一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷a、甜菊苷和甜菊多酚的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷a、甜菊苷和甜菊多酚的方法及其应用 (Method for extracting rebaudioside A, stevioside and stevia rebaudiana polyphenol from stevia rebaudiana and application of method ) 是由 范斌 张宝堂 谭家忠 廖娜 雷桂芳 于 2021-10-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法及其应用,提取方法包括,向热水浸提甜叶菊粉末后得到的浸提液中加入饱和石灰水调节pH,静置沉淀后,离心分离；将离心后的上清液进行后处理得到甜菊糖苷粗品,随后加入正丙醇后加热并趁热过滤,分别纯化滤液和滤饼得到甜菊苷和莱鲍迪苷A；将离心后的沉淀加稀盐酸溶解并调pH后离心,取上清液用聚酰胺树脂纯化得到甜菊多酚。本发明通过利用莱鲍迪苷A和甜菊苷在正丙醇里面具有不同溶解性的特点,能高效率分离甜菊糖苷里面的两个主要成分；采用80％以上纯度的莱鲍迪苷A粗品进行结晶能缩短纯化时间,避免直接结晶时莱鲍迪苷A部分溶解于母液而未能使其充分析出,且能得到含量在95％以上的甜菊苷。(The invention discloses a method for extracting rebaudioside A, stevioside and stevia rebaudiana polyphenol from stevia rebaudiana and application thereof, wherein the extraction method comprises the steps of adding saturated limewater into a leaching solution obtained after leaching stevia rebaudiana powder by hot water to adjust the pH value, standing for precipitation, and performing centrifugal separation; carrying out post-treatment on the centrifuged supernatant to obtain a stevioside crude product, adding n-propanol, heating, filtering while hot, and respectively purifying the filtrate and the filter cake to obtain stevioside and rebaudioside A; and adding dilute hydrochloric acid into the centrifuged precipitate to dissolve, adjusting the pH value, centrifuging, taking the supernatant, and purifying with polyamide resin to obtain the stevia polyphenol. The method has the advantages that the characteristics of different solubilities of rebaudioside-A and stevioside in n-propanol are utilized, so that two main components in the stevioside can be separated efficiently; the rebaudioside A crude product with the purity of more than 80% is adopted for crystallization, so that the purification time can be shortened, the rebaudioside A is prevented from being partially dissolved in mother liquor during direct crystallization and being not fully separated out, and stevioside with the content of more than 95% can be obtained.)
