具体实施方式

本发明部分基于存在改进分析物测试的特异性的需求的认知。在传统试验装置中，指示受试者存在第一状态的阳性试验结果可以基于识别来自受试者的样本中存在分析物(例如通过在试验装置的检测区中观察与分析物相关联的可检测标记的积聚)。然而，在分析物与超过一种状态相关联的情况下，则有存在分析物并不一定意味着受试者中存在第一种状态的风险。本发明通过利用受试者的样本中额外的标志物的存在或不存在来调节试验装置响应样本中分析物的存在而在检测区中产生可检测的信号的能力来解决这个问题。本发明考虑使用样本中存在一种或更多种阴性标志物来减少到达检测区并产生信号的与分析物相关联的经标记偶合物的量。本发明还考虑使用样本中不存在一种或更多种阳性标志物来减少到达检测区并产生信号的与分析物相关联的经标记偶合物的量。单独或结合使用这两种策略，都降低了在受试者不存在第一状态的情况下，在检测区中产生信号(即观察到阳性试验结果)的风险。

这一原则的一个非限制性实施例是在妊娠测试的背景下。在此实施例中，指示妊娠的分析物(但也可能存在于诸如绝经期或围绝经期的其他状态)是hCG。根据本发明，诸如FSH(在围绝经期或绝经期升高)的妊娠阴性标志物可用于减少到达检测区并产生信号的与hCG相关联的经标记偶合物的量。在所述实施例中，试剂区可以包括能与hCG和FSH两者相关联的可移动的经标记偶合物(例如，可以包含抗hCG抗体和抗FSH抗体)。可以在试剂区下游和检测区上游提供FSH捕获区(对用户不可见，或可见但不能由用户解读，或实际上未被装置测量)。在样本含hCG而不含FSH的情况下，可移动的经标记偶合物与hCG相关联，穿过捕获区并在检测区结合，从而使得在检测区观察到信号，指示受试者妊娠。在样本含hCG和FSH的情况下(例如因为受试者处于围绝经期)，所述可移动的经标记偶合物能与hCG和FSH相关联以形成复合物。复合物在FSH捕获区被捕获，因此不能移动到检测区。所以，虽然样本含hCG，但相对于在存在hCG而不存在FSH的情况下，到达检测区并产生可观察信号的经标记偶合物的量减少。

根据本发明，诸如P3G的妊娠阳性标志物，能用于调节到达检测区并产生信号的与所分析物相关的经标记偶合物的量。例如，试剂区可能包括能与hCG和P3G两者相关联的可移动的经标记偶合物(例如，可以包含抗hCG抗体和抗P3G抗体)。可以在试剂区下游和检测区上游提供捕获区(对用户不可见，或可见但不能由用户解读，或实际上未被装置测量)并且可以包括P3G偶合物。检测区可包含例如抗hCG抗体。在样本含hCG和P3G的情况下，可移动的经标记偶合物会与hCG和P3G相关联以形成复合物，以阻止捕获区的P3G偶合物捕获复合物。复合物穿过捕获区并通过样本中的hCG结合于检测区处，从而使得在检测区观察到信号，指示受试者妊娠。在样本含hCG而不含P3G的情况下，可移动的标记偶合物会与hCG相关联以形成复合物。P3G偶合物在捕获区中捕获经标记试剂，阻止其继续进入检测区。所以，虽然样本中含hCG，但是到达检测区并产生可观察信号的经标记偶合物的量减少。在可选的布置中，P3G偶合物能替代地提供在可移动的偶合物上，并且在捕获区中提供配置为捕获P3G或P3G偶合物的固定的捕获物质(例如抗P3G抗体)。在这个实施方案中，在样本含P3G的情况下，其会被捕获区捕获，意味着含P3G偶合物的经标记偶合物不会在捕获区中被捕获，并且能够继续进入检测区，其在检测区中其会与样本中的hCG进行反应并产生信号。在样本中存在hCG但不存在P3G的情况下，可移动的偶合物会被捕获区的固定的捕获物质捕获并且不能继续进入到检测区。所以，虽然样本中含hCG，但相对于hCG和P3G都存在的情况下，进入检测区并产生可观察信号的经标记的偶合物的量减少。

本发明的一个应用是提供改进的高灵敏度的妊娠测试，它具有改进的特异性，允许更早地确定妊娠。这种改进的妊娠测试对围绝经期或绝经后的个体特别有用，因为在这些个体未妊娠的情况下，能降低因测试样本中少量脑垂体来源的hCG，而获得阳性结果的风险。应当理解，该原理可以应用于其他分析物和标志物，包括与其他状态相关联的那些。例如，人们可以设想基于识别样本中分析物A来测试疾病X的试验。分析物A也存在于状态Y中。阴性标志物N在状态Y中以相对较高的水平存在，而在疾病X中不存在或以相对(显著)较低的水平存在。本发明的试验装置可包括含针对分析物A的结合试剂和针对阴性标志物N的结合试剂的可移动的经标记偶合物、含阴性标志物N的结合试剂的固定的捕获物质的捕获区以及含针对分析物A的固定的结合试剂的检测区。在施加于装置的样本中存在阴性标志物N和分析物A(因为样本来源的受试者存在状态Y而不是疾病X)的情况下，N与经标记偶合物结合以形成于捕获区处结合的复合体。所以，在样本中存在阴形标志物N的情况下，捕获区减少了到达检测区并在分析物A存在的情况下产生可观察信号的经标记偶合物的量。所以，尤其是在存在状态Y而测试含分析物A的样本的情况下，降低了阳性结果指示存在疾病X的风险，提高了测试的特异性。

在另一个实施例中，测试疾病X的试验可以基于对样本中分析物A的识别。分析物A也存在于状态Y中。阳性标志物P在疾病X中以相对较高的水平存在，而在状态Y中不存在或以相对(显著)低的水平存在。本发明的试验装置可包括含针对分析物A的结合试剂和针对阳性标志物P的结合试剂的可移动的经标记偶合物、含固定的阳性标志物或阳性标志物偶合物的捕获区以及含针对分析物A的固定的结合试剂的检测区。在样本中存在阳性标志物P和分析物A的情况下，针对阳性标志物P的结合试剂会结合样本中的阳性标志物P，阻止经标记偶合物在捕获区被固定的阳性标志物或阳性标志物偶合物捕获。经标记偶合物会继续进入检测区，在此其被针对分析物A的固定的结合试剂捕获，因此在检测区产生指示存在疾病X的信号。在样本中存在分析物A而不存在阳性标志物P的情况下，经标记偶合物的针对阳性标志物P的结合试剂将结合捕获区中固定的阳性标志物或阳性标志物偶合物，阻止经标记偶合物继续进入检测区。因此，在样本中存在分析物而不存在阳性标志物P的情况下，捕获区减少了到达检测区并产生可观察信号的经标记偶合物的量。

本发明的装置可适应于包括可移动试剂和固定的捕获物质，以在存在任意量的额外阴性标志物和/或不存在任意量的额外阳性标志物的情况下减少到达检测区的经标记偶合物的含量。

试验流动路径

在一个实施方案中，本发明的试验装置包含试验流动路径，该流动路径包含试剂区、一个或更多个捕获区和检测区。该捕获区或每个捕获区在试剂区的下游，检测区在该捕获区或每个捕获区的下游。

“上游”和“下游”用于参考施加到装置的样本的流动方向来描述试验装置的组分的位置。如果组分A位于组分B的上游和/或组分B位于组分A的下游，则施加到装置(在预定的样本施加位置)的样本将先到达组分A，后到达组分B。

干燥的结合试剂提供在微流体装置的流动路径中，或在侧流型装置的情况下提供于多孔载体材料上，该多孔载体材料提供在含检测区的多孔载体材料上游。该上游的多孔载体材料可以是大孔的。大孔载体材料应是低或非蛋白质结合的，或者应很容易地被BSA或PVA等试剂封闭，以最大限度地减少非特异性结合并在大孔载体被液体样本润湿后促进经标记试剂的自由移动。在有需要的情况下，可以用表面活性剂或溶剂对大孔载体材料进行预处理，以使其更具亲水性并促进液体样本的快速吸收。此外，可以使用一种或更多种糖类(例如蔗糖、海藻糖)来稳定和帮助移动经标记试剂。这些可以作为溶液的一部分方便地施加到流动路径和/或多孔载体材料上，在溶液中经标记试剂施加到多孔载体上。大孔载体的合适材料包括塑料材料(例如聚乙烯和聚丙烯)或其他材料(例如纸或玻璃纤维)。在经标记结合试剂标记有可检测颗粒的情况下，大孔载体的孔径可以至少是标记颗粒的最大颗粒尺寸的十倍。较大的孔径可以更好地释放经标记试剂。

