具体实施方式

本发明包含以下内容：

1.如所示和所描述的生物电子电路。

2.如所示和所描述的用于蛋白质活性的电测量的系统。

3.如所示和所描述的用于检测蛋白质活性的方法。

4.生物电子电路，包含：

(a)至少一个电极，

(b)对蛋白质有特异性的至少一个配体，其中该配体经修饰以使其附接到至少一个电极，和

(c)至少一个蛋白质，该蛋白质与配体结合，从而在电极和蛋白质之间形成电子接触。

5.根据以上4的生物电子电路，其中电极包含选自下组的金属：钯、铂或金。

6.根据以上4或5的生物电子电路，其中配体选自下组：HSCH₂CH₂-二硝基苯酚，CALDRWEKIRLR(SEQ ID NO:1)，CHNTPVYKLDISEATQV(SEQ ID NO:2)，环状RGDfC，硫化链霉抗生物素蛋白，和HSCH₂CH₂-生物素。

7.根据以上4-6中任一项的生物电子电路，其中蛋白质选自下组：IgE抗DNP，IgG抗HIV，IgG抗Ebola，Fab抗Ebola，α_Vβ₃整合素，和链霉抗生物素蛋白。

8.根据以上4-6中任一项的生物电子电路，进一步包括其中蛋白质是聚合酶、内切核酸酶、解旋酶或蛋白酶体。

9.根据以上4的生物电子电路，其中至少一个配体经修饰为包含硫醇、胺、二硫化物或氰化物部分。

10.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)对蛋白质有特异性的第一和第二配体，其中配体经修饰以使第一配体附接到第一电极和第二配体附接到第二电极，和

(c)经修饰以与第一和第二配体结合的蛋白质，其中蛋白质与第一和第二配体的结合在电极和蛋白质之间形成电子接触。

11.以上10的生物电子电路，其中配体是硫化链霉抗生物素蛋白。

12.以上10或11的生物电子电路，其中蛋白质经修饰为包含生物素。

13.以上10-12中任一项的生物电子电路，其中蛋白质是双生物素化聚合酶。

14.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)对蛋白质有特异性的第一配体，其中该第一配体经修饰以使其附接到第一电极，

(c)蛋白质，该蛋白质与第一配体结合并且经修饰以与第二配体结合，和

(d)第二配体，该第二配体与蛋白质结合并且经修饰以使其附接到第二电极，从而在第一和第二电极与蛋白质之间形成电子接触。

15.以上14的生物电子电路，其中蛋白质上与第一配体的结合位点靠近柔性接头序列。

16.以上14的生物电子电路，其中蛋白质上与第二配体的第二结合位点靠近柔性接头序列。

17.以上15或16的生物电子电路，其中柔性接头序列包含GNSTNGTSNGSS(SEQ IDNO:3)。

18.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)第一蛋白质，其中该第一蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一电极，

(c)第二蛋白质，其中该第二蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一蛋白质并且经修饰以与配体结合，

(d)配体，该配体与第二蛋白质结合并且经修饰以使其附接到第二电极，从而在第一和第二电极与第一和第二蛋白质之间形成电子接触。

19.根据以上18的生物电子电路，其中第一蛋白质包含两个生物素。

20.以上19的生物电子电路，其中第二蛋白质包含两个生物素化Avitag序列。

21.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)第一和第二蛋白质，其中第一和第二蛋白质中的一个或二者通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一和第二电极，从而在第一和第二电极与第一和第二蛋白质中的一个或二者之间形成电子接触。

22.以上21的生物电子电路，其中第一结合位点包含一个或多个可以经生物素化的残基。

23.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)第一蛋白质，其中该第一蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一电极，

(c)第二蛋白质，其中第二蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一蛋白质并且经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第二电极，

(d)第三蛋白质，其中第三蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一和第二蛋白质，从而在第一和第二电极与第一、第二和第三蛋白质之间形成电子接触。

24.生物电子电路，包含：

(a)第一电极，

(b)第一蛋白质，其中该第一蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一电极，

(c)第二蛋白质，其中第二蛋白质经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第一蛋白质并且经由生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用附接到第二电极，

(d)第二电极，其与电解质接触并且连接到第一电极，

(e)用于施加偏压的装置，

(f)用于感测电流的装置，从而在第一和第二电极与第一和第二蛋白质之间形成电子接触。

25.制备生物电子电路的方法，该方法包括：

(a)将至少一个链霉抗生物素蛋白分子附接到至少一个电极，

(b)将生物素化蛋白质引入到来自步骤(a)的链霉抗生物素蛋白-电极以形成包含至少一个电极、至少一个链霉抗生物素蛋白分子和生物素化蛋白质的复合体。

26.用于检测聚合酶活性的方法，该方法包括将DNA模板和三磷酸核的溶液引入以上4的生物电子电路中，其中聚合化产物表明聚合酶是活性的。

27.用于检测蛋白质活性的方法，该方法包括将蛋白质的底物引入到以上4的生物电子电路中并且检测电变化。

28.用于蛋白质活性的电测量的系统，包含：

(a)如本文所述的生物电子电路，

(b)用于在第一和第二电极之间施加偏压的装置，和

(c)用于检测通过生物电子电路的电流的装置。

29.如本文所述的生物电子电路，其中蛋白质包含位于该蛋白质表面处的两个或更多个Avitag序列和来自该蛋白质内的酪氨酸、色氨酸或组氨酸的不多于10个氨基酸残基。

30.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)对蛋白质有特异性的第一和第二配体，其中该配体经修饰以使第一配体附接到第一电极和第二配体附接到第二电极，

(c)与第一配体和第二配体结合的第一蛋白质和第二蛋白质，和

(d)第三蛋白质，该第三蛋白质经修饰以与第一和第二蛋白质结合，其中第三蛋白质与第一和第二蛋白质的结合在电极和蛋白质之间形成电子接触。

31.以上30的生物电子电路，其中第一和第二蛋白质是链霉抗生物素蛋白。

32.以上30的生物电子电路，其中第一和第二配体是生物素。

33.以上30的生物电子电路，其中第三蛋白质经生物素化。

34.生物电子电路，包含：

(a)第一和第二电极，

(b)对蛋白质有特异性的第一和第二配体，其中配体经修饰以使第一配体附接到第一电极和第二配体附接到第二电极，和

(c)至少第一蛋白质和第二蛋白质，该第一蛋白质和第二蛋白质与第一配体和第二配体结合，并且可以经由配体偶联到其他蛋白质，从而扩大获得传导的范围。

定义

除非另有定义，本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。尽管在本公开的实践或检测中可使用类似或等同于本文所述那些的方法和材料，在下文中描述了合适的方法和材料。材料、方法和示例仅为说明性的，并且不旨在限制。本文中提到的所有公开出版物、专利和其他文献通过引用以其整体并入本文。