技术领域
本发明涉及植物有效成分的提取技术领域，更具体地，涉及一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法及其应用。
背景技术
随着蔗糖消费量的增加所导致的严重的健康问题，低卡路里的甜味剂越来越受到消费者们的推崇。
甜菊糖苷是富含于甜叶菊(Stevia reabudiana Bertoni)茎叶中的一组甜味物质，其主要成分为莱鲍迪苷A(RA)和甜菊苷(STV)，约占甜菊糖苷的90wt％。甜菊糖苷安全无毒、理化性质稳定，是一类高甜度、低热值的甜味剂，在满足甜味需求的同时还可以减少糖尿病、肥胖症的发生率，起到肾保护及促进口腔健康的作用。除了作为天然甜味剂的显著优势外，STV和RA还具有降血糖、促进胰岛素和胰高血糖素分泌、降低血压和增强免疫等作用，并且在酿酒、饮料、化工和医药等行业也有着广泛的应用。
由于STV和RA具有相同的苷元，RA在C13位上的氧苷键上比 STV多一个葡萄糖基，其结构和极性也非常接近，给分离工作带来了一定的难度。
现有技术中，甜菊糖苷普遍采用的分离纯化方法主要包括：重结晶法、柱层析法、制备色谱法、分子印迹法和高速逆流色谱法。
公开号为CN111777652A的中国发明专利申请公开了一种从甜叶菊中提取甜菊苷和莱鲍迪苷A的方法，该方法使用1，2-丙二醇、甘油和水组成的天然低共熔溶剂对甜叶菊进行提取，该法相比较于水提和醇提，能大大提高甜菊苷和莱鲍迪苷A的浸出率；然而，该发明专利申请并没有公开如何对提取液进行进一步的分离。
公开号为CN103483402A的中国发明专利申请公开了一种甜菊苷及莱鲍迪苷A的提纯制备方法，该方法将甜叶菊依次经过醇提取、大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和重结晶等步骤，得到了含量在98％以上的甜菊苷和莱鲍迪苷A；然而，该发明专利申请保护的方法大量使用有毒有害溶剂，且硅胶柱层析仅适合实验室少量制备。
公开号为CN104098734A的中国发明专利申请公开了一种苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法及其在莱鲍迪苷A和甜菊苷分离中的应用，该树脂能对甜菊糖苷中的莱鲍迪苷A进行选择性吸附，所得莱鲍迪苷A和甜菊苷的纯度和回收率均较高；然而，该发明专利申请保护的方法制备的树脂工艺复杂，且没有量产以达到工业生产的需求。
综上所述，现有技术所公开的方法大多存在溶剂耗费量大、耗时长、工艺复杂、设备昂贵、可处理样品太少和不适合工业化生产等缺点。因此，研究开发一种对甜菊糖苷中的主成分莱鲍迪苷A和甜菊苷进行分离的方法迫在眉睫。
此外，在甜叶菊提取物中，甜菊糖苷为主要产品，而甜菊多酚是甜菊糖苷提取过程中的副产物。提取甜菊糖苷时，通常用铁盐和钙盐来络合除杂，这不仅将甜菊多酚一起并入废渣，更糟糕的是，同时也会产生较多的有机无机混杂的固体废料。
甜菊多酚包括绿原酸类、黄酮类、黄酮醇类、黄烷醇类、异黄酮类和原花青素等，目前报道的具有明确结构的甜菊多酚至少有30多种。甜菊多酚多为水溶性多酚化合物，具有良好且稳定的游离基清除能力，也具有抗炎、利尿、抗高血压、降血糖、抗肿瘤和抗氧化性能，此外，还具有降压降血脂的功效。如果能在得到高纯度的主产物莱鲍迪苷A 和甜菊苷的同时，得到高纯度甜菊多酚，那就大大提高了甜叶菊的综合利用价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明提供了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法，包括，
向热水浸提甜叶菊粉末后得到的浸提液中加入饱和石灰水调节 pH，静置沉淀后，离心分离；
将离心分离后得到的上清液进行后处理得到甜菊糖苷粗品，随后加入正丙醇后加热并趁热过滤，并分别将滤液和滤饼纯化得到甜菊苷和莱鲍迪苷A；
将离心分离后得到的沉淀通过稀盐酸溶解并调节pH为4.0-6.5后，离心分离，取上清液用聚酰胺树脂纯化后得到甜菊多酚。
在上述技术方案中，所述饱和石灰水的加入量为将浸提液的pH调节为8.5-11.0。