试验流动路径可能包含侧流多孔载体。多孔载体材料通常是一种具有高蛋白质结合能力的材料，在施加试剂以形成固定的捕获和检测区后，其被诸如BSA或PVA之类的试剂封闭，以最大限度地减少非特异性结合并促进大孔载体被液体样本润湿后经标记偶合物自由移动。可用作多孔载体的合适材料包括硝基纤维、醋酯纤维、纤维素或纤维素衍生物、聚酯、聚酰胺、聚烯烃或玻璃纤维。多孔载体可包含硝化纤维。它的优点是无需预先进行化学处理即可稳固地固定结合试剂。如果多孔固相材料包含纸，例如，抗体的固定可以通过使用诸如CNBr、羰基二咪唑或三氟乙烷磺酰氯的化学偶联进行。测试装置可能包含加样区。它是一个多孔(通常是吸水)材料的区域，可以将水性样本(例如尿液)施加到该区域。

侧流动型试验流动路径一种替代方式是“流通(flow through)”试验装置。在这样的装置中，样本基本上垂直而不是侧向流动。优选地，装置包含加样区；含一个或更多个如本文所述的捕获区的一张或更多张膜，垂直或基本垂直地设置在加样区下方；以及含如本文所述的检测区的膜，垂直或基本垂直地设置在一张或更多张捕获区膜的下方。样本被施加到加样区并且向下流动通过该捕获区膜或每张捕获区膜，以到达检测区膜。通过诸如从流通装置的底面观察或读取检测区来确定试验结果。流通试验装置可包括或不包括如前所述的试剂区。如果提供有试剂区，则其位于捕获区膜上游(沿大致垂直方向)的另外的膜中。这样的试剂区可以包括处于干燥状态的本文所述的任何试剂(例如经标记偶合物)。或者，或另外，可在捕获区膜附近提供干燥状态的诸如本文所述的经标记偶合物的试剂。或者，经标记偶合物可单独提供并在施加样本之前或之后施加到装置上，或与样本一起施加到装置上。例如，此类试剂可在施加于装置之前与样本混合。本发明包括试剂盒，试剂盒含如本文所述的流通试验装置、如本文所述的经标记试剂和任选的本文所述的任何其他试剂(例如，在试剂区中提供的试剂)。

通常，通过用户直接在加样区小便来施加样本。或者，可以把加样区浸入含样本的容器中。在样本是血液、血清或血浆的情况下，可以使用移液管或其他仪器将样本施加到装置上，然后可以添加洗脱缓冲液以沿试验流动路径移动样本组分。

加样区优选在试剂区的上游。

可以在试验流动路径的远端、下游端提供吸收“水槽”。吸收水槽可以优选地包含高吸收性材料，例如，CF7瓦特曼纸，并且应提供足够的吸收能力以从检测区附近去除任何未结合的标记。延伸出检测区的具有一定长度的固相多孔材料可以作为这种水槽的替代物。提供高吸水性水槽的优点是其从试验流动路径中去除或基本上去除了过量的经标记结合试剂，最小化各个区域附近未结合的经标记结合试剂的量。去除或减少检测区(以及对照区，如果有)附近未结合的经标记试剂有助于确定正确测试结果。

试剂区

本发明中试验装置的试剂区包含可含可检测的标记的移动的经标记偶合物。

“可移动”物质指在干燥状态下与基质(例如试验流动路径的组分)相关联，并且在与流体接触的情况下可移动并能沿基质流动的物质。

经标记偶合物中的“标记”在上下文中是指能够产生可被视觉或仪器构件检测的信号的任何物质。本发明中适用的各种标记包括能通过化学或物理构件(例如可光学检测的)产生信号的标记。此类标记包括酶和底物、色素原、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、电活性物质、染料分子、放射性标记和粒子标记。粒子标记可包括磁性或带电标记，其可通过磁性或电化学构件检测。标记可以共价连接到结合试剂。标记可以是可光学检测的。优选的可光学检测标记包括下文中的胶体金属粒子标记和染料粒子。

标记可以包括胶体金属粒子(例如金、银、铂、银增强金溶胶、碳溶胶或碳纳米粒子)、胶体准金属或非金属粒子(如碲或硒)、或染色或着色的粒子(例如掺入染料或染料溶胶的聚合物粒子)。染料可以是诸如蓝色的任何合适的颜色。染料可以是荧光的，或者包括量子点。合适的荧光材料为本领域技术人员所熟知。染料溶胶可由市售的疏水染料制备(例如Foron Blue SRP(Sandoz)和Resolin Blue BBLS(Bayer))。合适的聚合物标记可选自一系列合成聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯基甲苯、聚苯乙烯-丙烯酸和聚丙烯醛)。所用单体通常是水不溶性的，并在水性表面活性剂中乳化，从而使得形成单体胶束，然后通过向乳剂中添加引发剂来诱导聚合，产生近球形的聚合物颗粒。这种聚合物颗粒的理想尺寸范围是从大约0.05μm到大约0.5μm。更大的聚合物颗粒也能偶联到适当尺寸的多孔膜上来使用。根据示例性的实施方案，标记是金胶体，优选颗粒平均直径在0.02μm至0.25μm范围内。在一个实施方案中，标记是蓝色胶乳。在一个实施方案中，标记是金溶胶。在一个实施方案中，标记是40nm金溶胶。

目前来说，术语“结合试剂”是指结合对(即，两个不同的分子，其中，一个分子通过化学和/或物理方式结合第二个分子)中的一方，。这两个分子在某种意义上是相关的，即它们彼此结合使得其能够将它们的结合配偶体与具有相似特征的其他试验成分区分开来。结合对的成员可以称为配体和受体(抗配体)、结合对成员和结合对配偶体等。分子也可以是分子聚集的结合对成员；例如，用于二抗的免疫复合物的抗体及其相应抗原可被认为是免疫复合物的结合对成员。结合试剂通常是特异性结合试剂。例如，结合试剂可特异性结合hCG的α亚基和FSH上的α亚基、促黄体激素(LH)上的α亚基或促甲状腺激素(TSH)上的α亚基。特异性结合试剂可以是结合hCG的β亚基的结合试剂。

结合试剂可由抗体组成或包含抗体。如本文所使用的，术语“抗体”包括完整抗体及其抗原结合片段。抗原结合片段可以通过常规技术产生。此类片段的示例包括但不限于Fab、F(ab')2和Fv片段。结合试剂可以由适体组成或包含适体。结合试剂可由affimer组成或包含affimer。用于本发明的诸如抗体的结合试剂可从各种供应商处(例如MedixBiochemica Espoo，Finland)获得。

除了抗原和抗体结合对成员之外，其他结合对包括但不限于生物素和亲和素、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、互补肽序列、效应子和受体分子、酶辅因子和酶、酶抑制剂和酶、肽序列和对该序列或整个蛋白质具有特异性的抗体、聚合酸和碱、染料和蛋白质结合剂、肽和特异性蛋白质结合剂(例如，核糖核酸酶、S-肽和核糖核酸酶S-蛋白质)等。此外，特异性结合对可以包括原始特异性结合试剂的类似物。

在一些实施方案中，可移动的经标记偶合物包含用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件以及用于将经标记偶合物与样本中可能存在的第一阴性标志物相关联的构件。

用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件可以包含结合试剂或由结合试剂组成。结合试剂可直接或间接结合分析物。在结合试剂间接地结合分析物的情况下，连接到第一结合配偶体的可移动的分析物结合试剂可以与经标记偶合物分开提供(例如在试剂区中)。在这些实施方案中，经标记偶合物可以与针对第一结合配偶体的第二结合配偶体一起提供。这样，针对分析物的结合试剂可以被定位到经标记偶合物处，而不直接连接到经标记偶合物。第一和第二结合配偶体可以是任何彼此特异的合适的结合配偶体(例如抗体-抗原)。示例包括结合试剂对，例如生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。

结合对中的任一方可以连接到经标记偶合物，而另一方提供在例如试剂区中或沿着流动路径但在捕获区上游的其他地方。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。这个概念可以适应于将本文公开的其他结合成员定位在试验流动路径上的理想位置。

用于将经标记偶合物与分析物的相关联构件可以包含抗体或由抗体组成(例如结合分析物的表位的抗体)。

用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件可以包含结合试剂或由结合试剂组成。结合试剂可直接或间接结合第一阴性标志物。在结合试剂与第一阴性标志物间接结合的情况下，与第一结合配偶体连接的可移动的第一阴性标志物结合试剂可以与经标记偶合物分开提供(例如，在试剂区中)。在这些实施方案中，经标记偶合物可以与针对第一结合配偶体的第二结合配偶体一起提供。这样，针对第一阴性标志物的结合试剂可以被定位在经标记偶合物处，而不直接与经标记偶合物连接。第一和第二结合配偶体可以是任何彼此特异的合适的结合配偶体(例如抗体-抗原)。示例包括结合试剂对(例如生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体)。

