液调节pH至3.5-8.0,随后将洗脱液上样大孔吸附层析柱,用3-5倍柱体积洗脱液E洗脱,得洗脱液；(4)将步骤(3)得到的洗脱液低温沉淀以及固液分离,得到番泻苷A/B化合物的提取物。本发明利用大孔吸附层析柱与离子交换柱层析纯化番泻苷,得到的番泻苷提取物纯度高,且成本低更环保。(The invention discloses a preparation method of high-purity sennoside and sennoside or a derivative prepared by the same. The preparation method comprises the following steps: (1) extracting medicinal materials; (2) ion exchange column chromatography: balancing the ion exchange chromatography column by using 3-5 times of column volume balancing liquid A; loading the acid-adjusted supernatant obtained in the step (1) to a chromatographic column, rebalancing with a 3-5 times column volume balancing solution A, and eluting with a 3-5 times column volume eluent B to obtain an eluent; (3) macroporous adsorption column chromatography: adjusting the pH of the eluent obtained in the step (2) to 3.5-8.0, loading the eluent into a macroporous adsorption chromatographic column, and eluting with eluent E with the volume 3-5 times of the column volume to obtain eluent; (4) and (4) carrying out low-temperature precipitation and solid-liquid separation on the eluent obtained in the step (3) to obtain the extract of the sennoside A/B compound. The sennoside is purified by using a macroporous adsorption chromatographic column and an ion exchange column, and the obtained sennoside extract has high purity, low cost and environmental protection.)
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种高纯度番泻苷的制备方法及其制备的番泻苷或衍生物。
背景技术
番泻叶(Folium sennae)中主要活性成分为蒽醌类衍生物。蒽醌类衍生物中的二蒽酮类衍生物番泻苷A、B、C、D的泻下作用及刺激性较其他含蒽醌类的泻药更强，且口服用药毒性很小，临床常用于急性便秘。二蒽酮类化合物是由二分子蒽酮C-C相互连接而成的，其中番泻苷A与B、番泻苷C与D互为立体异构体。番泻苷对肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。此外，番泻苷还有胰岛素增敏和α-葡萄糖淀粉酶抑制的作用。顾燕等用大孔树脂纯化番泻苷，通过该方法制备的番泻苷含量达50％，番泻总苷含量达50％以上，但是该方法的操作程序复杂且沸水提取容易造成番泻苷降解，且由于番泻苷稳定性差，遇热遇光易分解，转变成单蒽酮类成分，运用常规的萃取及大孔吸附层析等方法难以高效率的提取该成分。张阳等以番泻苷A含量为指标，研究提取番泻叶中二蒽酮的工艺条件，得到总番泻苷含量47.2％的产物，产率为2.93％，但是该方法使用有机溶剂正丁醇和乙醇，成本较高且不环保。专利CN105254689A公开了一种番泻苷A·B盐化合物及其制备方法和用途，以番泻叶为原料，得到高纯度有效成分番泻苷A·B盐化合物，纯度达到80～90％之间，该方法同样步骤较为繁琐，且最后一步纯化过程中使用丙酮、甲醇等毒性较强的有机溶剂。