在上述技术方案中，在加入饱和石灰水并调节pH后，所述静置的时间为0.5-2.0h。
在上述技术方案中，对应于1g甜叶菊粉末，所述正丙醇的加入量为0.5-0.8ml。
在上述技术方案中，加入正丙醇后加热的温度和保温时间分别为 50-65℃和3-5min。
进一步地，在上述技术方案中，所述后处理包括，将上清液上非极性大孔树脂柱，先用去离子水冲洗直至流出液为中性，随后用乙醇水溶液冲洗并收集洗脱液，减压浓缩回收乙醇后进一步浓缩，直至得到膏状甜菊糖苷粗品。
在本发明的
具体实施方式
中，所述非极性大孔树脂柱为D101、 AB-8和HP20大孔树脂柱中的一种。
在本发明的具体实施方式中，所述上清液上大孔树脂柱的流速控制为0.5-1.5BV/h。
在本发明的具体实施方式中，所述乙醇水溶液的浓度为60-75 wt％，且所述乙醇水溶液的用量和冲洗流速分别为3-5BV和1-2BV/h。
再进一步地，在上述技术方案中，所述纯化得到甜菊苷的过程包括，用常温状态下的去离子水洗涤滤饼，将滤液与得到的洗涤液合并后，浓缩干燥，即可。
再进一步地，在上述技术方案中，所述纯化得到莱鲍迪苷A的过程包括，将滤饼用50-80wt％的乙醇水溶液加热溶解后，在低温条件下结晶，并依次经过滤、水洗和干燥后，即可。
在本发明的具体实施方式中，对应于1g甜叶菊粉末，用于加热溶解滤饼的乙醇水溶液的用量为0.05-0.5ml。
在本发明的具体实施方式中，所述结晶的温度和时间分别为 4-10℃和6-12h。
又进一步地，在上述技术方案中，用于溶解沉淀的所述稀盐酸的浓度为0.5-1.5mol/L。
又进一步地，在上述技术方案中，用聚酰胺树脂纯化所述上清液的过程包括，将离心分离后的上清液上聚酰胺树脂柱，先后用去离子水和乙醇水溶液洗脱，弃去上柱流出液和水洗液，收集醇洗液，将醇洗液浓缩并干燥后即可。
在本发明的一个优选实施方式中，所述去离子水的用量和洗脱流速分别为4-6BV和1-3BV/h。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述乙醇水溶液的浓度为50-70wt％，且所述乙醇水溶液的用量和洗脱流速分别为3-5BV和1-3 BV/h。
还进一步地，在上述技术方案中，热水浸提甜叶菊粉末得到所述浸提液的过程包括，将甜叶菊粉末按料液比为1g：5-20ml的比例加入到去离子水中，在70-90℃下保温提取1-3h，相同条件下提取2-3 次后合并浸提液即可。
本发明另一方面还提供了上述方法在提取甜叶菊中的莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明通过利用莱鲍迪苷A和甜菊苷在正丙醇里面具有不同溶解性的特点，对甜菊糖苷里面的两个主要成分进行分离，具有较高的效率；
(2)相比较于将甜菊糖苷直接使用溶剂进行结晶，本发明所提供的方法采用80％以上纯度的莱鲍迪苷A粗品进行结晶，能大大缩短纯化所需的时间，提高了单位时间内目标成分的产量，能避免直接结晶时莱鲍迪苷A部分溶解于母液而未能使其充分析出，且能得到含量在 95％以上的甜菊苷；
(3)本发明所提供的方法往甜叶菊浸提液中加入饱和石灰水进行沉淀，可有效去除浸提液中的部分杂质，提高了浸提液离心分离后的上清液中莱鲍迪苷A和甜菊苷的含量，且大孔树脂层析时在水洗后无需再用碱去除酸性物质，得到的甜菊糖苷中莱鲍迪苷A和甜菊苷的含量更高，便于后续纯化；
(4)本发明所提供的方法工艺连贯且简单，可操作性强，生产成本低，所得产品回收率和纯度高，不使用有毒有害化工溶剂，安全环保，适合工业化生产，且能对甜叶菊起到了一个综合利用的效果，与一批原料提取一类成分相比，明显缩短了工艺所需时间，又减少了植物原料的损耗，从而大大降低了生产成本，实际应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例1所提取得到的甜菊苷的HPLC谱图；
图2为本发明实施例1所提取得到的莱鲍迪苷A的HPLC谱图；
图3为本发明实施例2所提取得到的甜菊苷的HPLC谱图；
图4为本发明实施例2所提取得到的莱鲍迪苷A的HPLC谱图；
图5为本发明实施例3所提取得到的甜菊苷的HPLC谱图；
图6为本发明实施例3所提取得到的莱鲍迪苷A的HPLC谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。
例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例和对比例所用的试剂和仪器均为市售产品。