在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或变体(例如，包括/含有(“comprises”或“comprising”)将被理解为暗示含有所述的整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。

术语“一个/一种(‘a’或‘an’)”可表示多于一个/一种项目。

术语“和”和“或”可以指合取或析取，并且表示“和/或”。

术语“约”表示在所述值的±10％之内。例如，“约100”将指90-110之间的任何数。

生物电子电路

本公开提供了生物电子电路。生物电子电路包含(a)至少一个电极，(b)对蛋白质有特异性的至少一个配体，其中该配体经修饰以使其附接到至少一个电极，和(c)与至少一个配体结合的至少一个蛋白质，从而在电极和蛋白质之间形成电子接触。

取决于应用，生物电子电路包含与蛋白质直接接触的一个或两个电极。在仅有一个电极与蛋白质接触的情况下，通过在氧化还原活性蛋白质和远程电极之间流动的离子电流来完成电路。在一个实施方式中，生物电子电路包含一个电极。在另一实施方式中，生物电子电路包含两个电极。在该实施方式的一些方面中，第二电极不通过电解质与第一电极隔开。

至少一个电极包含贵金属。在一个实施方式中，至少一个电极包含选自下组的贵金属：钯、金和铂。在另一实施方式中，至少一个电极是钯。在另一实施方式中，至少一个电极是金。在另一实施方式中，至少一个电极是铂。除了至少一个电极之外，生物电子电路还包含配体，该配体对蛋白质有特异性并且经修饰以使其附接到至少一个电极。

配体可以如Zhang等人所述经修饰为在一端含有硫醇末端以偶联到金属。⁵配体的示例是在一端包含半胱氨酸残基的抗体的肽表位，识别肽(例如包含半胱氨酸的用于与整合素结合的RGD肽)和已选择蛋白质与其结合的小分子(例如包含硫醇的与二硝基苯基结合的IgE分子)。

对蛋白质有特异性并且经修饰为附接到电极的示例性配体包括，但不限于，HSCH₂CH₂-二硝基苯酚(目标蛋白IgE抗DNP)，CALDRWEKIRLR(目标蛋白IgG抗HIV)(SEQ IDNO:1)，CHNTPVYKLDISEATQV(目标蛋白IgG抗Ebola)(SEQ ID NO:2)，CHNTPVYKLDISEATQV(目标蛋白Fab抗Ebola)(SEQ ID NO:2)，环状RGDfC(目标蛋白α_Vβ₃整合素)，硫化链霉抗生物素蛋白(目标生物素)，和HSCH₂CH₂-生物素(目标链霉抗生物素蛋白)。这些不同的结合安排的总结在下表1中给出，改编自Zhang等人。⁵

表1.

此研究中所用的蛋白质和配体。用于电极附接的半胱氨酸或硫醇以粗体显示。线性尺寸来自RSCB PDB，或者横跨最小直径，或者，对于抗体，从结合头到结合头：¹IgE结构4GRG，²IgG，结构4NHH，Fab片段结构1YUH，⁴整合素结构1L5G，⁵链霉抗生物素蛋白结构1VWA。

生物电子电路还包含与至少一个配体结合的至少一个蛋白质。蛋白质可以是能够在允许修饰天然蛋白序列的介质中表达的任何蛋白质。因此，可以向电路中掺入任何蛋白质功能，这样，随后可以对由配体或底物结合或酶活性诱导的变化进行电测量。

在一个实施方式中，生物电子电路包含(a)两个钯电极，(b)附接到钯电极的硫化链霉抗生物素蛋白，和(c)生物素化聚合酶，从而在电极和聚合酶之间形成电子接触。应当理解，尽管下文所述的生物电子电路包含钯电极、硫化链霉抗生物素蛋白和生物素化聚合酶，但本实施方式是对本公开的说明并且本公开的范围不限于这一个实施方式。

在该实施方式的一个方面，从ProteinMods(Madison，Wisconsin)获得平均每个四聚体有2.5个硫醇的硫化链霉抗生物素蛋白。链霉抗生物素蛋白(图3中的31)在1μM水溶液中用一对贵金属(钯)电极(该对电极形成约5nm间隙的纳米级结，图3中的32，33)孵育。孵育过夜产生了通过表面硫醇(34)附接到金属电极的链霉抗生物素蛋白的致密涂层。

为完成生物电子电路，构建了双生物素化φ29聚合酶(图3中的35)。将Avitag肽序列，GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:4)插入到残基G111和K112之间，并且将第二Avitag肽序列插入到φ29聚合酶序列(通过使D12和E14突变为丙氨酸，其核酸外切酶活性被删除)的E279和D280之间。这产生了具有相隔约5nm的两个Avitags的聚合酶。使用BirA酶将Avitags生物素化，如本领域中所公知的那样。因此，所得的分子(35)包含两个生物素分子(图3中的36)。生物素化聚合酶用链霉抗生物素蛋白功能化的结孵育两小时(在φ29聚合酶的1μM水溶液中)。通过施加横跨其上的偏压V(37)并记录通过电路的电流(38)来测量生物电子电路的电性质。如Zhang等人所注意到的，⁵这种偏压必须小于100mV以避免接触产生的噪音，使用50mV偏压收集这里所显示的数据。

为证实修饰聚合酶仍然是活性的，用与两个链霉抗生物素蛋白分子结合的分子35执行DNA模板的滚环扩增。通过聚合化产物(图4中的42)的DNA凝胶监测的聚合酶活性与已删除核酸外切酶活性的天然酶(图4中的41)相当。

为证实双生物素化分子35桥接了结，制备单生物素化φ29聚合酶。为此，将以下序列添加到WT(但核酸外切酶失活)的酶的N末端：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSGLNDIFEAQKIEWHEGASS(SEQ ID NO:5)，其中五个组氨酸是用于蛋白质纯化的his-tag，并且GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:4)是Avitag。

为表征分子电路的所有可能的结合几何形态的电导，在不同的分子结上进行重复测量，并且绘制了在对数电导尺度上记录具体电导值的频率(如Zhang等人所述⁵)。图5显示了单生物素化聚合酶(51)和双生物素化聚合酶(52)的此类分布。双生物素化分子显示了新的高电导特征(53)，其不存在于测得的单生物素化分子的分布中。该特征对应于约4nS电导，相对于观察到的生物素化分子的最高电导特征(约0.7nS)有显著增加。这是与对于如下分子观察到的相似的增加，所述分子类似于如Zhang等人⁵所述的通过一个或两个特定接触连接的抗体。注意：这些极高电导是使用链霉抗生物素蛋白分子形成一部分电路所获得的，表明如果正确连接的话，则序列中的数个蛋白质的组装体保持了其准金属性质。