结合对中的任一方可以连接到经标记偶合物，而另一方提供在例如试剂区中或沿着所述流动路径但在捕获区上游的其他地方。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。这个概念可以适应于将本文公开的其他结合成员定位在试验流动路径上的理想位置。

用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件可以包含抗体或由抗体组成(例如结合第一阴性标志物的表位的抗体)。

用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件和用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件可以是相同的。例如，经标记偶合物可以直接或间接连接到抗体上，该抗体可结合分析物或第一阴性标志物。该抗体可以结合分析物和第一阴性标志物共有的表位。该抗体可以结合分析物和第一阴性标志物共有的结构域。在分析物是hCG并且第一阴性标志物是FSH的情况下，可移动的经标记偶合物可以包含能结合hCG的α亚基的抗体。FSH和hCG都是异源二聚体分子，含α和β亚基。FSH和hCG的α亚基基本相同，因此用于α亚基的抗体可以结合FSH和hCG两者。在一些实施方案中，用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件和用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件是不同的。例如，经标记偶合物可以直接或间接连接与分析物结合但不与第一阴性标志物结合的抗体，并且还直接或间接连接到与第一阴性标志物结合但不与分析物结合的抗体。

在一些实施方案中，可移动的经标记偶合物包含阳性标志物或阳性标志物偶合物，其中阳性标志物偶合物的阳性标志物部分能用于结合。阳性标志物或阳性标志物偶合物可以连接或以其他方式与用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件相关联。在阳性标志物是半抗原的情况下，优选地它与诸如载体的另一部分偶合以形成阳性标志物偶合物。更大的阳性标志物可能会或可能不会与另一个部分偶合。更大的(非半抗原)阳性标志物可以通过诸如物理吸收或化学偶联的方法直接固定在可移动的经标记偶合物上。然而，在直接固定对阳性标志物的结构或其参与结合反应的能力具有不利影响的情况下，可能优选将非半抗原阳性标志物与另一部分连接。阳性标志物可以诸如P3G的黄体酮代谢物。用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件可以是任何本文公开的构件。阳性标志物/阳性标志物偶合物可以与针对分析物的结合试剂偶合，并以本文讨论的方式直接或间接连接至经标记偶合物。例如，在分析物是hCG并且阳性标志物是诸如P3G的黄体酮代谢物的情况下，诸如P3G的黄体酮代谢物可以与抗hCG抗体(例如抗α-hCG抗体)偶合。或者或另外，可在试剂区中单独提供可移动的阳性标志物或阳性标志物偶合物。在这种情况下，可移动的阳性标志物或阳性标志物偶合物能够在移动后与经标记偶合物相关联，从而使得在经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的情况下，阳性标志物或偶合物的阳性标志物部分能用于结合。为了促进这种关联，经标记偶合物和阳性标志物/阳性标志物偶合物可以各自包含结合对的成员，从而使得在结合对的成员彼此接触的情况下，经标记偶合物与阳性标志物/阳性标志物相关联。第一和第二结合配偶体可以是彼此特异的任何合适的结合配偶体(例如抗体-抗原)。在液体接触阳性标志物或阳性标志物偶合物的情况下，阳性标志物或阳性标志物偶合物是可移动的并且能与经标记偶合物相关联。结合对的示例包括生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。任一个配偶体可以连接到经标记偶合物，另一个配偶体(连接到阳性标志物或阳性标志物偶合物)被提供，例如在试剂区或沿着流动路径的在捕获区的上游的其他地方。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。

阳性标志物偶合物包含阳性标志物部分。阳性标志物部分可被诸如抗体的结合剂结合。阳性标志物偶合物可包含诸如P3G的黄体酮代谢物或其部分。阳性标志物偶合物可包含蛋白质载体(例如BSA、卵清蛋白或小鼠抗体)。

在一些实施方案中，可移动的经标记偶合物包含用于将经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件。用于将经标记偶合物与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的构件可以包含结合试剂或由结合试剂组成。结合试剂可直接或间接结合阳性标志物或阳性标志物偶合物。在结合试剂间接结合阳性标志物或阳性标志物偶合物的情况下，与第一结合配偶体连接的针对阳性标志物/阳性标志物偶合物的可移动结合试剂可与经标记偶合物分开提供，例如在试剂区中，或沿着流动路径但在捕获区上游的其他地方。在这些实施方案中，经标记偶合物可以与针对第一结合配偶体的第二结合配偶体一起提供。这样，针对阳性标志物/阳性标志物偶合物的结合试剂能够位于经标记偶合物处而不与标记偶合物直接连接。第一和第二结合配偶体可以是彼此特异的任何合适的结合配偶体(例如抗体-抗原)。示例包括生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。配偶体中的任一个连接到经标记偶合物，而另一个配偶体(连接到针对阳性标志物/阳性标志物偶合物的结合试剂)被提供，例如在试剂区中或沿流动路径的但在捕获区上游的其他地方。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。

用于将经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件可能包含抗体或由抗体组成(例如与阳性标志物的表位结合的抗体)。例如，在阳性标志物是P3G的情况下，用于将经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件可以包含抗P3G抗体或由抗P3G抗体组成。

在一些实施方案中，试剂区进一步包含用于固定在诸如试剂区下游的捕获区的可移动的阳性标志物或阳性标志物偶合物。这种可移动的阳性标志物/阳性标志物偶合物可以包含结合对中的一个成员或与结合对中的一个成员连接。结合对的另一个成员提供在试剂区的下游，如捕获区。可移动的阳性标志物/阳性标志物偶合物因此可以固定在捕获区，从而使得其可与用于将经标记偶合物与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的构件相关联。结合对的示例包括生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。配偶体中的任一个可以连接到可移动的阳性标志物/阳性标志物偶合物，而另一个配偶体被提供，例如在捕获区中。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。

捕获区

本发明的装置包含一个或更多个捕获区，位于试剂区的下游和检测区的上游。一个或更多个捕获区的功能是确保在检测区检测到经标记偶合物能可靠地指示样本来源的受试者中存在第一状态。这一功能的实现是通过：(i)在样本含一个或更多个阴性标志物(优选地是指示不存在第一状态的标志物)的情况下，在捕获区捕获经标记偶合物，从而使得减少到达检测区域的经标记偶合物的量，和/或(ii)除非样本包含一个或更多个阳性标志物(优选地是指示存在第一状态的标志物)，否则在捕获区捕获经标记偶合物，这些阳性标志物从而使得减少到达检测区的标记试剂的量。因此，在存在阴性标志物和/或不存在阳性标志物的情况下，捕获区会减少到达检测区的经标记偶合物的量，从而即使存在少量分析物，也能降低检测区产生可检测信号的可能性。这意味着减少假阳性(即在不存在第一状态的情况下指示存在第一状态)的可能性，提高了测试的特异性。有利地，不仅捕获区可以减少到达检测区的标记偶合物的量，而且捕获区还可以减少到达检测区的分析物的量，因为在捕获区捕获的复合物还可包含分析物。在测试样本来自不具有第一状态的受试者的情况下，这种双重效应显著降低了在检测区检测到信号的风险。优选地，装置不包含捕获区，该捕获区包括能结合分析物的固定的捕获物质。

可以设计捕获区利用样本中一种或更多种阴性标志物的存在来减少到达检测区的经标记偶合物(其可能与分析物相关联)的量。

可以设计捕获区，从而使得样本中存在的一种或更多种阴性标志物减少到达检测区的经标记偶合物(其可能与分析物相关联)的量。捕获区可包含固定的捕获物质，其被配置为捕获含经标记偶合物和第一阴性标志物的复合物。复合物的捕获优选通过与第一阴性标志物的特异性结合反应来实现。优选地，结合反应发生在第一阴性标志物的表位，该表位不同于被用于将经标记偶合物与可移动的经标记偶合物的第一阴性标志物相关联的构件结合的表位，从而形成“三明治(sandwich)”。在样本中存在分析物的情况下，被捕获的复合物还可进一步包含分析物。优选地，针对阴性标志物的固定的捕获物质被配置为不捕获不包含第一阴性标志物的复合物。

