一种京尼平苷酸单体的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种京尼平苷酸单体的制备方法及应用 (Preparation method and application of genipin nucleotide monomer ) 是由 彭密军 宋丹 王志宏 王雪松 郁峰 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种京尼平苷酸单体的制备方法及应用。该京尼平苷酸单体的制备方法,包括如下步骤：S101、将杜仲粉加入天然低共熔溶剂中进行提取,得到京尼平苷酸粗提取液；S102、采用特种吸附剂纯化法,使用吸附剂吸附京尼平苷酸粗提取液后,弃去滤液,用水洗涤,再经乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,洗脱液干燥后得到GPA活性部位；S103、将GPA活性部位进行制备分离,将收集的GPA馏分减压浓缩干燥,得到所述的京尼平苷酸单体。本发明提出的制备方法制备得到的京尼平苷酸单体纯度高,方法简便易于实现。(The invention discloses a preparation method and application of a genipin acid monomer. The preparation method of the genipin acid monomer comprises the following steps: s101, adding eucommia ulmoides powder into a natural eutectic solvent for extraction to obtain a crude geniposide extraction solution; s102, adsorbing a crude geniposide extraction solution by using a special adsorbent purification method, removing a filtrate, washing with water, eluting with an ethanol solution, collecting an eluent, and drying the eluent to obtain a GPA active site; s103, preparing and separating the GPA active site, and concentrating and drying the collected GPA fraction under reduced pressure to obtain the geniposidic acid monomer. The genipin acid monomer prepared by the preparation method provided by the invention has high purity, and the method is simple and easy to realize.)
技术领域
本发明涉及植物提取制备技术领域，尤其涉及一种京尼平苷酸单体的制备方法及应用。
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是杜仲科杜仲属植物，同时也是我国特有的名贵滋补药材，具有补肝肾、强筋骨和安胎的功能，主要分布在我国四川、贵州、江西和湖北等省区。因此杜仲具有较高的科学研究价值、保健药用价值和经济开发价值。
杜仲的生物作用成分有木质素类、环烯醚萜类、黄酮类、多糖类及苯丙素类等，其所含京尼平苷酸具有降压、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等药理作用，是杜仲的重要作用成分之一。因为其具有强大的降压作用，且效果优于松脂醇二葡萄糖苷，在日本已作为一种常用保健品添加剂应用，其抗氧化、抗肿瘤及等多种生物作用亦被相关科学研究验证，然而，目前对京尼平苷酸抗衰老作用的研究仍较少，尚未见有关京尼平苷酸单体的制备鉴定和生物活性的研究报道。
初步研究发现从杜仲中提取出来的京尼平苷酸单体抗衰老作用优于杜仲的其他特征成分，且近年来，世界人口老化越来越严重，2019年中国65岁以上人口占全国人口的比重为12.6％，60岁以上人口占比为18.1％，目前中国已经是世界人口严重老龄化国家之一，因此开发抗衰老作用物质具有广阔的市场前景和重要社会意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种京尼平苷酸单体的制备方法及应用，本发明利用天然低共溶剂制备得到京尼平苷酸粗提物，再通过特种吸附剂纯化法对京尼平苷酸进行富集纯化，得到GPA活性部位，最后通过制备色谱分离技术得到纯度为90％-95％京尼平苷酸单体，该方法制备得到的京尼平苷酸单体纯度高，方法简便易于实现。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种京尼平苷酸单体的制备方法，包括如下步骤：
S101、将杜仲皮粉按料液比1:1-1:100g/mL加入天然低共熔溶剂中，于温度为20℃-80℃、功率为50-500W下提取10-90min，得到85％-90％京尼平苷酸粗提取液；
S102、采用特种吸附剂纯化法，用吸附剂吸附步骤S101所得的京尼平苷酸粗提取液后，弃去滤液，用20℃-75℃蒸馏水洗涤，再经溶剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液干燥后得到含量为85％-88％GPA(京尼平苷酸)活性部位；
S103、将步骤S102所得的GPA活性部位进行制备色谱分离，将收集的GPA馏分减压浓缩干燥，得到纯度为90-95％的京尼平苷酸单体。步骤S101的提取方式为超声提取。
优选地，所述的天然低共熔溶剂由甜菜碱、L-乳酸和蒸馏水以物质的量之比1：1：3-10组成。