图6显示了在双生物素化聚合酶分子的静息状态61和活性状态62下获得的电信号，其中在该活性状态下，其在dNTPs和Mg存在下活性地聚合DNA模板。在每种情况中，在将电极移动以与复合体接触之后约90s记录电流数据。链霉抗生物素蛋白-φ29聚合酶接触的形成花费约20s，在此之后电流(在50mV偏压下)从0跳至约60pA。在对照物分子61的情况下，电流在剩余运行期间保持相当平静和恒定。对于活性分子62，观察到多个噪声爆发63，每个持续数秒。还显示了这些爆发之一的50ms部分(64)-爆发本身由多个亚爆发组成(65)，其持续时间和间隔符合以下解释：每个亚爆发(65)标志着单个核酸的掺入(鉴于已知的φ29聚合酶动力学)。这说明了本发明在构建能电监测酶活性的电路中的用途。

认识到将接触置于尽可能接近(close to)蛋白质的疏水内部同时仍使接触点本身出现在蛋白质表面上的重要性，Avitags的插入位点应当被置于尽可能接近芳香性残基，同时仍暴露蛋白质外部的生物素化位点。因此，Avitag应被置于尽可能接近蛋白质表面附近的酪氨酸、色氨酸或组氨酸。

在第二实施方式中，生物电子电路包含(a)两个钯电极，(b)附接到钯电极的硫化生物素，和(c)链霉抗生物素蛋白。该实施方式允许小分子在电极上的均匀涂布。

在该实施方式的一个方面，生物素化胱胺用作硫化生物素。N,N’-双生物素基-胱胺11(图1中所示化学结构)如实施例中所述合成。由于存在S-S链接(图1中的12)，11在氧化环境(如空气)中是稳定的。在强还原剂存在下，其可被还原为单硫醇(monothiol)20(图2中所示化学品)。还原剂是本领域中已知的，并且可以使用任何品种。在一些实施方式中，还原剂是来自Thermo Scientific(cat#77712)的固定TCEP(三[2-羧乙基]膦盐酸盐)二硫化物还原凝胶。

在该第二实施方式中，将电极用硫化生物素功能化，随后将结暴露于野生型(即，缺少表面硫醇的)链霉抗生物素蛋白。结果是强电导电桥。这在图7中说明。在对照试验(71)中，通过已经用生物素孵育的硫化链霉抗生物素蛋白分子来桥接间隙(这是因为，如Zhang等人所述⁵，生物素结合改变了链霉抗生物素蛋白的电导，因此有必要对生物素结合的链霉抗生物素蛋白分子进行比较，以了解这些实验中的固有接触差)。在第二次测量(72)中，首先将电极用单硫化生物素功能化(20)，随后引入野生型链霉抗生物素蛋白以结合和完成电路。在73中显示了直接附接到电极的硫化链霉抗生物素蛋白(生物素结合的)的电流分布。在74中显示了生物素化电极之间捕获的野生型链霉抗生物素蛋白的分布。在使用硫化生物素分子(20)将链霉抗生物素蛋白附接到电极的情况中，在接近7nS处观察到新的高电导特征(75)。值得注意的是，与蛋白质自身经由该蛋白质上的表面硫醇的直接附接相比，经由特异性结合配体(生物素)(该特异性结合配体自身通过硫醇附接到电极)的连接可以形成更好的接触。

在上面描述的实施方式中，蛋白质包含一个配体接触。在以下段落中描述的实施方式中，蛋白质包括第二配体接触。

例如，表1中列出的整合素分子具有一个小配体结合位点，该小配体具有良好的电接触(如表1中列出的掺入半胱氨酸的环状RGD肽)。但是不能经由另一配体接触到第二点，因为该整合素仅具有一个RGD结合位点。然而，通过将Avitag序列掺入到整合素N末端附近(near)的区域中，可以完成明确的电路，因此现在它具有两个特异性结合位点：(1)RGD肽结合位点和(2)生物素结合位点。像这样的异质性接触(在一个位点为肽结合，在另一个为生物素化)具有以下优点：可以通过利用现在掺入到蛋白质中的选择性附接而使蛋白质在组装体中定向。例如，一个电极可以用链霉抗生物素蛋白功能化，第二个可以用肽功能化(即，环状RGD)，这样，修饰蛋白质随后将始终相对于两个电极以明确的方向结合。同一技术能够进行蛋白质电路的顺序组装。这用图8中所示的蛋白质“与”门(“AND”gate)显示。

更具体而言，使用串联连接在电极之间的蛋白质A(81)(其设计或选择为使得配体A的结合引起导电性增加)和蛋白质B(82)(其设计或选择使得配体B的结合引起导电性增加)，该配对包括化学与门(AND gate)，因为当存在配体A和配体B二者时仅获得高电导状态。显然，保证蛋白质以所需顺序连线的一种方法是使用选择性接触。因此，第一电极，84，用与链霉抗生物素蛋白87结合的硫化生物素分子86修饰。这进而与蛋白质A 81结合，该蛋白质A 81已经修饰为具有掺入的两个生物素化Avitag序列83。用链霉抗生物素蛋白进一步孵育将第二链霉抗生物素蛋白84置于蛋白质A上。此时，蛋白质B 82可以使用生物素化Avitag序列83结合。如果使用相同的生物素-链霉抗生物素蛋白偶联来完成与第二电极85的电路接触，则蛋白质A将要被掺入到需要蛋白质B的第二位置处的不理想可能性会增大。为克服这种可能性，使用异质性链接，在这种情况下在蛋白质B上采用肽结合位点88。与第二电极85结合的对应肽配体89通过与蛋白质B上的同源位点结合完成电路。将会意识到可以通过将配体彼此链接产生其他可用的构造块。例如，通过将肽配体(例如表1中所示的那些之一)连接到生物素分子，使得具有肽特异性结合位点的第一蛋白质能够链接到链霉抗生物素蛋白，例如，以便随后经由链霉抗生物素蛋白上剩余的未被占据的生物素结合位点掺入到电路中。

在用两个接触点将功能蛋白质连接到电路中出现的另一项考虑是因在两个点上拴系蛋白质所产生的机械限制所导致的可能的功能破坏。当在一点上连接使蛋白质像其在溶液中那样自由移动时，第二附接点，尤其是选择为远离第一点(以便感测蛋白质的运动)的第二附接点显然能破坏蛋白质功能。因此，非常希望在掺入第二接触位点的区域中掺入柔性接头。当然，这可以是在两个接触位点中的任何一个处。