一个或更多个捕获区可包含对第一阴性标志物特异的固定的捕获物质。在一些实施方案中，在将含第一阴性标志物的样本施加到试验装置的情况下，第一阴性标志物通过用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件与经标记偶合物相关联，形成第一阴性标志物-经标记偶合物复合物。在样本中也存在分析物的情况下，则复合物还可进一步包含分析物，这是因为经标记偶合物能够结合分析物和阴性标志物两者。在复合物到达含被配置为捕获包含经标记偶合物和第一阴性标志物的复合物的固定的捕获物质的捕获区的情况下，复合物被捕获并且不能流动到检测区。因此，即使样本中存在分析物，样本中存在第一阴性标志物可以阻止或减少到达检测区并产生可检测信号的经标记偶合物的总量。这也有效地减少了到达检测区的分析物的量，进一步减少了含分析物和阴性标志物的样本中检测区的信号。

固定的捕获物质可以直接结合第一阴性标志物。固定的捕获物质可以结合不存在于分析物的第一阴性标志物的表位。固定的捕获物质可包含抗体或由抗体组成。抗体可以结合分析物上不存在的第一阴性标志物的表位。在第一阴性标志物是FSH的情况下，捕获区可以包含固定的抗FSH特异抗体(例如抗β-FSH抗体)。

捕获区可以包含间接结合第一阴性标志物的固定的捕获物质。例如，在一些实施方案中，可以提供对第一阴性标志物特异的、与第一结合配偶体连接的可移动的第一阴性标志物结合试剂，例如在试剂区中或沿着流动路径但在捕获区上游的其他地方。可移动的第一阴性标志物结合试剂可以与不存在于分析物的第一阴性标志物的表位结合。捕获区或每个捕获区可以提供针对第一结合配偶体的固定的第二结合配偶体。这样，可移动的第一阴性标志物结合试剂可以位于捕获区而不被直接固定到流动路径。第一和第二结合配偶体可以是彼此特异的任何合适的结合配偶体(例如抗体-抗原)。示例包括结合试剂对，例如生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。结合试剂对的任一成员可以固定在捕获区，而另一个成员(连接到针对阴性标志物的结合试剂)提供在例如试剂区中或沿着流动路径但在捕获区上游的其他地方。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。这个概念可以适应于将本文公开的其他结合成员定位在试验流动路径上的期望位置。在一个实施方案中，试剂区包括用结合对的第一成员(例如生物素)标记的可移动的抗β-FSH抗体，并且捕获区包括固定的结合对的第二成员(例如抗生物素抗体或链霉亲和素)。这样，抗β-FSH抗体可以位于捕获区而不直接固定在捕获区。这个概念可以适应于用于其他阴性标志物的捕获区。

或者，或另外，可设计捕获区以利用样本中不存在一种或更多种阳性标志物来减少到达检测区的经标记偶合物(其可与分析物相关联)的量。

样本中阳性标志物的存在降低了经标记偶合物在捕获区中被捕获的可能性(例如通过占据捕获区或经标记偶合物的阳性标志物结合位点)。

在一些实施方案中，至少一个捕获区包含固定的捕获物质，固定的捕获物质被配置为捕获阳性标志物或者含阳性标志物/阳性标志物偶合物或与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的经标记偶合物。经标记偶合物的捕获优选通过与阳性标志物/阳性标志物偶合物的特异性结合反应来实现。样本中存在的阳性标志物被固定的捕获物质的结合位点结合(并因此可能占据)，从而使得结合位点不可用于捕获含阳性标志物/阳性标志物偶合物或与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的经标记偶合物。含阳性标志物/阳性标志物偶合物或与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的经标记偶合物因此可以继续进入检测区(除非被本文公开的其他捕获构件阻止)。

样本中的阳性标志物可与装置的阳性标志物/阳性标志物偶合物竞争以在捕获区结合。在样本中不存在阳性标志物的情况下，固定的捕获物质捕获含装置的阳性标志物/阳性标志物偶合物或与装置的阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的经标记偶合物，从而阻止标记偶合物继续进入检测区。固定的捕获物质可以直接结合阳性标志物或阳性标志物偶合物。固定的捕获物质可包含抗体或由抗体组成。在阳性标志物是P3G的情况下，捕获区可以包含固定的抗P3G抗体。

捕获区可包含间接捕获阳性标志物或阳性标志物偶合物的固定的捕获物质。例如，在一些实施方案中，针对阳性标志物/阳性标志物偶合物的与第一结合配偶体连接的可移动的结合试剂提供在如试剂区中或沿着流动路径但在捕获区上游的其他地方。在这样的实施方案中，该捕获区或每个捕获区可以提供有针对第一结合配偶体的固定的第二结合配偶体。这样，针对阳性标志物/阳性标志物偶合物的可移动结合试剂可位于捕获区而不直接固定到流动路径。第一和第二结合配偶体可以是对彼此特异的任何合适的结合配偶体。示例包括结合试剂对，例如生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。结合试剂对的任一成员可以固定在捕获区，而另一个成员提供在如试剂区中。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。

在一个实施方案中，试剂区包括用结合对的第一成员(例如生物素)标记的可移动的抗P3G抗体，并且捕获区包括结合对的固定的第二成员(例如抗生物素抗体或链霉亲和素)。这样，抗P3G抗体可以位于捕获区而不直接固定在捕获区。此概念可适应于用于其他阳性标志物的捕获区。

在一些实施方案中，至少一个捕获区包含被配置为捕获经标记偶合物的固定的捕获物质，该经标记偶合物含用于将经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件。经标记偶合物的捕获优选地通过与用于将经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件的特异性结合反应来实现。固定的捕获物质可包含固定的阳性标志物或阳性标志物偶合物或者由固定的阳性标志物或阳性标志物组成。在阳性标志物是半抗原的情况下，优选地它与另一部分(如载体)偶合以形成阳性标志物偶合物。更大的阳性标志物可能会或可能不会与另一个部分偶合。更大的(非半抗原)阳性标志物可以直接固定在流动路径上。然而，例如，在直接固定对阳性标志物的结构或其参与结合反应的能力具有不利影响的情况下，可能优选将非半抗原阳性标志物与另一部分连接。或者或另外，试剂区可包含可移动的阳性标志物或阳性标志物偶合物。在这种情况下，至少一个捕获区包含固定的捕获物质，用于将可移动的阳性标志物或阳性标志物偶合物定位在捕获区，从而使得阳性标志物或偶合物的阳性标志物部分能用于结合。这样，阳性标志物偶合物可以位于捕获区而不被直接固定到流动路径上。使用本文公开的任何结合试剂对可以实现将阳性标志物或阳性标志物偶合物定位在捕获区。在阳性标志物或阳性标志物偶合物(直接或间接)固定在捕获区的情况下，可移动的经标记偶合物包含用于将经标记偶合物与阳性标志物相关联的构件。在样本中不存在阳性标志物的情况下，经标记偶合物被固定或位于捕获区的阳性标志物偶合物或者阳性标志物捕获，阻止被捕获的经标记偶合物继续进入检测区。在样本中存在阳性标志物的情况下，其变得与经标记偶合物相关联，从而使得经标记偶合物不被固定或位于捕获区中的阳性标志物偶合物/阳性标志物捕获，并且可以继续进入检测区。在阳性标志物是P3G的情况下，装置优选地包含P3G偶合物。在一个实施方案中，试剂区包括用结合对的第一成员(例如生物素)标记的可移动的P3G偶合物，并且捕获区包含结合对的固定的第二成员(例如抗生物素抗体或链霉亲和素)。这样，P3G/P3G偶合物可位于捕获区而不直接固定在捕获区。此概念可适应于用于其他阳性标志物的捕获区。

在一个实施方案中，装置被布置成使得用户在使用中看不到捕获区或每个捕获区。在一个实施方案中，捕获区或每个捕获区不能被试验读取装置读取。在一个实施方案中，在使用装置的情况下，装置中的捕获区对用户是不可见的。在一个实施方案中，在一个或更多个捕获区对用户可以完全或部分可见的情况下，提供装置作为试剂盒的一部分，试剂盒还包括对用户的说明以忽略在捕获区产生的任何信号和/或不参考任何捕获区，根据检测区信号的存在与否确定试验结果。在一个实施方案中，提供装置作为试剂盒的一部分，试剂盒包含用于遮蔽装置中存在的一个或更多个捕获区或所有捕获区的附件。

在一个实施方案中，捕获区可对用户可见，用户可以被指示在诸如移动电话之类的移动装置上捕获装置的图像或视频，所述移动装置反过来用自身或通过直接或间接连接到移动装置的某些其他装置量解释测试结果。在这种情况下，导出测试结果的处理/分析不包括参考或实际测量捕获区。