本发明实施例和对比例所用甜叶菊叶原料中的莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的含量分别为6.24wt％、4.56wt％和11.06wt％。
实施例1
本发明实施例提供了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法，具体包括以下步骤：
S1、水提取
称取100g经干燥粉碎后的甜叶菊叶原料，用1000ml的纯水在 80℃的温度下回流提取90min，分离得到滤渣和滤液，滤渣再分别用 700ml的纯水在相同条件下回流提取60min两次，合并3次所得水提液，浓缩至300ml；
S2、沉淀
在S1所得的浓缩液中加入饱和石灰水调节其pH＝10，静置1h后离心分离，得到上清液和沉淀；
S3、甜菊糖苷纯化
取S2中得到的上清液上D101大孔树脂柱，控制上样流速为1 BV/h，上样完成后，先用水冲洗流出液至中性并除去水溶性杂质，水洗体积为5BV，流速为2BV/h，再用68wt％的乙醇水溶液洗柱，洗脱体积为3.5BV，流速为2BV/h，收集洗脱液并减压浓缩回收乙醇后浓缩至干，得到甜菊糖苷，向甜菊糖苷中加入50ml的正丙醇，加热至 60℃并保持该温度，搅拌使甜菊苷充分溶出，趁热过滤，得到滤液和滤饼，用50ml冷的去离子水洗涤滤饼，滤液和水洗液合并经过浓缩干燥即为甜菊苷，HPLC测定(结果如图1所示)含量为95.63％，回收率为93.58％；将滤饼用20ml的70wt％乙醇水溶液加热溶解后在5℃条件下放置结晶10h，经过过滤、水洗和干燥，得到莱鲍迪苷A精品， HPLC测定(结果如图2所示)莱鲍迪苷A含量为96.17％，回收率为 95.17％；
S4、甜菊多酚纯化
将S2中所得到的沉淀用浓度为0.8mol/L的稀盐酸溶液溶解，调节pH＝4后离心分离，弃去沉淀，将上清液上聚酰胺树脂纯化，上样流速为1BV/h，先用水洗4BV，再用60wt％乙醇水溶液洗脱3.5BV，弃去上柱流出液和水洗液，收集醇洗液，将醇洗液浓缩干燥得到甜菊多酚，经过UV检测多酚含量为95.37％，回收率为93.94％。
实施例2
本发明实施例提供了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法，具体包括以下步骤：
S1、水提取
称取1000g经干燥粉碎后的甜叶菊叶原料，用12000ml的纯水在 78℃的温度下回流提取100min，分离得到滤渣和滤液，滤渣再分别用9000ml的纯水在相同条件下回流提取90min两次，合并3次所得水提液，浓缩至3500ml；
S2、沉淀
在S1所得的浓缩液中加入饱和石灰水调节其pH＝9.5，静置80min 后离心分离，得到上清液和沉淀；
S3、甜菊糖苷纯化
取S2中得到的上清液上AB-8大孔树脂柱，控制上样流速为1 BV/h，上样完成后，先用水冲洗流出液至中性并除去水溶性杂质，水洗体积为5BV，流速为2.5BV/h，再用65wt％的乙醇水溶液洗柱，洗脱体积为4BV，流速为2BV/h，收集洗脱液并减压浓缩回收乙醇后浓缩至干，得到甜菊糖苷，向甜菊糖苷中加入600ml的正丙醇，加热至 60℃并保持该温度，搅拌使甜菊苷充分溶出，趁热过滤，得到滤液和滤饼，用200ml冷的去离子水洗涤滤饼，滤液和水洗液合并经过浓缩干燥即为甜菊苷，HPLC测定(结果如图3所示)含量为95.02％，回收率为94.97％；将滤饼用250ml的72wt％乙醇水溶液加热溶解后在 5℃条件下放置结晶10h，经过过滤、水洗和干燥，得到莱鲍迪苷A 精品，HPLC测定(结果如图4所示)莱鲍迪苷A含量为96.84％，回收率为96.27％；
S4、甜菊多酚纯化
将S2中所得到的沉淀用浓度为1mol/L的稀盐酸溶液溶解，调节 pH＝4.5后离心分离，弃去沉淀，将上清液上聚酰胺树脂纯化，上样流速为0.8BV/h，先用水洗5BV，再用60wt％乙醇水溶液洗脱3.5BV，弃去上柱流出液和水洗液，收集醇洗液，将醇洗液浓缩干燥得到甜菊多酚，经过UV检测多酚含量为96.62％，回收率为93.75％。
实施例3
本发明实施例提供了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法，具体包括以下步骤：
S1、水提取
称取100kg经干燥粉碎后的甜叶菊叶原料，用1000L的纯水在 80℃的温度下回流提取90min，分离得到滤渣和滤液，滤渣再分别用 800L的纯水在相同条件下回流提取60min两次，合并3次所得水提液，浓缩至250L；