形成柔性接头的氨基酸序列是本领域中众所周知的，示例在万维网bmrb.wisc.edu/referenc/choufas.shtml上列出。当选择特定的柔性接头时,有三项重要的设计考虑。

第一项考虑是掺入的序列不应由短重复序列组成，因为这会使克隆复杂化。为说明这一点，考虑众所周知的柔性接头氨基酸序列：GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:6)。对应的DNA模板在图9A中显示，其还显示了可在引物序列之间形成的二聚体。当克隆到表达载体中时，结果在图9B中显示，其显示了具有标记的非期望引物二聚体的产物的所得质粒的序列。

第二项考虑是新蛋白质的等电点不应显著改变，因此插入的接头中的残基应当选择为中性或近中性的。这点通过包含两个Avitag以连线到电路中的phi29聚合酶的合成来说明。在这种情况下，柔性接头被置于紧邻(next to)位于N末端附近的Avitag序列。在第一种情况中(图10中的序列101)，柔性接头(圈出，103)具有如下序列：GDSTDGTSDGSS(SEQ IDNO:7)，结果为蛋白质产物具有7.25的计算的pI。与天然蛋白质的pI(其是约8的pI)的这种小偏差足以导致错误折叠，这种错误折叠会导致蛋白质表现为凝胶106中的较短产物105。当接头序列中的天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)时(现在为GNSTNGTSNGSS(SEQ ID NO:3)-序列102中的104)，恢复了天然pI(pI＝8.13)，现在产物在正确折叠的天然蛋白质(凝胶108中的107)的位置处运行。

第三项考虑出现在当两个相同序列(即，两个Avitag序列)被插入到同一个克隆表达系统中时，因为相应的重复DNA序列导致引物二聚体。为克服此点，克隆在两个步骤中进行。首先产生具有一个Avitag序列的克隆，随后从该第一克隆产生第二克隆，插入第二个第二Avitag序列。

鉴于GNSTNGTSNGSS(SEQ ID NO:3)接头的柔性和可能需要特定的蛋白折叠以支持蛋白质内部的这种准金属状态的因素，关键问题是当插入接头时是否维持了蛋白质的导电性质。图11显示了两Avitag聚合酶的参考电导分布1101，该聚合酶先前显示为图5中的52(缺少柔性接头序列)。这里，因与两个生物素化位点结合而产生的高电导特征标记为1103。1102显示了掺入柔性接头的phi29的电导分布(图101中的蛋白质序列102)。高电导特征被保留(1104)，显示可以掺入柔性肽接头，同时维持了蛋白质的准金属状态。

链霉抗生物素蛋白是四价的(其与至多四个生物素结合)，因此，结合这些显著的和出乎意料的电子性质，包括偶联方案和蛋白质本身，构建生物电子电路的全新途径成为可行。

图12显示了基于同一组装规则的“或”门(“OR”gate)(编号组件如图8中所述)。如果配体A或配体B存在，这将进入高电导状态。

链霉抗生物素蛋白的四价特质允许组装甚至更复杂的电路。这种可能性的一种方式在图13中显示，其中，编号也如图8)。这里，第三蛋白质“C”(1300)在未被偶联的链霉抗生物素蛋白87占据的位点处附接到蛋白质A和蛋白质B的结。如果，例如，蛋白质C是例如在氧化分子存在下改变其氧化状态的电化学活性蛋白质，则蛋白质C上的电荷变化将调节通过A-B链的电传输。因此，“A”和“B”功能可以得到第三状态，该第三状态取决于“C”的电子状态。

至此描述的实施方式均利用了第一和第二电极二者。然而，这里所述的用基于配体的连接偶联的蛋白质内部的准金属电导将允许在浸泡在溶液中的传感器电极表面处进行极为有效的电子传递，该溶液包含在传感蛋白(例如葡萄糖感受器¹)中产生氧化还原活性的分子。因此，目标蛋白质或多种蛋白质将仅直接链接到一个电极，如图14中所示。这里，蛋白质D 1400是浸泡在电解质1401中的氧化还原活性蛋白质(例如，葡萄糖氧化酶)，该电解质1401包含氧化还原电对1402，1403(例如，氧化和还原的葡萄糖)，第二(远端)电极1404与电解质1401接触，并且还通过用于施加电压偏压1405的装置和用于感测在第一电极84和第二电极1404之间流动的电流1406的装置连接到第一电极84。这是本发明的链接在应用于改善现有的电化学传感技术的用途的示例。

图3的生物电子电路需要将修饰的偶联蛋白质直接附接到电极。然而，如Zhang等人所示，如果使用未修饰的偶联蛋白质通过附接到电极的小配体进行偶联，则偶联将会更有效。这具有以下优点：可以用小配体进行功能化，这样更容易获得均匀覆盖。因此，图15显示了用图2的硫化生物素1534修饰的第一电极1532结合未修饰的链霉抗生物素蛋白1531，该未修饰的链霉抗生物素蛋白1531又在两个位点1536处与已被生物素化的蛋白质1535结合。类似的功能化完成了与第二电极1533的偶联。

如图16所示，通过与每个电极形成偶联蛋白菊花链，可以以极低的电导率成本显著增加用于监测蛋白质传导的间隙尺寸。这里，将第二偶联蛋白质1602添加到电路中，通过二价接头1601(例如图1中所示的双生物素)偶联到第一1531。

实施例

以下实施例阐述用于说明性目的，并且不应该用于限制所公开的主题的范围。

材料来源

RGD肽(环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys))从Peptides International(Louisville，Kentucky)购买。抗HIV抗体和抗Ebola抗体的肽配体由CPC Scientific(Sunnyvale，California)合成，纯度>95％。DNP和生物素二硫化物在我们的实验室合成(SI附录图S10和S13)，并且在使用前通过来自Thermo Scientific(cat#77712)的固定化TCEP(三[2-羧乙基]膦盐酸盐)二硫化物还原凝胶根据制造说明书还原2小时。本公开中所用溶液的制备在SI附录中描述。抗DNP抗体(小鼠单克隆IgE抗体)、野生型链霉抗生物素蛋白和所有其他化学品均从Sigma Aldrich(Saint Louis，Missouri)购买。抗HIV抗体(抗HIV1 p17抗体[32/1.24.89])和所有同种型对照物均从Abcam(Cambridge，MA)购买。抗Ebola抗体如下所述从植物中培养。所有三种抗体的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)测量。平均每四聚体2.5个硫醇的硫化链霉抗生物素蛋白来自ProteinMods(Madison，Wisconsin)。通过3M KCl或10mM KCl盐桥接的Ag/AgCl参比电极如先前所述制备。B.Zhang等人，Nano Futures 1(2017)。循环伏安法的完整细节在SI附录中提供。抗Ebola抗体和相应的单体Fab片段如实施例7中所述制备和纯化。