现有技术中番泻叶中药通常是以汤剂或者颗粒剂的形式服用，汤剂的煎煮比较麻烦，落后，剂量大，且不能起到急救作用。目前的番泻苷纯化方法不能满足现有的要求。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种高纯度番泻苷的制备方法及其制备的番泻苷或衍生物。该制备方法基于大孔吸附层析柱与离子交换柱层析来纯化番泻苷，最终得到的番泻苷提取物纯度和收率优于现有技术，且成本低更环保。
技术方案：本发明所述的一种高纯度番泻苷制备方法，包括如下步骤：
(1)药材提取：将番泻叶药材加入碳酸氢钠溶液搅拌浸泡60-120min后过滤，得提取液，加酸调节pH为2.5-5.5，过滤留上清液，再次调节上清液的pH和电导率，得到调酸上清液；
(2)离子交换柱层析：离子交换层析柱使用3-5倍柱体积平衡液A平衡，并用3-5倍柱体积平衡液A复平衡；将步骤(1)中得到的调酸上清液上样层析柱，再使用3-5倍柱体积洗脱液B洗脱，得洗脱液；
所述的平衡液A为0.02-0.2mol/L的醋酸盐缓冲液、0.02-0.2mol/L甘氨酸缓冲液、0.02-0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.02-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述的平衡液A中还含有0.0001-0.3mol/L NaCl溶液，所述平衡液A的pH为3.5-10.0；
所述的洗脱液B为0.02-0.2mol/L醋酸盐溶液、0.02-0.2mol/L甘氨酸缓冲液、0.02-0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.02-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述的洗脱液B中还含有0.3-1.5mol/L NaCl，pH为3.5-10.0；
(3)大孔吸附柱层析：将步骤(2)得到的洗脱液调节pH至3.5-8.0，随后将洗脱液上样大孔吸附层析柱，用3-5倍柱体积冲洗液C冲洗，再用1-5倍柱体积冲洗液D冲洗，随后用3-5倍柱体积洗脱液E洗脱，得洗脱液；
所述的冲洗液C为0.001-0.2mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液、0.001-0.2mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液或0.001-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH为3.5-8.0；所述的冲洗液D为纯水；所述的洗脱液E为20％-80％乙醇溶液；
(4)将步骤(3)得到的洗脱液低温沉淀以及固液分离，得到番泻苷A/B化合物的提取物。
作为一种优选实施方式，步骤(4)中，所述的低温沉淀包括以下步骤：减压浓缩，加酸，低温静置沉淀，得到浓缩沉淀液；所述的固液分离包括以下步骤：将得到的浓缩沉淀液进行固液分离，固体用无水乙醇脱水2-3次，弃去上清液，沉淀干燥。
作为一种优选实施方式，步骤(1)中，所述的提取液调节pH至3.0-5.5，调节pH所用的酸为盐酸、醋酸或者磷酸；所述的调酸上清液的pH为3.5-10.0，所述的调酸上清液的电导率为0.5-29mS/cm。
作为一种
具体实施方式
，步骤(1)中，所述的调酸上清液的pH为3.5，电导调节至20mS/cm；或者所述的调酸上清液的pH为7.0，电导率为15mS/cm；或者所述的调酸上清液的pH为10.0，电导率为7mS/cm。
作为一种优选实施方式，步骤(2)中，所述的离子交换层析柱填料的配基为二乙胺乙基或者三甲胺基烷基季铵基的阴离子交换层析填料，所述的离子交换层析柱的填料主体构架为丙烯酸系或苯乙烯系中的任意一种。
作为一种优选实施方式，所述离子交换树脂的型号为A313型、A313FC型、D620型、D630型、D640型、A351型或A451型。
作为一种优选实施方式，步骤(2)中，所述平衡液A选自以下任一种：含有0.015-0.025mol/L的甘氨酸缓冲液与0.015-0.25mol/L NaCl溶液的平衡液、含有0.015-0.025mol/L磷酸盐缓冲液与0.010-0.20mol/L NaCl溶液的平衡液以及含有0.15-0.25mol/L碳酸氢钠缓冲液与0.010-0.15mol/L NaCl溶液的平衡液。
作为一种具体实施方式，所述的平衡液A为0.02mol/L的甘氨酸缓冲液与0.2mol/LNaCl溶液的混合液，pH为3.5，导电率为23mS/cm。