优选地，步骤S101具体步骤为：将杜仲粉按料液比为1:10-40g/mL加入天然低共熔溶剂中，混合均匀后，在30℃-50℃、300-500W下超声提取30-60min，得到20-30mg/g的京尼平苷酸粗提取液。
优选地，步骤S102所述的吸附剂为特种吸附剂HG-2，吸附剂的加入量为每1-2mL京尼平苷酸粗提液加入1g吸附剂。
进一步优选，步骤S102中吸附剂充分吸附京尼平苷酸粗提取液后，弃去滤液，用20℃-75℃蒸馏水洗涤，再经溶剂洗脱的具体步骤为：特种吸附剂HG-2充分吸附京尼平苷酸粗提取液后，弃去滤液，用30℃-50℃蒸馏水洗涤3-6次，再用溶剂洗脱。
进一步优选，所述的溶剂选自乙酸乙酯、甲醇和乙醇溶液中的一种，所述的乙醇溶液的体积分数为70％-80％。
优选地，步骤S103中制备GPA的流动相为pH值为2.0-4.0，ΦB值为0.15-0.28。
本发明还保护上述制备方法制备得到的京尼平苷酸单体。通过上述制备方法制备得到的京尼平苷酸单体纯度高达90％-95％。
本发明还保护京尼平苷酸单体在制备抗炎制剂或抗衰老制剂中的应用。
京尼平苷酸单体的活性测定方法，包括如下步骤：建立HUVEC氧化损伤模型，将京尼平苷酸单体稀释成不同浓度，分别进行抗氧化检测、抗炎检测和抗衰老检测。
所述的抗氧化检测实验具体包括，细胞上清液乳酸脱氢酶的检测：使用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒进行检测；MDA含量的检测：使用MDA检测试剂盒进行检测；谷胱甘肽含量的检测：使用GSH检测试剂盒进行检测；细胞内活性氧水平的检测：使用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧的含量；所述的抗炎检测采用ELISA法检测蛋白的表达；所述的抗衰老检测通过SA-β-半乳糖苷酶染色进行分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过利用天然低共溶剂制备得到京尼平苷酸粗提物，再通过溶剂萃取法或特种吸附剂纯化法对京尼平苷酸进行富集纯化，得到GPA活性部位，最后通过制备色谱分离技术得到纯度为90-95％京尼平苷酸单体；该京尼平苷酸单体具有较好的抗衰老活性和抗炎活性。
附图说明
图1为本发明京尼平苷酸单体的制备方法的流程图；
图2为GPA单体对H2O2诱导HUVEC损伤的影响图；
图3为GPA单体的抗氧化作用图；
图4为GPA单体的抗炎作用图；
图5为GPA单体的抗衰老作用图，其中：A：对照组；B：H2O2组；C：H2O2+GPA实验组。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明使用的设备和试剂为本技术领域常规市购产品。萃取剂BT-1，分析纯，购于湖南化工研究院精细化工研究所，CAS号：71-36-3。吸附剂HG-2，分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司，CAS号：64365-11-3。乙酸乙酯，分析纯，购于麦克林试剂有限公司，CAS号:141-78-6。甲醇，分析纯，购于麦克林试剂有限公司，CAS号：67-56-1。
实施例1
如图1所示，一种具有抗衰老活性的京尼平苷酸单体的制备方法，包括以下步骤：
S101、将新鲜杜仲皮洗净，自然风干，置于50℃真空烘箱中干燥24h，用粉碎机打碎并过筛网，得到杜仲皮粉；将1g杜仲皮粉与10mL天然低共熔溶剂混合，天然低共熔溶剂由甜菜碱、L-乳酸和蒸馏水以物质的量之比1：1：4混合均匀组成，在温度为50℃、功率为300W的条件下进行超声处理30min，于4000r/min下离心10min，取上清液，得到89.7％的京尼平苷酸粗提取液；
S102、取50g特种吸附剂HG-2，加入80mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用体积分数为80％的乙醇洗脱4次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为87.8％的GPA活性部位；
S103、将得到的GPA活性部位进行制备分离，其中制备色谱流动相的pH值为2.8，ΦB值为0.28，将收集的GPA馏分减压浓缩，真空冷冻干燥，得到纯度为93％的京尼平苷酸单体。结构表征数据如下：1H NMR(400MHz)δ1H NMR(D2 O,400MHz):7.16(IH,s,H-3),5.87(IH,s,H-7),5.34(1H,d,J＝6.2Hz,H-1),4.82(1H,d,J＝8.2Hz,H-1"),4.31(1H,d,J＝14.6Hz,H-10b),4.26(1H,d,J＝14.6Hz,H-10a),3.24(IH,q.J＝8.0Hz,H-5),2.30(1H,t,J＝6.2Hz,H-9),2.80(1H,d,J＝16.4Hz,H-6b),2.14(1H,d,J＝16.4Hz,H-6a)；13C NMR(D2 0,100MHz):δ178.5(C-11),149.8(C-3),143.9(C-8),131.8(C-7),120.6(C-4),101.2(C-1),98.6(C-1'),78.9(C-3'),78.4(C-5'),75.5(C-2'),72.2(C-4'),63.3(C-6)')、62.3(C-10)、49.1(C-9)、40.8(C-6)、37.4(C-5)。与参考文献(Guarnaccia R,Madyastha K M,Tegtmeyer E,et al.Geniposidic acid,an iridoid glucoside from Genipa americana[J].Tetrahedron Letters,1972,13(50):5125-5127)中给出的数据相比，该化合物鉴定为京尼平苷酸。
实施例2