实施例1.N,N’-双-生物素基-胱胺11(化学结构如图1中所示)的合成。

将胱胺二盐酸盐(60mg，0.27mmol)添加至DMF(2mL)中，然后添加三乙胺(0.44mL，3.19mmol)。将混合物搅拌30min，向其中添加生物素NHS酯(0.27g，0.80mmol)，并且在室温下搅拌16h。TLC表明胱胺耗尽，产生在20％甲醇/DCM中的R_f值为0.63的产物。将混合物与二氯甲烷共同蒸发，直到去除大部分DMF和TEA。将残余物在自动快速色谱仪Teledyne Isco中在柱上分离，使用在DCM中的0-20％甲醇的梯度，经过120mins，流速为3mL/min。获得产物，其为白色固体(0.11g和67.1％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ1.20-1.60(m，12H)，2.07(t，7.6Hz，4H)，2.57(d，12.4Hz，2H)，2.77(t，6.6Hz，4H)，2.83(dd，5.1和12.6，2H)，3.07-3.12(m，2H)，3.31(t，6.4Hz，4H)，4.11-4.15(m，2H)，4.31(t，5.2Hz，2H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ25.70，28.50，28.65，35.62，37.83，38.37，40.32，55.92，59.68，61.52，163.18，172.69。

实施例2.化合物20的合成

通过以下方式产生化合物20：根据制造说明书，将N,N’-双-生物素基-胱胺11暴露于来自Thermo Scientific(cat#77712)的固定化TCEP(三[2-羧乙基]膦盐酸盐)二硫化物还原凝胶中2小时(在即将在设备中使用之前)。将产物(化学结构在图2中显示)溶解在20％甲醇/DCM中，该溶液随后用于修饰电极。

实施例3.将底物和STM探针功能化

用于STM测量的钯底物如下制备：使用电子束蒸发器(Lesker PVD 75)将200nm钯薄膜蒸发到硅片上，带有10nm钛粘合层。将底物用氢火焰处理之后立即进行功能化，随后在硫化DNP生物素、链霉抗生物素蛋白或包含半胱氨酸残基的肽的溶液中浸泡过夜。用小配体进行的底物功能化通过傅里叶变换红外(FTIR)光谱(图S9)和椭圆光度法表征。底物覆盖率通过STM和AFM成像监测。

STM探针通过AC电化学方法从0.25mm Pd线(California Fine Wires)蚀刻。为避免电流泄露，根据先前所述用于金探针的方法将探针用高密度聚乙烯绝缘。M.Tuchband等人，Rev Sci Instrum 83，015102(2012)。每个探针在1mM PB缓冲液中在+0.5V偏压下通过STM测试以确保泄露电流<1pA。为进行功能化，将探针在配体溶液中浸泡4h或过夜。在此之后，将其取出，用水冲洗，用氮气轻轻吹干，并且立即使用。STM测量的进一步细节在实施例4中给出。

实施例4.STM测量

STM测量在PicoSPM扫描探针显微镜(Agilent Technologies)上进行，其与用于数据获取的DAQ卡(PCI-6821或PCIE-7842R，National Instruments)偶联。其中添加了缓冲溶液和分析物的Teflon池用Piranha溶液清洁，随后在Milli-Q水中超声处理三次以去除残余物(注意Piranha溶液是高腐蚀性的，拿取时必须格外小心)。为更好地控制表面电位，将具有10mM KCl盐桥的Ag/AgCl参比电极连接到底物上。首先将探针与-0.2V偏压的4pA设定点电流接合，随后使其在测量前稳定2小时。对于STM IV扫描，首先关闭伺服系统，将探针以1nm/s速度缩回ΔZ nm。然后，将探针在该高度悬停1分钟，期间使用自定义Labview程序监测电流变化。一旦电流超过50pA的阈值，认为是结合事件，并且开始从-0.2V到+0.2V的扫描，随后返回，扫描速率为1V/s，然后进行0.2s静息。随后，再次检查电流。如果电流仍高于噪声水平(6pA)的两倍，则连续记录IV曲线，直到结合蛋白质分子逃逸。在测量1分钟之后，打开伺服系统以重新结合探针，随后重复全过程。在每次测量中，收集至少1000个IV曲线，从中选择具有重叠上扫和下扫的曲线(总数的80％)以构建电导分布直方图。通过具有相似过程的另一个Labview程序记录电流对时间轨迹，区别在于在探针保持过程中偏压保持恒定。模拟数字采样速率为50KHz。所有分析物的电导测量过程相同但具有不同的效率，这是因为结合亲和性和功能化效率的差别(表S1)。

表S1.扫描产生IV曲线的频率随间隙尺寸和功能化的变化。Z₀～2.5nm。

使用对照样品未获得曲线(表1)。

用新功能化的底物和探针对每种分析物进行重复测量(表S4)。使用连接在底物和参比电极之间的由电池供能的电压源设定相对于参比电极的电位。

表S4．每个实验的重复数

实施例5．溶液制备

在新鲜脱气的纯乙醇中制备硫化DNP和生物素，最终浓度为0.1mM。首先将肽按原样溶解在脱气水中，随后等分并在-80℃冷冻。在每次使用前，取出一个等分试样并用脱气水稀释到所需浓度，对于底物和探针功能化通常为0.1mM。为降低底物上的DNP和肽的功能化密度，添加2mM浓度的2-巯基乙醇（MCE）。将抗体和同种型对照物等分并于-80℃存储，随后在使用前在1mM PB缓冲液（pH=7.4）中稀释。对于STM和固态芯片测量，使用在1mM磷酸盐缓冲液（PB）中的100nM抗体或同种型对照物。对于底物功能化，制备在1mM PB缓冲液中的1μM硫化链霉抗生物素蛋白。在1mM Pb缓冲液中的1mM游离生物素和100nM野生型链霉抗生物素蛋白用于通过STM进行电导测量。所有缓冲液和溶液在导电率为18.2mΩ的Milli-Q水中制备。对于所有测量，将1mM PB缓冲液（pH 7.4）用氩气脱气以避免氧气干扰。

实施例6．循环伏安法

将Pd底物切割为0.5cm x 4.0cm的尺寸并且用作工作电极，活性池面积为约0.5cmx 1.0cm。在功能化之前，将底物用氢火焰处理。在电位恒定器(Model AFCBP1，PineInstruments)上进行循环伏安法，使用Pt线作为对电极，Ag/AgCl(3M KCl)作为参比电极。除非另有说明，否则扫描范围从-0.5V到+0.5V，扫描速率为10mV/s。