S2、沉淀
在S1所得的浓缩液中加入饱和石灰水调节其pH＝10.0，静置1h 后离心分离，得到上清液和沉淀；
S3、甜菊糖苷纯化
取S2中得到的上清液上HP-20大孔树脂柱，控制上样流速为1 BV/h，上样完成后，先用水冲洗流出液至中性并除去水溶性杂质，水洗体积为5BV，流速为2BV/h，再用62wt％的乙醇水溶液洗柱，洗脱体积为3BV，流速为2BV/h，收集洗脱液并减压浓缩回收乙醇后浓缩至干，得到甜菊糖苷，向甜菊糖苷中加入50L的正丙醇，加热至60℃并保持该温度，搅拌使甜菊苷充分溶出，趁热过滤，得到滤液和滤饼，用50L冷的去离子水洗涤滤饼，滤液和水洗液合并经过浓缩干燥即为甜菊苷，HPLC测定(结果如图5所示)含量为96.01％，回收率为92.91％；将滤饼用180L的74wt％乙醇水溶液加热溶解后在5℃条件下放置结晶12h，经过过滤、水洗和干燥，得到莱鲍迪苷A精品，HPLC 测定(结果如图6所示)莱鲍迪苷A含量为95.97％，回收率为93.86％；
S4、甜菊多酚纯化
将S2中所得到的沉淀用浓度为0.8mol/L的稀盐酸溶液溶解，调节pH＝4.5后离心分离，弃去沉淀，将上清液上聚酰胺树脂纯化，上样流速为0.8BV/h，先用水洗5BV，再用60wt％乙醇水溶液洗脱4BV，弃去上柱流出液和水洗液，收集醇洗液，将醇洗液浓缩干燥得到甜菊多酚，经过UV检测多酚含量为96.51％，回收率为94.73％。
对比例1
本对比实施例提供了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法，其具体步骤与实施例1相同，区别仅在于，在步骤 S3中，省略了向甜菊糖苷中加入正丙醇并加热溶出的步骤，而是直接将大孔树脂柱层析所得的甜菊糖苷直接经过两次结晶，分离晶体和母液，晶体直接干燥，母液浓缩后干燥。
经检测，本对比例1经提取和纯化后得到得到莱鲍迪苷A的含量为92.91％，回收率为74.32％；甜菊苷的含量为60.14％，回收率为 89.79％；此外，与实施例1相比，整个工艺所需时间需要延长48h。
对比例2
本对比实施例提供了一种从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜菊多酚的方法，其具体步骤与实施例1相同，区别仅在于，在步骤 S2中，省略了向浓缩液中加入饱和石灰水、调节pH和离心分离的步骤，直接将浓缩液上大孔树脂柱层析，收集上柱流出液，浓缩干燥后即为甜菊多酚，水洗除杂后用60wt％乙醇水溶液洗脱，60wt％乙醇水溶液的洗脱液即为甜菊糖苷，将甜菊糖苷直接经过两次结晶，分离晶体和母液，晶体直接干燥，母液浓缩后干燥。
经检测，本对比例2经提取和纯化后得到得到莱鲍迪苷A的含量为85.78％，回收率为69.39％；甜菊苷的含量为54.89％，回收率为 82.31％；甜菊多酚的含量为35.72％，回收率为40.19％；此外，与实施例1相比，整个工艺所需时间需要延长60h。
对比分析实施例1-3和对比例1-2的结果，可以看出：
(1)本发明实施例通过利用莱鲍迪苷A和甜菊苷在正丙醇里面具有不同溶解性的特点，对甜菊糖苷里面的两个主要成分进行分离，具有较高的效率；
(2)相比较于将甜菊糖苷直接使用溶剂进行结晶，本发明实施例所提供的方法采用80％以上纯度的莱鲍迪苷A粗品进行结晶，能大大缩短纯化所需的时间，提高了单位时间内目标成分的产量，能避免直接结晶时莱鲍迪苷A部分溶解于母液而未能使其充分析出，且能得到含量在95％以上的甜菊苷；
(3)本发明实施例所提供的方法往甜叶菊浸提液中加入饱和石灰水进行沉淀，可有效去除浸提液中的部分杂质，提高了浸提液离心分离后的上清液中莱鲍迪苷A和甜菊苷的含量，且大孔树脂层析时在水洗后无需再用碱去除酸性物质，得到的甜菊糖苷中莱鲍迪苷A和甜菊苷的含量更高，便于后续纯化；
(4)本发明实施例所提供的方法工艺连贯且简单，可操作性强，生产成本低，所制备得到的产品的回收率和纯度高，且整个工艺过程不使用有毒有害化工溶剂，安全环保，适合工业化生产，能对甜叶菊起到了一个综合利用的效果，与一批原料提取一类成分相比，明显缩短了工艺所需时间，又减少了植物原料的损耗，从而大大降低了生产成本，实际应用前景广阔。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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