作为一种具体实施例，所述的平衡液A为0.02mol/L磷酸盐缓冲液与0.15mol/LNaCl溶液的混合液，pH为7.0，导电率为18mS/cm。
作为一种具体实施方式，所述的平衡液A为0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液与0.1mol/LNaCl溶液的混合液，pH为10.0，电导率为11mS/cm。
作为一种优选实施方式，步骤(1)中的调酸上清液的电导率小于步骤(2)中的平衡液A的电导率3-4mS/cm。
作为一种优选实施方式，步骤(2)中，所述的洗脱液B选自以下任一种：含有0.015-0.025mol/L甘氨酸缓冲液与0.3-1.2mol/L NaCl溶液的洗脱液、含有0.015-0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液与0.3-1.5mol/L NaCl溶液的洗脱液、含有0.15-0.25mol/L碳酸氢钠缓冲液与0.3-1.0mol/L NaCl溶液的洗脱液。
作为一种具体实施方式，所述的洗脱液B为0.02mol/L甘氨酸缓冲液与1.0mol/LNaCl溶液的混合液，pH为3.5，电导率为93mS/cm。
作为一种具体实施方式，所述的洗脱液B为0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液与1.2mol/LNaCl溶液的混合液，pH为7.0，电导率为108mS/cm。
作为一种具体实施方式，所述的洗脱液B为0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液与0.8mol/LNaCl溶液的洗脱液的混合液，pH为10.0，电导率为70mS/cm。
作为一种优选实施方式，步骤(3)中，所述的大孔吸附层析柱填料的主体架构为大孔交联聚苯乙烯吸附树脂，型号为HB-16型、HB-60型、HB-80型、D101型或D201型。
作为一种优选实施方式，步骤(3)中，所述的洗脱液E为30-80％乙醇溶液。
作为一种具体实施方式，所述的冲洗液C为0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH为5.5。
作为一种具体实施方式，所述的冲洗液C为0.001mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH为3.5。
作为一种具体实施方式，所述的冲洗液C为0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH为7.0。
作为一种优选实施方式，所述的加酸为加入盐酸、醋酸或者磷酸，调节pH至2-3；所述的低温静置的温度为-20℃-4℃。
作为一种优选实施方式，步骤(3)中，冲洗液D为纯水，冲洗体积为1-3个柱体积。
本发明还提供了由上述制备方法制备的番泻苷；通过本发明的制备方法制备的番泻苷A/B的纯度在85％-90％之间。
本发明制备方法得到的番泻苷A/B化合物(番泻苷A和B互为立体异构体)，具有以下结构：
本发明还提供了一种番泻苷钙盐的制备方法，包括以下步骤：
将上述步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行固液分离，固体用纯水洗涤，去上清液，沉淀与含钙离子的化合物混合，进行成盐反应并减压干燥，得到番泻苷A/B钙盐化合物。
作为一种优选实施方式，钙盐反应中加入适量水；所述钙盐反应加水量为步骤(4)加酸溶液的体积。
作为一种优选实施方式，所述含钙离子的化合物优选包括氢氧化钙、碳酸钙、氯化钙中的一种或几种。
作为一种优选实施方式，所述加入含钙离子化合物的量为步骤(1)中番泻叶药材中所含番泻苷A和番泻苷B总和的0.7-1.2摩尔当量，优选0.9摩尔当量。
作为一种优选实施方式，所述减压干燥的温度为55℃-80℃，优选70℃。
除非另有说明，本发明中“％”为质量百分含量。
有益效果：(1)本发明提供了基于离子交换层析和大孔吸附层析纯化番泻苷的方法，经过多次重复实验验证，该方法的工艺稳定，利于工业化、规模化生产，可以很好的特征性的将番泻苷A/B分离纯化，每批次目标产品收率均高于50％，纯度高于85％，易于放大生产；(2)本发明解决了番泻苷A/B与番泻叶中其他蒽醌类杂质理化性质相似，运用常规的有机溶剂萃取方法无法将番泻苷A/B特征性的纯化出来的缺点，通过氯化钠盐特征性的洗脱出番泻苷A/B，且解决了有机溶剂成本较高且不环保的缺点；(3)本发明的离子交换层析和大孔树脂相结合的手段操作简单，成本低，分离效果好，可高效获得目标产物；(4)本发明采用离子交换层析和大孔吸附层析相结合的方法进行番泻苷的分离纯化，且所得提取物纯度高，使用方便。
附图说明
图1为本发明实施例1钙盐化合物的HPLC的分析图谱。