实施例7.来自本生烟(Nicotiana benthamiana)植物的抗Ebola(EBOV)mAb 6D8的表达和纯化

将6D8的重链和轻链的编码序列(Lai，H.等人，Plant Biotechnol J10，95-104，doi：10.1111/j.1467-7652.2011.00649.x(2012)克隆到基于MagnICON的表达载体中。Lai，H.等人，Proc Natl Acad Sci U S A 107，2419-2424，doi：10.1073/pnas.0914503107(2010)。随后将6D8在前文所述的本生烟(N.benthamiana)植物中瞬时表达。Yang，M.等人，Plant Biotechnol J16，572-580，doi：10.1111/pbi.12796(2018)。通过蛋白质A亲和色谱从本生烟(N.benthamiana)叶片分离6D8 mAb并将其纯化至>95％的同质性。Fulton，A.等人，J Chromatogr A 1389，128-132，doi：10.1016/j.chroma.2015.02.013(2015)。

实施例8.6D8的单体Fab的产生

使用Pierce Fab制备试剂盒(Thermo Scientific)根据制造说明书(ThermosScientific Pub.No.MAN0011651)从6D8制备单体Fab片段。简言之，首先将纯化的6D8用固定至琼脂糖珠的木瓜蛋白酶在37℃孵育6-12hr。随后通过在5000xg下离心1分钟回收消化的mAb混合物，并且在蛋白质A色谱柱上分离。在流过级份中收集Fab片段，同时在蛋白质A柱上捕获Fc片段和未消化的mAb。通过在还原条件和非还原条件下进行SDS-PAGE分析证实了单体Fab的成功产生。

单分子电导测量

分子电导的可再现两点测量需要可再现的接触，⁷因此在单个整合素分子(通过其同源配体仅与两个电极之一结合)中可再现地观察到大(nS级别)的电导波动是令人惊讶的发现。(8)这一先前的工作没有探测低偏压区域(其中没有波动)，因为泄露电流掩盖了通过蛋白质的任何直流电流。在这里，扫描隧道显微镜(STM)用于进行溶液中的单分子测量，系统性地探索了特异性和非特异性接触二者的作用。使用适当绝缘的STM探针⁹和电极的电位控制，将背景泄露电流降低到在整个偏压范围上小于1pA。通过充分稳定，STM间隙在一分钟内保持恒定，因此可以禁用间隙控制伺服，缩回尖端，并且记录电流-电压(IV)曲线。在重新接合伺服和在底物的另一个区域上重复过程之前，记录了多达60条此类曲线(上扫和下扫)。为得到两个特异性接触，使用二价抗体(IgE和两个IgG's)(其中的每一个呈递两个结合位点)，以及与至多四个生物素分子结合的链霉抗生物素蛋白，因此表位或生物素功能化的电机可以通过特异性的键桥接。在使用裸金属电极的情况下，用平均酶分子2.5个表面硫醇修饰的链霉抗生物素蛋白上的表面硫醇进行接触。此外，使用整合素重复测量，该整合素可以与两个肽功能化电极中的仅一个形成特异性键。蛋白质和配体在表1中列出。

测得的电导取决于接触

只有在蛋白质与两个电极中的至少一个特异性结合时才能观察到电流。通常，在缩回后的数秒中没有记录到电流，随后在结合蛋白质存在下电流跳至较大(并且可变)的值。尽管电流在分钟时间尺度上波动，其通常在数秒内是稳定的，因此在上扫时记录的曲线的80％可在下扫时再现(数据未示出)。对照物(仅缓冲液或在溶液中仅有非同源蛋白质)没有给出信号。对于抗DNP(数据未示出)以及高于0.1V的所有其他蛋白质研究，也观察到对于整合素报告的快速波动(ms-时间尺度)电报噪声(TN)。这是普遍存在的蛋白质捕获信号，表明在所有情况中相同的两级转换。这些波动最初是在固定结芯片中捕获的蛋白质观察到的⁸，尽管现在的工作使用STM，但在芯片中以及在STM中重复了TN测量以显示在测量方法中不存在一些人为影响(数据未示出)。TN的电压阈值不取决于间隙，直到接触几乎被破坏(数据未示出)，这意味着其与受电位降驱动的接触波动有关，该电位降大部分发生在接触处，如先前提出⁸和下文中更详细讨论的。

除了TN之外，响应是线性的，因此每个IV轨迹可以通过单个电导值G来表征。测得的G的分布遵循在单分子测量中通常观察到的对数正态分布(数据未示出)。¹⁰该分布类似于在固定间隙和偏压下记录电流对时间所获得的电流值分布(数据未示出)，因此该分布归因于电极和分子之间不同类型的接触。整合素(间隙＝4.5nm)和硫代链霉抗生物素蛋白(间隙＝2.5nm)的分布在约0.3nS处有单峰(数据未示出)。使用裸金属电极捕获硫代链霉抗生物素蛋白，其中硫醇介导的接触取代了电极表面上的污染物，¹¹形成直接的金属-分子接触。仅通过两个电极之一处的环状RGD肽捕获整合素，并且除非两个电极都被功能化，否则不会观察到信号。用肽功能化允许在非特异性偶联的电极处与蛋白质上的亲水位点进行非特异性接触。三种抗体产生两个电导峰(～0.3nS和～2nS)，表明存在两种结合模式：对于整合素的nS-S，以及当两个抗原结合位点均特异性结合时所需的S-S(数据未示出)。这一解释通过以下方式测试：用巯基乙醇替换一个电极上的肽，使其亲水并能够形成NS-S桥。仅观察到单峰(数据未示出)。作为进一步的测试，从抗Ebola IgG制备仅具有单价结合头的Fab片段。该片段太小以致无法桥接4.5nm的间隙，因此记录2.5nm间隙中的数据。电导分布中仅有单峰，反映了单个NS-S接触(数据未示出)。因此，较高的电导峰必须对应于通过两个抗原结合位点的传导。为看到这种效应，数据集必须由单分子接触占主导。引人注目的是，单Fab片段跨越2.5nm间隙的电导远小于抗体跨越4.5nm间隙的电导(数据未示出)。这表明蛋白质的固有内部电导远高于测得的(接触限制的)值。这一发现解释了之前测得的尺寸相差极大的蛋白质的相似电导的报道(12，13)。