优选地，试验读取构件不能读取捕获区。在一个实施方案中，试验装置不包含试验读取构件。在一个实施方案中，试验装置与外部读取构件不兼容。在一个实施方案中，装置不包含用于读取或分析捕获区或每个捕获区的构件。一个或更多个捕获区可以被任何合适的构件遮蔽。例如，试验装置可包含遮蔽捕获区或每个捕获区的外壳。在试验装置的检测区被设计为由试验读取器读取和/或试验装置包括用于读取检测区的试验读取器的情况下，这样的读取器将被配置为读取检测区并且优选地不被配置为读取或分析任何捕获区。例如，可以仅提供用于读取检测区的读取构件。在这种情况下可能没有必要遮蔽捕获区，因为读取器的读取构件通常与检测区对齐所以也不能读取检测区上游的捕获区。优选地，与试验装置一起使用的试验读取器包含用于读取检测区的单个读取构件。在一个实施方案中，试验装置不包括用于测量阴性标志物或阳性标志物的量的试验。

在一个实施方案中，试验装置被配置为仅允许在检测区处检测、测量或观察信号。在一个实施方案中，试验装置被配置为阻止在捕获区或每个捕获区处检测、观察和/或测量信号。在一个实施方案中，捕获区或每个捕获区不适合检测在捕获区被捕获的经标记偶合物的存在或测量其量。在一个实施方案中，装置不包括使得用户能够从捕获区获得试验结果的构件。在一个实施方案中，装置不包括使得用户能够在捕获区检测或分析信号的构件。优选地，试验装置被配置成使得可以仅通过检测或观察检测区(即，检测分析物的区域)的信号来获得试验结果。在使用的情况下，任何捕获区不需要对用户可见或可由试验构件读取，因为试验的结果仅通过查看或分析检测区来确定。不需要测量、查看或解释在捕获区产生的任何信号以获得试验结果。此外，遮蔽捕获区或每个捕获区是有利的，从而使得用户不会被捕获区处产生的任何信号混淆或分心。

固定的捕获物质可以以多种方式布置在流动路径上。例如，流动路径可以包括一个或更多个含固定的捕获物质的区域。捕获区可以包含本文公开的任何在捕获区内的固定的捕获物质或固定的捕获物质的组合。例如，可在同一的捕获区中提供用于捕获含第一阴性标志物的复合物的固定的捕获物质与用于捕获含第二阴性标志物的复合物的固定的捕获物质。例如，对第一阴性标志物和第二阴性标志物特异的结合试剂可以固定在相同的捕获区中(尽管它们可以提供在不同的捕获区中)。可以在捕获区中提供固定的捕获物质，该固定的捕获物质被配置为捕获阳性标志物或者含阳性标志物/阳性标志物偶合物或与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的经标记偶合物，捕获区包含用于捕获含第一阴性标志物和/或其他阴性标志物的复合物的固定的捕获物质。可在同一个捕获区中提供包含或由阳性标志物/阳性标志物偶合物组成或者用于将阳性标志物/阳性标志物偶合物定位在捕获区的固定的捕获物质与用于捕获含第一阴性标志物和/或其他阴性标志物的复合物的固定的捕获物质。同一个捕获区可包括在不存在第一阳性标志物的情况下配置为捕获经标记偶合物的固定的捕获物质和在不存在第二阳性标志物的情况下配置为捕获经标记偶合物的固定的捕获物质(或者可以在不同的捕获区中提供此类捕获物质)。这个概念可以适应于与其他阴性和阳性标志物一起使用的固定的捕获物质。

固定的捕获物质可以布置在试验流动路径上的一条或更多条捕获线中。捕获区可包含1、2、3、4、5条或更多条不同的捕获线。捕获线可以平行排列。被捕获区捕获的经标记偶合物的量可以通过调整固定的捕获物质的量、位置、排列和方位来控制。例如，通过将固定的捕获物质置于更下游、增加捕获线的量和/或使用更宽的捕获线，可以实现更高的捕获效率。除了标记试剂大小的变化之外，流动路径的多孔载体的孔径也可用于调节捕获效率并因此改变对感兴趣的分析物的测试的灵敏度。通常，减小多孔载体的孔径可提高捕获效率。

可以通过本领域技术人员已知的方法来控制试验对分析物、阴性和阳性标志物的敏感性，包括改变结合试剂的量和/或与可移动的经标记偶合物相关联的阳性标志物/阳性标志物的量，和/或改变在一个或更多个捕获区的试剂的量、实际上捕获区的量以及所使用的经标记试剂的量。可以通过改变装置中使用的结合试剂的亲和性来进行进一步的修改。在涉及阳性标志物偶合物的实施方案中，可以修改例如在捕获区使用的阳性标志物与载体蛋白的相对量。因此可以修改测试对参与试验的任何分析物和标志物的敏感性。

检测区

试验装置包括检测区，检测区含固定的结合试剂，固定的结合试剂用于捕获含经标记偶合物和分析物的复合物。在检测区捕获复合物优选地通过与分析物的特异性结合反应来实现。优选地，结合反应发生在分析物的表位上，该表位不同于与用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件结合的表位，从而使得形成“三明治”。优选地，仅在经标记偶合物是也包含分析物的复合物的一部分的情况下，检测区被配置为用于捕获经标记偶合物。

检测区可以包含直接结合分析物的固定的结合试剂。检测区固定的结合试剂可由对分析物特异的抗体组成或包含对分析物特异的抗体。在一个实施方案中，检测区中的固定的结合试剂包含与不存在于第一阴性标志物中的分析物的表位结合的抗体或由该抗体组成。

检测区可包含间接结合分析物的固定的结合试剂。例如，在一些实施方案中，可以在例如试剂区中或沿着流动路径但在检测区上游的其他地方，提供针对分析物的与第一结合配偶体连接的可移动的结合试剂。可移动的结合试剂可以结合不存在于第一阴性标志物中的分析物的表位。检测区中可以提供针对第一结合配偶体的固定的第二结合配偶体。这样，针对分析物的可移动的结合试剂可以位于检测区而不被直接固定到流动路径。第一和第二结合配偶体可以是彼此特异的任何合适的结合配偶体(例如抗体-抗原)。示例包括生物素和链霉亲和素、生物素和抗生物素抗体、荧光素和抗荧光素抗体。配偶体中的任一方可以固定在检测区中，而另一方提供在如试剂区中或沿着流动路径但在检测区上游的其他地方。这个概念可以适应于包括更多的中间结合配偶体。在一个实施方案中，试剂区包括用诸如生物素的标记结合对的第一成员标记的可移动的抗β-hCG抗体，并且检测区包含固定的结合对的第二成员(例如抗生物素抗体或链霉亲和素)。这样，抗β-hCG抗体可以位于检测区而不直接固定在检测区。这个概念可以适应于其他分析物。

在分析物是hCG的实施方案中，检测区可包含抗hCG抗体(例如抗β-hCG抗体)。

检测区处含经标记偶合物和分析物的复合物的捕获会在检测区形成信号。信号可以通过例如视觉上或使用试验读取构件进行检测或检查。在检测区检测到信号指示样本中存在分析物，以及样本来源的受试者存在第一状态。未能在检测区检测到信号，或者通过读取构件测量时检测到低于特定水平的信号水平可能指示样本来源的受试者不存在第一状态。

在使用读取构件来确定检测区的信号强度的情况下，可以使用设定阈值作为算法的一部分，以将测试结果确定为第一状态的阳性或阴性或事实上量化检测区的信号以指示样本中分析物的量。

例如，在分析物是hCG的情况下，在检测区检测到信号指示样本来源的受试者妊娠。如果在将样本施加到装置后未在检测区检测到信号，这指示样本来源的受试者未妊娠。

阴性和阳性标志物

本发明的装置对于待检测的分析物与受试者中感兴趣的状态(“第一状态”)相关联的但检测分析物本身不足以确认存在第一状态的情况是有用的。例如，分析物也可以与第二状态相关。分析物可以指示存在第二状态。

在一些实施方案中，分析物、阴性标志物和阳性标志物使得以下一项或多项成立：

·样本中存在分析物和阳性标志物指示存在第一状态。

·样本中存在阴性标志物和/或不存在分析物指示不存在第一状态。

·样本中存在分析物和阴性标志物指示不存在第一状态。

·样本中存在分析物和阴性标志物指示存在第二状态。

·样本中存在分析物的和/或不存在阳性标志物指示存在第二状态。

阴性标志物可以是指示不存在第一状态的标志物。阴性标志物可以是指示存在第二状态的标志物。阳性标志物可以是指示存在第一状态的标志物。阳性标志物可以是指示不存在第二状态的标志物。

在妊娠测试的情况下，分析物可能是hCG。来自受试者的样本可能含hCG或来自胚胎的hCG代谢物，这可能指示妊娠(第一状态)。hCG代谢物的实施例包括有切口(nicked)的完整hCG、游离的β-hCG、有切口的游离β-hCG、游离的α-hCG和β核心(betacore)片段。