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S102中取50g特种吸附剂HG-2，加入80mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用乙酸乙酯洗脱4次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为65％的GPA活性部位。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S102中取50g特种吸附剂HG-2，加入80mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用甲醇洗脱4次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为81.2％的GPA活性部位。
实施例4
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S102中取50g特种吸附剂HG-2，加入50mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用80％的乙醇洗脱4次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为60.8％的GPA活性部位。
实施例5
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S102中取50g特种吸附剂HG-2，加入100mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用体积分数为80％的乙醇溶液洗脱4次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为75.3％的GPA活性部位。
实施例6
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S102中取50g特种吸附剂HG-2，加入80mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用体积分数为80％的乙醇溶液洗脱2次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为70.9％的GPA活性部位。
实施例7
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S102中取50g特种吸附剂HG-2，加入80mL京尼平苷酸粗提取液中，经充分吸附直至饱和后，过滤，弃去滤液，用35℃的蒸馏水，洗涤4次(洗去糖类、无机盐等杂质成分)，然后用80％的乙醇洗脱3次，收集洗脱液，浓缩液干燥后得到含量为81.2％的GPA活性部位。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：制备京尼平苷酸粗提取液的提取方法不同。
一种具有抗衰老活性的京尼平苷酸单体的制备方法，包括以下步骤:
步骤S101中取杜仲皮粉末5Kg，置于100L的多用提取罐中，加入60L体积分数为80％的乙醇溶液，在70℃下，提取3次，每次0.5h，合并提取液，过滤，减压回收溶剂，得到88.6％的京尼平苷酸粗提取液；
S102和S103的操作同实施例1。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：京尼平苷酸粗提取液的纯化方法不同。
一种具有抗衰老活性的京尼平苷酸单体的制备方法，包括以下步骤：
S101，操作同实施例1。
S102、采用溶剂萃取法萃取京尼平苷酸粗提取液，萃取剂为BT-1，水相pH值3，相比1：3，萃取15min，萃取2次，合并2次萃取液，减压回收有机溶剂(可重复使用)，将浓缩液干燥后得到含量为80.5％的GPA活性部位；
S103，操作同实施例1。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：京尼平苷酸粗提取液的纯化方法不同。
一种具有抗衰老活性的京尼平苷酸单体的制备方法，包括以下步骤：
S101，操作同实施例1。
S102、采用大孔树脂法纯化京尼平苷酸粗提取液，将京尼平苷酸粗提取液经过澄清、超滤后，用柠檬酸调节的pH值至3，再使用XAD-6型大孔吸附树脂吸附，先用1BV蒸馏水洗脱除杂，洗脱速率为2.5BV/h；再使用3BV6％质量分数的乙醇水溶液洗脱，洗脱速率为3BV/h，收集洗脱液，将浓缩液干燥后得到含量为30％的GPA活性部位。
S103，操作同实施例1。
实验例1
具有抗衰老活性的京尼平苷酸单体的测定方法，包括：
将实施例1制备得到的纯度为93％京尼平苷酸单体稀释成不同浓度待测。
1、方法：
如图2所示，本实验一共设定三个组别，分别是：空白组(A组)、H2O2组(B组)以及实验组(H2O2+GPA，其中，GPA(3.125uM)+H2O2(100uM))(C组)。其中，抗氧化的实验：细胞上清液乳酸脱氢酶的检测：使用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒进行检测；MDA含量的检测：使用MDA检测试剂盒进行检测；谷胱甘肽含量的检测：使用GSH检测试剂盒进行检测；细胞内活性氧的含量：使用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧的含量。抗炎的实验：采用ELISA法检测蛋白的表达。抗衰老的实验：通过SA-β-半乳糖苷酶染色进行分析。
2、实验结果：
如图3所示，抗氧化实验表明：京尼平苷酸可以降低LDH的含量、MDA含量、ROS含量，增加细胞中GSH-Px含量，能起到较好的抗氧化作用。
如图4所示，抗炎实验表明：活性成分京尼平苷酸，可以抑制氧化损伤细胞中NF-κB、ICAM-1浓度的升高，具有较好的抗炎作用。
如图5所示，抗衰老实验表明：通过进行SA-β-gal染色分析发现，京尼平苷酸具有保护细胞、缓解细胞氧化损伤所致衰老的作用。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。