具体实施方式
实施例1：(1)药材提取：取100g番泻叶药材(其中番泻苷A+番泻苷B含量为1.25％)加入8倍(g/mL)0.1％碳酸氢钠溶液搅拌提取60min后过滤，留上清液作为提取液(提取液取样检测)，加入6mol/L HCl调节pH至3.0，去除部分杂质，过滤留上清液，加入氯化钠调节电导率至20mS/cm，加入5mol/L NaOH调节pH为3.5，得到上样液(调酸上样液取样检测)；
(2)离子交换柱层析：预先装A451型(ZG A451型，杭州争光树脂有限公司)大孔弱碱性阴离子交换层析柱300mL，用平衡液A以线性速度60cm/h平衡5倍柱体积，平衡液A为0.02mol/L甘氨酸缓冲液，含有0.2mol/L NaCl，pH为3.5，电导率为23mS/cm，再将步骤(1)中的上样液以线性速度60cm/h上样层析柱。上样结束后先用平衡液A以线性速度60cm/h冲洗4倍柱体积，再用5倍柱体积洗脱液B以线性速度40cm/h冲洗柱子，洗脱液B为0.02mol/L甘氨酸缓冲液，含有1.0mol/L NaCl，pH为3.5，电导率为93mS/cm。收集洗脱液(洗脱液1取样检测)，调节pH至4.0，准备上D101柱。
(3)大孔吸附柱层析：预先装D101型(上海旻永实业有限公司)大孔吸附层析柱100mL，将步骤(2)中的上样液以线性速度40cm/h上样层析柱，上样结束后先用冲洗液C以线性速度40cm/h冲洗4倍柱体积，后用3倍柱体积纯水(冲洗液D)以线性速度40cm/h冲洗柱子，再用5倍柱体积洗脱液E以线性速度40cm/h冲洗柱子，冲洗液C为0.001mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH为3.5，洗脱液E为30％乙醇溶液；收集洗脱液(洗脱液2取样检测)。
(4)低温沉淀：将步骤(3)中的洗脱液在温度为60℃、真空度为-0.08MPa条件下减压浓缩1小时，将得到的浓缩物用6mol/L HCl调节pH至2.0，4℃放置过夜。
(5)固液分离：将步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行4000rpm离心10min，固体用10mL无水乙醇脱水两次，弃去上清液，沉淀干燥即得高纯度番泻苷A/B化合物的粉末状提取物。
番泻苷钙盐的制备：将本实施例的步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行4000rpm离心10min，得到的固体用10mL纯化水洗涤两次，弃去上清液，沉淀加入80mg氯化钙混合，加入与步骤(4)中与6mol/L HCl等体积的水，将得到的混合物在温度为55℃、真空度为-0.08MPa下进行成盐反应并减压干燥30min，得到番泻苷A/B钙盐化合物(钙盐化合物取样检测，检测HPLC图谱见图1)。检测结果见表1。
表1本发明实施例1的检测结果
名称
苷A含量
苷B含量
苷A+苷B总含量
收率
提取液
11.00％
12.41％
23.41％
88.20％
调酸上样液
10.08％
12.57％
22.65％
88.20％
洗脱液1
28.93％
36.71％
65.64％
98.93％
洗脱液2
27.66％
38.68％
66.34％
96.44％
钙盐化合物
29.76％
55.48％
85.24％
95.57％
实施例2：(1)药材提取：取100g番泻叶药材(其中番泻苷A+番泻苷B含量为1.23％)加入10倍(g/mL)0.25％碳酸氢钠溶液搅拌提取90min后过滤，留上清液作为提取液(提取液取样检测)，加入冰醋酸调节pH至4.5，过滤留上清液，加入氯化钠调节电导至15mS/cm，加入5mol/L NaOH调节pH为7.0，得到上样液(调酸上样液取样检测)；
(2)离子交换柱层析：预先装A351型(ZG A351型，杭州争光树脂有限公司)大孔弱碱性阴离子交换层析柱300mL，用平衡液A以线性速度60cm/h平衡5倍柱体积，平衡液A为0.02mol/L磷酸盐缓冲液，含0.15mol/L NaCl，pH为7.0，电导率为18mS/cm，再将步骤(1)中的上样液以线性速度60cm/h上样层析柱。上样结束后先用平衡液A以线性速度60cm/h冲洗4倍柱体积，再用5倍柱体积洗脱液B以线性速度40cm/h冲洗柱子，洗脱液B为0.02mol/L磷酸盐缓冲液，含1.2mol/L NaCl，pH为7.0，电导率为108mS/cm。收集洗脱液(洗脱液1取样检测)，调节pH至6.0。