电导不取决于间隙尺寸

通过在不同间隙尺寸下使用上文所述技术但增加初始尖端缩回量进行的一系列测量来说明内部(通过分子的(14))高电导路径的存在(数据未示出)。引人注目的是，尽管数据积累的频率下降，但电导峰值不随间隙尺寸改变(数据未示出)。这一效果反应了在给定高度下可用于接触的探针面积。当间隙与蛋白质高度相当时，可用位点极少(对于表1中蛋白质数据库中可见的类似结构列出)。先前已报道了天青蛋白(azurin)(参见Ruiz等人(15)的SI)与探针和底物之间捕获的棒状分子之间的与间隙无关的电导。(14)如上面指出的，接触点随着测量的(～分钟)进程变化，这反应了STM探针位置的埃尺度变化。证实这些不同的接触几何形状产生了电导分布的整体形状(数据未示出)。由于分布在不同间隙尺寸下保持了相同的峰位置和形状，数据表明，没有迹象显示蛋白质在较小间隙尺寸下“被挤压”。

TN导通的电压阈值与间隙尺寸的关系图显示电压阈值不随间隙尺寸显著变化。因此，TN波动必须由金属-分子界面的局部电场驱动，在整个蛋白质内部的电位下降相对较小。这也与我们的以下发现一致，即TN的寿命与电流峰值呈指数关系，这一观察结果可由电路中主导电导的单个“弱链”隧道结来解释。(8)

电导对蛋白质结构的变化敏感

由于电导路径在内部或沿着表面轮廓均遵循蛋白质几何形状，因此蛋白质几何形状的变化以及由此而来的传导路径的变化会影响哪些接触点控制电导。这将能够直接感测蛋白质的结构变化。这一效果在图7A中证实。硫化链霉抗生物素蛋白样品中的生物素络合显著改变了电导分布(图7A)。链霉抗生物素蛋白分子具有四个生物素结合位点，(16)因此未硫化的载脂蛋白可以通过两个生物素交联。合成硫化生物素，并用其使探针和底物二者功能化(图7B)，随后将载脂蛋白-链霉抗生物素蛋白流入样品池中。由此产生的G分布有三个峰，最高值接近7nS。因此，测得的电导对蛋白质结构的局部变化和接触的化学性质二者敏感，表明接触是如何受到蛋白质结构变化影响的。将硫代链霉抗生物素蛋白连接到底物上，并用生物素化探针进行探测，类似的结果(数据未示出)表明单一生物素介导的接触足以在～7nS时产生高电导状态。

可能的机理

电子隧穿衰减过快以致无法进行长距离传输。隧穿电导可从G～G₀exp(-βx)估算，其中G₀为77μS，(24)对于～4nm的小蛋白，这得到G<10^-21S，比观察到的小12个量级。为解释在10nm距离上的nS电导的观察结果，需要在充分研究的DNA情况中，当易电离的鸟嘌呤之间的距离超过三个核苷酸时，热激活的跳跃(17)导致几乎与距离无关的传输。(18)在肽中已观察到相似的传输(经由易氧化的氨基酸)。(19)在这些情况中，传输受电荷注入限制，使用以630nm(～2eV)光激发的发色团克服～1.5eV的电荷注入势垒。如果相似传输机理在从电极注入电荷的情况中起作用，则势垒将由Pd的费米能(功函5.2eV)与易氧化残基酪氨酸和色氨酸的绝对氧化还原电位之间的能隙决定。相对于NHE，这些电位是～+1至+1.2V(20)(21)，因此使用4.4eV作为NHE的功函(22)得到了真空下约5.4-5.6eV的绝对电位，或者对应于Pd的费米能的+0.2至0.4eV势垒。因此，必须通过与蛋白质和电极结合相关的键极化来克服这种幅度的势垒。这符合对通过硫醇链接附接到贵金属表面的小分子所观察到的功函变化范围。(23)在三种情况下获得显著电流：(a)当经由直接的硫醇介导的结合与两个电极接触时；(b)当一个键通过与表位或配体的特异性结合形成并且另一个通过附接到电极的亲水分子与蛋白质的亲水外部之间的非特异性相互作用形成时；和(c)当蛋白质通过两个电极处的识别配体结合(在所有情况下配体均经由硫醇链接到电极)时观察到最大电流。弱的非特异性键不会导致显著的电流：至少一个附接必须经由共价的或配体介导的链接进行。因此，如果蛋白质本身没有被共价修饰为直接与电极结合，则通过与至少一个特异性配体结合来克服电荷注入势垒。

已证实接触处界面电荷的少量变化会强烈影响传输(24)，如果要避免法拉第电流，这是我们可以使用电位控制来改变的一个变量，尽管只能在小范围上进行。据推测，由于界面处的键极化，较小的变化由较大的场主导。除了氨基酸残基的氧化还原电位之外，蛋白质的三维折叠也必须起重要作用。这是因为在断裂结中被拉伸的小肽不导电(25)，但是在电极表面上折叠的小肽导电。(26)这可以是一些特殊几何形状(27)或者氢键排列的结果。(28)

最后，我们转向设定在±100mV施加偏压以上的波动。这一阈值电压与间隙尺寸的较小相关性(数据未示出)与蛋白质内部电导远高于接触处的电导的假设相一致，这意味着这些信号来自接触本身的电压驱动波动。在我们的整合素早期研究(8)中，我们提出了这样一种机理，其中我们证明了“开(on)”状态的寿命，τ，与电报噪声峰值的峰值电流，i_p，经由如下方程相关：τ∝ln(i_p)，其关系可通过决定电流和结合强度二者的单一势垒来解释。一旦打开，电流随电压线性增长，表明打开了新的欧姆电导通道(数据未示出)。这种打开过程通过以下形式的指数来描述：其中V_c是激活电压。拟合屈服V_c～0.25V，其是水中氢键强度的特征值(29)，表明氢键可能是电路中的“弱链接”。

值得注意的是，如上文所述，该0.25V势垒类似于从氨基酸的氧化还原电位推导出的电荷注入势垒。如果电荷注入速率受到0.22至0.47V势垒上的热激活跳跃的限制，并且正是这个速率决定了电导，那么我们将期望观察到如下的电导：其中0.22<V<0.47伏，得自12nS到0.5pS，该范围包括这里报告的值。

特异性结合在电子电导中的作用

我们的结论是，特异性配体-受体相互作用形成了与蛋白质的良好电连接。这通过图7A和图7B中所示的数据来说明。与经由硫醇末端的乙烷链接来链接到电极的非共价链霉抗生物素蛋白-生物素偶联(6.8nS)相比,经由直接与金属电极结合的表面赖氨酸的共价(硫醇)修饰进行的连接得到了较低的最大电导(0.56nS)。当仅使用一个生物素化接头时，电导几乎没有改变(数据未示出)。因此，相比于与亲水外部的较强偶联，与蛋白质疏水内部的较弱偶联更为有效，即使在仅进行一个此类偶联也是如此。如果，一旦注入，电子很容易在蛋白质内部移动，那么第二个(非特异性)接触将仅作为蛋白质亲水表面的势垒。这种机理可以解释当仅在一个位点通过配体结合时整合素的高电导，以及当两个接触点均为非共价和非特异性时的完全无电导。

参考文献

以下参考文献在此通过引用整体并入：

美国专利申请62/673,080(2018年5月17日提交)。

美国专利申请62,682,991(2018年6月10日提交)。

1.Wilner，I.，E.Katz，A.Riklin,and R.Kasher，Mediated electron transferin glutathione reductase organized in self-assembled monolayers on Auelectrodes.J.Am.Chem.Soc.，1992.114：p.10965-10966.