然而，由于存在第二状态(例如围绝经期或绝经期)，hCG也可能以低水平存在于样本中。在这种情况下，hCG是由受试者的垂体而不是胚胎产生的。因此，例如在使用侧流的传统装置中，检测到低水平的hCG并不一定指示受试者妊娠。

阴性标志物

阴性标志物优选地是指示受试者中不存在第一状态的标志物。在妊娠测试的情况下，第一阴性标志物可能是FSH或LH。阴性标志物可以是指示女性卵泡发育或者其他卵泡生长或活性的标记，例如FSH或此类标记的代谢物。FSH及其代谢物的实施例包括游离β-FSH和蛋白水解降解产物。

在一些实施方案中，到达检测区(检测感兴趣的分析物的地方)的可移动的经标记偶合物的量依靠样本中第一阴性标志物的水平来调节。在这种情况下，可移动的经标记偶合物可以包被有与待检测分析物以及第一阴性标志物两者直接或间接结合的试剂。在用含分析物和第一阴性标志物的样本进行这样的测试的情况下，到达检测区的可移动的经标记偶合物的量由于阴性标志物的存在而减少。在这样的实施方案中，阴性标志物的存在引起位于检测区上游的捕获区捕获经标记偶合物，捕获区包含直接或间接捕获经标记的偶合物的固定的捕获物质，优选地通过与第一阴性标志物相互作用进行捕获。在捕获位点捕获的可移动的经标记偶合物的量可能取决于样本中第一阴性标志物的水平。在不含或含低水平第一阴性标志物但具有第一量的待检测分析物的样本中，相对大量的可移动的经标记偶合物将到达检测区并在检测区产生第一可见信号。相反地，样本中存在一定水平的第一阴性标志物以及待检测的第一量的分析物将导致可移动的经标记偶合物在捕获区被捕获并减少到达检测区的可移动的经标记偶合物的量，从而减少检测区产生的信号。因此调节测试对于待检测分析物的灵敏度。

在一个实施方案中，待检测的分析物是指示存在第一状态的hCG，而第一阴性标志物是指示受试者不存在第一状态的标志物。

在一些实施方案中，第一阴性标志物可以是FSH。FSH可能是围绝经期或绝经后的结果。在这样的实施方案中，用来自围绝经期或绝经后女性的包含FSH作为第一阴性标志物的样本进行测试将导致在位于检测区上游的捕获区捕获可移动的经标记偶合物，从而减少到达检测区的经标记试剂的量并因此减少或消除在检测区看到的信号。即使来自围绝经期或绝经后女性的样本含垂体衍生的hCG(除FSH外)，FSH的存在也会引起检测区产生的信号减少或消除，指示第一种状态的结果为阴性。

分析物和第一阴性标志物可以共享共同的表位。分析物和第一阴性标志物可以共享共同的结构特征(例如分析物的亚基)。分析物可以是hCG并且第一阴性标志物可以是FSH。第一阴性标志物可能是促黄体生成素(LH)。在一个优选的实施方案中，第一阴性标志物是FSH。

可移动的经标记偶合物可包含结合分析物和第一阴性标志物上的共同结构特征的特异性结合试剂。例如，这可以是针对分析物hCG的α亚基的抗体，该抗体也能结合第一阴性标志物FSH的α亚基。使用来自围绝经期或绝经后女性的包含一定水平的FSH的尿液样本进行测试，可能会导致一些可移动的经标记偶合物被抗FSH捕获区捕获，从而减少或消除在检测区看到的信号。

在其他实施方案中，可移动的经标记偶合物可包含特异性结合分析物的结合试剂和特异性结合第一阴性标志物的其他结合试剂。特异性结合试剂可以通过被动吸附或共价偶联永久地直接固定到可移动的经标记偶合物上。在称为间接结合方式的其他实施方案中，特异性结合试剂可以在进行测试之前或进行测试时与可移动的经标记偶合物间接结合。这可以例如通过将可移动的经标记偶合物包被在诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗生物素的试剂中并且生物素化特异性结合试剂来实现。在进行测试之前或进行测试后，特异性结合试剂与可移动的经标记偶合物相关联。

阳性标志物

阳性标志物优选地是指示受试者存在第一状态的标志物，是除了感兴趣的分析物之外的标志物。在妊娠测试的情况下，阳性标志物优选地是指示与女性维持妊娠有关的分泌或产生的母体因子的标志物，例如黄体酮或此类标志物的代谢物，例如孕二醇葡糖苷酸(P3G)。在根据本发明的如妊娠测试中可以使用的其他阳性标志物包括完整hCG的亚型，例如高糖基化hCG、有切口的hCG；hCG的亚基，例如hCGβ核心片段、β-hCG、α-hCG、无缺口的β-hCG；早孕因子(Early Pregnancy Factor,EPF)、早孕因子(Early Conception Factor,ECF)、卵泡抑素(FST)、激活素A、抑制素A、抑制素B、Pro-Alpha C和妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)。

阳性标志物可能是一种被称为半抗原的小分子，在试图在动物体内产生特异性结合方式或抗体的情况下，它本身太小而不能引发免疫反应。在产生与半抗原的特异性结合方式的情况下，如果用于在动物中产生抗体，通常将半抗原偶合或连接至免疫原性载体例如牛血清白蛋白或卵清蛋白等蛋白质。所得抗体可用于侧流试验以产生竞争或抑制试验。例如，用于半抗原产生的抗体可以包被在可移动的经标记偶合物上，并且半抗原或半抗原的类似物可以偶合到通常是蛋白质的载体上，以形成半抗原偶合物。半抗原偶合物可以固定在多孔载体上的区域。在样本中不存在半抗原的情况下进行测试的情况下，可移动的经标记偶合物与固定的半抗原偶合物结合，而在半抗原存在下进行测试会降低可移动的经标记偶合物与固定的半抗原偶合物的结合。

相反地，可移动的经标记偶合物可以用连接载体的半抗原包被，并且用于半抗原产生的抗体可以固定在多孔载体上的区域。施加到这种装置的样本中存在的半抗原占据固定在多孔载体上的抗体上的位点，并减少与包被在连接载体的半抗原中的可移动得经标记偶合物的结合。

这种负相关是典型的竞争或抑制型试验，在感兴趣的分析物是半抗原和/或太小以致不能同时结合两种不同的抗体(例如黄体酮代谢物的情况)的情况下，通常采用这种。

对半抗原特异的结合构件通常在小鼠中产生，并且选择单克隆抗体用于试验。可以通过直接吸附或化学偶联将特异性结合构件直接包被到可移动的经标记偶合物的表面。可以通过间接方式将特异性结合构件包被到可移动的经标记偶合物的表面，包括例如上述的抗生物素蛋白-生物素或生物素和抗生物素。可以预先形成这种间接结合，使得在进行测试之前将特异性结合工具包被在可移动的经标记偶合物上，或者在进行测试的情况下特异性结合构件与可移动的标记偶合物结合。在后一种情况下，可移动的经标记偶合物可包被在抗生物素蛋白中，半抗原的生物素化特异性结合构件可作为测试中的单独试剂提供。

与半抗原结合的蛋白质可以直接固定在多孔载体上或通过化学偶联固定。与半抗原偶合的蛋白质可以间接固定在多孔载体上，作为测试中的移动试剂提供，在进行测试的情况下，其固定在多孔载体上。

阳性标志物偶合物优选包含阳性标志物部分。阳性标志物部分优选能被诸如抗体的结合试剂结合。阳性标志物偶合物可包含黄体酮代谢物，例如P3G，或其部分。

可移动的经标记偶合物可以直接结合阳性标志物或阳性标志物偶合物。在一些实施方案中，可移动的经标记偶合物可间接结合阳性标志物/阳性标志物偶合物。在此，试剂区可以包括用于将可移动的经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件。用于将可移动的经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件可包含结合试剂。结合试剂可以直接或间接结合阳性标志物或阳性标志物偶合物。用于将可移动的经标记偶合物与阳性标志物或阳性标志物偶合物相关联的构件可以包含结合阳性标志物偶合物的表位(这可以是载体蛋白上的表位)的抗体或由其组成。如果结合试剂间接结合阳性标志物或阳性标志物偶合物，它可以结合试剂区中提供的直接或间接地结合阳性标志物或阳性标志物偶合物的另一种结合试剂。

在一些实施方案中，试剂区进一步包含用于固定在试剂区下游的可移动的阳性标志物/阳性标志物偶合物。这种可移动的阳性标志物/阳性标志物偶合物可以包含或连接到结合对的一个成员。结合对的另一个成员可以固定在试剂区的下游，例如在捕获区中。因此，可移动的阳性标志物/阳性标志物偶合物可以固定在捕获区，使得它可与用于将可移动的经标记偶合物与阳性标志物/阳性标志物偶合物相关联的构件结合。