(3)大孔吸附柱层析：预先装HB-16(上海旻永实业有限公司)大孔吸附层析柱100mL，将步骤(2)中的上样液以线性速度40cm/h上样层析柱，上样结束后先用冲洗液C以线性速度40cm/h冲洗4倍柱体积，后用3倍柱体积纯水(冲洗液D)以线性速度40cm/h冲洗柱子，再用5倍柱体积洗脱液E以线性速度40cm/h冲洗柱子，冲洗液C为0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH为5.5，洗脱液E为80％乙醇溶液；收集洗脱液(洗脱液2取样检测)。
(4)低温沉淀：将步骤(3)中的洗脱液在温度为60℃、真空度为-0.08MPa条件下减压浓缩1小时，将得到的浓缩物用6mol/L HCl调节pH至2.5，-10℃放置过夜。
(5)固液分离：将步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行4000rpm离心10min，固体用10mL无水乙醇脱水两次，弃去上清液，沉淀干燥即得高纯度番泻苷A/B化合物的粉末状提取物。
番泻苷钙盐的制备：将本实施例步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行4000rpm离心10min，固体用10mL纯化水洗涤两次，弃去上清液，沉淀加入142mg碳酸钙混合，加入与步骤(4)中与6mol/L HCl等体积的水，将得到的混合物在温度为80℃、真空度为-0.08MPa下进行成盐反应并减压干燥40min，得到番泻苷A/B钙盐化合物(钙盐化合物取样检测)。检测结果见表2。
表2本发明实施例2的检测结果
实施例3：(1)药材提取：取1000g番泻叶药材(其中番泻苷A+番泻苷B含量为1.15％)加入10倍(g/mL)0.25％碳酸氢钠溶液搅拌提取120min后过滤，留上清液作为提取液(提取液取样检测)，加入6mol/L HCl调节pH至5.5，过滤留上清液，加入氯化钠调节电导至7mS/cm，加入5mol/L NaOH调节pH为10.0，得到上样液(调酸上样液取样检测)；
(2)离子交换柱层析：预先装A313型(ZG A313型，杭州争光树脂有限公司)大孔弱碱性阴离子交换层析柱1500mL，用平衡液A以线性速度60cm/h平衡5倍柱体积，平衡液A为0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液，含0.1mol/L NaCl，pH为10.0，电导率为11mS/cm，再将步骤(1)中的上样液以线性速度60cm/h上样层析柱。上样结束后先用平衡液A以线性速度60cm/h冲洗4倍柱体积，再用5倍柱体积洗脱液B以线性速度40cm/h冲洗柱子，洗脱液B为0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液，含0.8mol/L NaCl，pH为10.0，电导率为70mS/cm。收集洗脱液(洗脱液1取样检测)，调节pH至8.0。
(3)大孔吸附柱层析：预先装HB-60(上海旻永实业有限公司)大孔吸附层析柱1000mL，将步骤(2)中的上样液以线性速度40cm/h上样层析柱，上样结束后先用冲洗液C以线性速度40cm/h冲洗4倍柱体积，后用3倍柱体积纯水(冲洗液D)以线性速度40cm/h冲洗柱子，再用5倍柱体积洗脱液E以线性速度40cm/h冲洗柱子，冲洗液C为0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH为7.0；洗脱液E为60％乙醇溶液；收集洗脱液(洗脱液2取样检测)。
(4)低温沉淀：将步骤(3)中的洗脱液在温度为60℃、真空度为-0.08MPa条件下减压浓缩8小时，将得到的浓缩物用冰醋酸调节pH至3.0，-20℃放置过夜。
(5)固液分离：将步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行4000rpm离心10min，固体用50mL无水乙醇脱水两次，弃去上清液，沉淀干燥即得高纯度番泻苷A/B化合物的粉末状提取物。
番泻苷钙盐的制备：将本实施例的步骤(4)中得到的浓缩沉淀液进行4000rpm离心10min，固体用50mL纯化水洗涤两次，弃去上清液，沉淀沉淀加入1180mg氢氧化钙混合，加入与步骤(4)中与冰醋酸等体积的水，将得到的混合物在温度为80℃、真空度为-0.08MPa下进行成盐反应并减压干燥90min，得到番泻苷A/B钙盐化合物(钙盐化合物取样检测)。检测结果见下表3
表3本发明实施例3的检测结果
名称
苷A含量
苷B含量
苷A+苷B总含量
收率
提取液
12.09％
15.11％
27.20％
96.65％
调酸上样液
11.01％
14.85％
25.86％
96.01％
洗脱液1
30.69％
36.31％
67.00％
92.27％
洗脱液2
30.14％
38.02％
68.16％
93.26％
钙盐化合物
40.18％
50.49％
90.67％
90.13％