2.Bostick，C.D.，S.Mukhopadhyay，I.Pecht，M.Sheves，D.Cahen,andD.Lederman，Protein bioelectronics：a review of what we do and do notknow.Reports on Progress in Physics，2018.81：p.026601.

3.Adhikari，R.Y.，N.S.Malvankar，M.T.Tuominen,and D.R.Lovley，Conductivity of individual Geobacter pili.RSC Advances，2016.6：p.8354-8357.

4.Malvankar，N.S.，M.Vargas，K.P.Nevin，A.E.Franks，C.Leang，B.C.Kim，K.Inoue，T.Mester，S.F.Covalla，J.P.Johnson，V.M.Rotello，M.T.Tuominen,andD.R.Lovley，Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowirenetworks.Nat Nanotechnol，2011.6(9)：p.573-9.

5.Zhang，B.，W.Song，P.Pang，H.Lai，Q.Chen，P.Zhang,and S.Lindsay，The Roleof Contacts in Long-Range Protein Conductance.Proc Natl Acad Sci U S A，2019.submitted.

6.Vattay，G.a.，D.Salahub，I.a.Csabai，A.Nassimi,and S.A.Kaufmann，QuantumCriticality at the Origin of Life.Journal of Physics：Conference Series2015.626：p.012023.

7.Cui XD,et al.(2001)Reproducible measurement of single-moleculeconductivity.Science(New York，N.Y.)294(5542):571-574.

8.Nitzan A(2006)Chemical dynamics in condensed phases(OxfordUniversity Press.，Oxford).

9.Tuchband M，He J，Huang S，&Lindsay S(2012)Insulated gold scanningtunneling microscopy probes for recognition tunneling in an aqueousenvironment.Rev Sci Instrum 83(1):015102.

10.Chang S,et al.(2012)Chemical recognition and binding kinetics in afunctionalized tunnel junction.Nanotechnology 23(23):235101

11.Smith T(1980)The hydrophilic nature of a clean goldsurface.J.Colloid Interface Science 75:51-55.

12.Bostick CD,et al.(2018)Protein bioelectronics：a review of what wedo and do not know.Reports on Progress in Physics 81:026601.

13.Nadav Amdursky,et al.(2014)Electronic Transport viaProteins.Advanced Materials 26:7142–7161.

14.Leary E,et al.(2011)Unambiguous one-molecule conductancemeasurements under ambient conditions.Nano letters 11(6):2236-2241.

15.Ruiz MP,et al.(2017)Bioengineering a Single-ProteinJunction.Journal of the American Chemical Society 139(43):15337-15346.

16.Sano T&Cantor CR(1990)Cooperative biotin binding bystreptavidin.Journal of Biological Chemistry 25:3369-3373.

17.Giese B&Spichty M(2000)Long distance charge transport through DNA：quantification and extension of the hopping model.Chemphyschem 1(4):195-198.

18.Giese B，Amaudrut J，Kohler AK，Spormann M，&Wessely S(2001)Directobservation of hole transfer through DNA by hopping between adenine bases andby tunnelling.Nature 412(6844):318-320.

19.Aubert C，Vos MH，Mathis P，Eker AP，&Brettel K(2000)Intraproteinradical transfer during photoactivation of DNA photolyase.Nature 405(6786):586-590.

20.Harriman A(1987)Further comments on the redox potentials oftryptophan and tyrosine.Journal of Physical Chemistry 91:6102-6104.

21.Odella E,et al.(2018)Controlling Proton-Coupled Electron Transferin Bioinspired Artificial Photosynthetic Relays.Journal of the AmericanChemical Society 140(45):15450-15460.

22.Tripkovic V，Skúlason E，&Rossmeisl J(2011)Standardhydrogen electrode and potential of zero charge in density functionalcalculations.Phys.Rev.B 84:115452.

23.Alloway DM,et al.(2003)Interface Dipoles Arising from Self-Assembled Monolayers on Gold：UV-Photoemission Studies of Alkanethiols andPartially Fluorinated Alkanethiols.J.Phys.Chem.B 107:11690-11699.

24.Garg K,et al.(2018)Interface Electrostatics Dictates the ElectronTransport via Bioelectronic Junctions.ACS Appl Mater Interfaces.

25.Xiao X，Xu B，&Tao N(2004)Conductance titration of single-peptidemolecules.Journal of the American Chemical Society 126(17):5370-5371.

26.Guo C,et al.(2016)Tuning electronic transport via hepta-alaninepeptides junction by tryptophan doping.Proc Natl Acad Sci U S A 113(39):10785-10790.

27.Vattay Ga，Salahub D，Csabai Ia，Nassimi A，&Kaufmann SA(2015)QuantumCriticality at the Origin of Life.Journal of Physics：Conference Series 626:012023.

28.Lagunas A,et al.(2018)Long distance electron transfer through theaqueous solution between redox partner proteins.Nat Commun.9:5157.

29.Jeffrey GA(1997)An Introduction to Hydrogen Bonding(OxfordUniversity Press New York).

对本领域技术人员来说明显的是，本公开的具体实施方式可能涉及以任何方式组合的上述和下述实施方式中的一个或多个。

尽管阐述了具体材料、配方、操作顺序、工艺参数和最终产品以描述和例示本发明，它们并非旨在限制。相反，本领域技术人员应注意到的是，书面公开仅是示例性的，可以在本公开的范围内做出各种其他替代、改变和修改。因此，本公开不限于本文所述的具体实施方式，而是仅由后面的权利要求限制。

序列表

<110> Lindsay, Stuart

Zhang, Bintian

Deng, Hanqing

<120> 生物电子电路、系统及其制备和使用方法

<130> 0118090.208-WO1

<150> 62799006

<151> 2019-01-30

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Cys Ala Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Cys His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln

1 5 10 15

Val

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Gly Asn Ser Thr Asn Gly Thr Ser Asn Gly Ser Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp

20 25 30

His Glu Gly Ala Ser Ser

35

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Gly Asp Ser Thr Asp Gly Thr Ser Asp Gly Ser Ser

1 5 10