在一些实施方案中，在分析物是hCG并且阳性标志物是P3G的情况下，P3G可以与抗hCG抗体(例如抗α-hCG抗体)偶合。

一个或更多个捕获区可以位于检测区的上游。可移动的经标记偶合物可以直接或间接地包被在感兴趣的分析物的特异性结合构件中(如用于妊娠测试中的针对hCG的抗体)。此外，可移动的经标记偶合物也可以直接或间接包被在用于阳性标志物的抗体中(例如在阳性标志物是黄体酮代谢物的情况下的抗P3G抗体)。在一个实施方案中，在检测区准备多孔载体和直接或间接固定的抗hCG抗体，在妊娠来源的hCG存在的情况下，通过典型的三明治试验在检测区提供信号。在这样的一个实施方案中，多孔载体可以包含一个或更多个位于检测区上游的捕获区，捕获区含与蛋白质载体(如BSA)偶合的固定化半抗原(P3G)。或者，P3G的特异性结合构件可以直接或间接固定在捕获区，并且与载体偶合的P3G可以直接或间接包被到可移动的经标记偶合物上。

在来自孕妇的样本中，阳性标志物(P3G)的水平与妊娠来源的hCG水平一起升高。在一些实施方案中，P3G的存在降低了可移动的经标记偶合物在捕获区的结合，从而允许更多经标记试剂到达检测区，在检测区中hCG的存在使得可移动的经标记偶合物在检测区结合。

相反地，来自非妊娠个体的样本包含显著较低水平的阳性标志物(P3G)。在一些实施方案中，将这样的样本施加到试验装置使得可移动的经标记偶合物与捕获区结合，减少了到达检测区的可移动的经标记偶合物的量。减少到达检测区的可移动的经标记偶合物的量会减少检测区产生的信号，使得妊娠测试的阴性结果变得更为可能。

对孕妇尿液样本的分析显示阳性标志物(例如P3G)的水平随着妊娠来源hCG水平的升高而升高。然而，在围绝经期或绝经后女性中，阳性标志物的水平相对较低。根据本发明的某些实施方案，来自围绝经期或绝经后女性的尿样中存在的阳性标志物水平较低使得更多的可移动的经标记偶合物结合在捕获区，有效地减少了可移动的经标记偶合物到达检测区的量。由于取自围绝经期或绝经后个体的样本包含垂体衍生的hCG，因此在此类实施方案中在检测区看到的信号随着到达检测区的可移动的经标记偶合物的量受到损害而减少。在这种情况下，更有可能在检测区报告阴性结果。

在一些实施方案中，在分析物是hCG并且阳性标志物是诸如P3G的半抗原的情况下，P3G可以与诸如抗α-hCG抗体的抗hCG抗体和与可移动的经标记偶合物相关联的偶合物偶合。在此，抗α-hCG作为hCG的特异性结合构件(在检测区结合可移动的经标记偶合物)以及第一阴性标志物(例如FSH)的特异性结合构件，在存在FSH的情况下，在含针对FSH的固定的捕获物质的捕获区结合经标记的偶合物。此外，可移动的经标记偶合物上的抗α-hCG～P3G偶合物用于在样本中不存在P3G的情况下在含P3G的固定的捕获物质的捕获区捕获可移动的经标记偶合物。

可以使用多于一种的阳性标志物来进一步减少到达检测区的经标记试剂的量，其中，利用了含针对每种阳性标志物的结合构件的多孔载体。

在本发明的装置包括阳性标志物或阳性标志物偶合物的情况下，阳性标志物或偶合物的阳性标志物部分可以是天然存在的阳性标志物的类似物或变体。可以使用任何类似物或变体，前提是类似物/变体和天然存在的标志物都可以参与本文所述的阳性标志物结合反应并竞争相关结合位点。

阴性和阳性标志物的组合以及额外的阴性和/或阳性标志物

一种或更多种阴性标志物和/或一种或更多种阳性标志物的特异性结合构件可提供在单个试验装置内。这种形式进一步提高了在不存在第一状态的情况下报告阴性结果和在存在第一状态的情况下报告阳性结果的能力。在妊娠测试的情况下，这种形式进一步提高了报告非妊娠样本的阴性结果和真实妊娠情况下的阳性结果的能力。在这种情况下，可移动的经标记偶合物可以直接或间接包被上诸如抗α-hCG的特异性结合构件以结合hCG和阴性标志物FSH。可移动的经标记偶合物也可以包被连接阳性标志物的特异性结合构件(例如P3G)。在这种实施方案中，多孔载体优选包括含FSH的特异性结合试剂的捕获区以及一个或更多个阳性标志物或阳性标志物偶合物(例如P3G偶合BSA)的区域。捕获区可以包含阴性和阳性标志物的单独区，或者捕获区可以包括特异性结合试剂，通过混合任何比例的试剂而被共同固定在捕获区。

在这样的实施方案中，用取自具有升高水平的阳性标志物的妊娠个体的样本进行测试使得在捕获区捕获的可移动的经标记偶合物的量较低，因此允许更多的可移动的经标记偶合物穿过到检测区。由于样本还包含较低水平的第一阴性标志物FSH，较少的可移动的经标记偶合物通过与FSH的相互作用在捕获区被捕获。这使得更多的可移动的经标记偶合物移动到检测区，并增加了由于样本中存在的妊娠来源的hCG而在检测区产生信号的可能性。因此，在检查检测区后，真正的妊娠样本更有可能提供阳性测试结果。相反地，并非来自围绝经期或绝经后女性的真阴性妊娠样本含相对较低水平的阳性标志物，使得更多的可移动标记偶合物在捕获区被捕获，减少了到达检测区的可移动的经标记偶合物的量。虽然在这样的样本中阴性标志物的水平会变化，但阴性标志物的量并不重要，因为妊娠来源的hCG水平低，使得检测区信号减少/无信号形成。在对来自围绝经期或绝经后女性的样本进行测试的情况下，相对较高水平的阴性标志物FSH使得更多可移动的经标记偶合物在捕获区被捕获。此外，由于样本中存在相对较低水平的阳性标志物P3G，更多量的可移动的经标记偶合物在捕获区被捕获。实际上，到达检测区的可移动的经标记偶合物的量减少，增加了在检测区检查的情况下报告阴性结果的可能性。由于在某些实施方案中，可移动的经标记偶合物包含抗α抗体作为特异性结合构件，因此它还将结合来自围绝经期或绝经后女性的样本中的垂体来源的hCG。由于样本中存在阴性标志物FSH，可移动的经标记偶合物在捕获区被捕获，因此一些垂体hCG也将被捕获在可移动的经标记偶合物上，而不会移动到检测区。减少移动到检测区的样本中垂体衍生hCG的量进一步降低了可移动的经标记偶合物结合在检测区的可能性，增加了在运行来自围绝经期或绝经后的个体样本的情况下，在检测区报告阴性结果的可能性。

本发明的装置可适应于在试剂区和捕获区中包括构件，从而在样本中存在第二阴性标志物的情况下，在经标记偶合物到达检测区之前促进对经标记偶合物的进一步捕获。本文所描述的用于捕获含经标记偶合物和第一阴性标志物的复合物的任何构件可以被修改并包括在本发明的装置中以捕获含经标记偶合物和第二阴性标志物的复合物。如果第一阴性标志物是FSH，则第二阴性标志物可以是例如LH。如果第一阴性标志物是LH，则第二阴性标志物可以是例如FSH。

类似地，本发明的装置可适应于在试剂区和捕获区中包括构件，在样本中不存在第二阳性标志物的情况下(例如，在第二阳性标志物是半抗原的情况下)，以在可移动的经标记偶合物到达检测区之前促进对可移动的经标记偶合物的进一步捕获。在不存在阳性标志物的情况下，本文所描述的任何用于捕获复合物的构件都可以被修改并包括在本发明的装置中，以在样本中不存在第二阳性标志物的情况下捕获含可移动的经标记偶合物的复合物。如果第一阳性标志物是P3G，则第二阳性标志物可能是另一种黄体酮代谢物。如果第一阳性标志物是除P3G之外的黄体酮代谢物，则第二阳性标志物可以是P3G。本发明的装置可以进一步适应于在存在任意量的更多的阴性标志物和/或不存在任意量的更多的阳性标志物的情况下捕获复合物。

区的相对位置

一个或更多个捕获区位于试剂区下游且位于检测区上游。检测区可以位于试验流动路径的下游末端(例如诸如硝化纤维素的多孔载体)。捕获区可以位于试剂区与检测区之间的任何地方。可以如本文所描述调整位置以调节捕获效率。在一个示例中，检测区可位于距多孔载体(例如硝化纤维素膜)的上游末端约10至20mm处。捕获区可位于距多孔载体(例如硝化纤维素膜)的上游末端约3至15mm处。在一个实施方案中，检测区位于距多孔载体(例如硝化纤维素膜)的上游末端约15mm处，而捕获区位于距多孔载体(例如硝化纤维素膜)的上游末端约8mm处。试剂区可提供在单独的多孔载体上，位于含捕获区和检测区的多孔载体的上游。捕获区和检测区之间的间距没有固有限制。然而，在试验装置被设计为由用户视觉读取的实施方案中，捕获区将与检测区隔开足够远，使得观察检测区的用户不可见。因此，用于观察检测区的观察窗的尺寸和检测区在窗下方的位置可以是确定捕获区最合适位置的因素。

样本

虽然尿液优选作为用于家庭妊娠测试的样本基质，但样本可以是任何合适的体液，例如全血、血浆、血清或尿液。尿液样本是非常优选的，因为这样的样本很容易获得并且不需要进行侵入性程序。此外，尿样的使用有利于用户的自检。其他样本可以使用拭子、卫生巾、绷带等收集并直接施加到装置上，随后是洗脱缓冲液以帮助沿流动路径移动样本组分。在将样本施加到测试装置之前，可以如上所述收集样本并置于洗脱缓冲液中。

运行时间和读取器属性

测试的结果可以通过用户对检测区的目视检查来确定，通常在将样本施加到装置后的设定时间段之后，或者在控制线或测试指示器的其他末端的发展和视觉外观上确定。

一般而言，在数字试验装置的情况下，测试结果将在特定时间(tE)过去后确定(通常，但不一定，通过参考样本与试验装置的采样区域接触的时间来确定)。如果提供试验结果读取装置，则这可包括某种整体计时构件以确定何时达到tE。计时构件可通过使样本与试验装置接触(例如通过允许电流流动的液体样本)自动启动，或可由用户触发(例如按下开关等)或通过任何其他方便的构件。试验反应可以方便地在tE达到平衡，但这不是必需的。

读取器可以在tE之前对检测区的分析物信号进行一次或多次测量。在检测区的信号大于第一阈值的情况下(第一阈值指示tE的情况下检测区信号高于阳性结果的设定阈值)，检测区信号的早期测量可用来在tE之前向用户输出最终结果。同样，如果检测区的信号在tE之前的任何阶段都低于设定的阈值，则可以在tE之前向用户输出早期的阴性结果。

tE终点可以方便地由读取器参考特定时间点来确定。(即tE可以被认为发生在试验开始后的特定时间量，例如在激活读取器和/或将试验装置插入读取器和/或将样本施加到试验装置之后的特定间隔)。

外壳

在优选实施方案中，试验装置包括外壳，其容纳试验的大部分或全部功能部件和试验试剂。外壳方便地由防水的合成塑料材料形成并且优选地基本上不透明。可以将遮光剂添加到塑料材料中以达到所需的不透明度水平。用于形成外壳的合适的合成塑料材料特别包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚丙烯、聚乙烯和丙烯腈的共聚物。理想地，外壳可以形成为两部分或更多部分，它们与容纳在外壳的组装部件内或组装部件之间的其余试验装置部件的大部分(或全部)连接在一起。外壳的各部分可以通过传统的紧固方式，例如搭扣配合动作，或通过塑料焊接等连接和紧固。

在优选实施方案中，试验装置包含外壳(通常具有上述的特征)，并且其中，样本施加部分或区域延伸超出外壳，以促进将尿样施加到样本施加部分或区域。在使用之前，延伸超出外壳的样本施加部分或区域可以被可移除的帽盖覆盖。帽盖还可以优选地由合成塑料材料形成，其可以是不透明的、透明的或半透明的。通常，一旦将样本施加到加样区，就更换帽盖。

外壳可以包括检测区上方的测试窗口，便于观察检测区。外壳可能会遮挡用户对该或每个捕获区的视野。

在另一个示例中，没有提供外壳。在这样的实施方案中，试验装置部件可以安装在诸如聚酯薄膜的支撑材料上以形成通常已知的试纸。在这种情况下，可能会通过附加的不透明覆盖物以其他方式施盖覆盖捕获区，对用户遮蔽捕获线。在其他情况下，使用这样的试纸，捕获区对用户是可见的，仅指示用户通过观察检测区来解释结果的结果。这种不含外壳的试纸配置也可以通过如本文所描述的读取构件读取。

其他特征

试验装置可以方便地包含本领域技术人员已知的并且在常规自测或家庭测试妊娠测试装置中常见的其他特征，包括(但不限于)样本充足性指示器(例如，WO2015/082646中所描述的)，“防洪”垫(例如，WO2012/069610中所公开的)，使用样本流作为试验对照(例如，EP1,484,611；US6,194,222中所公开的)；“早期”确定阳性或阴性结果(例如，如EP1,484,613；US5,679,584中所公开的)；电子装置的自动“唤醒”(例如，通过样本润湿装置后自动启动，从而完成电路)；使用数字试验进度计(例如欧洲共同体设计注册号1367304)或“变色灯芯”等，在样本已施加于测试装置的情况下给出视觉指示和/或试验已开始的视觉指示(例如WO2003/058245)。测试装置将有利地以防水包装呈现给消费者，所述包装任选地进一步包括干燥剂，例如硅胶小袋。

试验流动路径可以方便地支撑在某种支撑物或背衬层上，以提供机械强度和适当程度的刚性。可以方便地将测定加支持物称为和提供为在没有外壳的情况下使用的试纸，或者实际上放置在如本文所述的外壳中以形成通常称为测试棒。测试棒或更多个测试棒可以被适应和配置为由用户插入到测试装置中，或者测试棒或更多个测试棒可以更优选地形成测试装置的组成部分，测试装置与与预先插入或装载在测试装置中的测试棒一起销售给消费者。

读取器

在优选实施方案中，试验结果可以从传统的“自检”妊娠测试中已知的方式由用户直接读取，例如通过用户检查覆盖检测区的一个或更多个窗口来确定可检测信号的存在或不存在。在这样的实施方案中，试验装置优选地不包括试验读取器。在一个实施方案中，本发明的试验装置未被配置为由试验读取器读取。通常，在此类用户读取装置中，用户将直接检查侧流或微流体试验的检测区。在其他形式中，用户可以通过参考比色卡或指示器来确定检测区的结果。便利地，试验装置可与用于读取试验结果的说明或指导一起提供(如果装置不为用户解释试验结果)。例如，可以向用户提供打印的比色卡以促进此类直接读取的视觉测试的解释。

或者，检测区可以被称为试验结果读取器的试验结果读取构件读取。在这种情况下，试验结果读取器优选地被配置为仅读取检测区而不被配置为读取或分析存在于试验装置中的任何捕获区。试验结果读取器可以是试验装置外部的或与试验装置集成在一起。试验结果读取器可以有利地包含电子部件，尤其是数字电子部件，例如微处理器。检测区可以通过光学构件确定，即测量由检测区反射和/或透射的光的量，其中，光学的经标记试剂倾向于以与样本中分析物浓度成正比(正比或反比)的方式积聚。或者，可以通过例如磁性或电化学测量来读取检测区。显然，读取试验的方式可能取决于用于标记试验试剂的标签的性质。生成的数据可以由集成的微处理器处理，测试结果可以通过液晶屏等方式输出到装置本身，或者远程传输到手机等外部装置进行原位处理或通过网络连接传输到中央处理服务器。结果可能会在移动电话或其他联网装置上报告。

外部试验结果读取构件可包含专用结果读取装置(例如，类似于EP1066530中描述的装置)。或者，外部试验结果读取器可以是“非专用的”，例如移动电话或其他便携式电子装置(例如平板电脑)，优选配备有相机，其中，通过测量检测区的标签产生的信号强度来读取试验结果。

试验结果读取器，无论是外部的还是形成集成试验装置/试验结果读取器的一部分，都可以读取和解释试验数据，或者可以传输包含装置运行特性的试验数据，例如流动时间和从测量系统到远程装置用于解释分析数据的各种输出，和获得的结果。试验数据可以实时传输到远程装置。数据可以通过互联网连接传输，或者可以存储在物理传输到远程装置的存储装置(例如“闪存”驱动器等)上，或者数据可以通过无线通信构件(例如蓝牙、近场通信[NFC]等)传输。

微处理器可以控制光学读取或其他试验读取部件的操作，并且将方便地编程有或能够访问每个分析物的相关试验信号阈值，将实际试验信号值与预定阈值进行比较，并且解释试验结果以便确定妊娠试验的结果。

试验装置还可包含试验结果显示器，用于向用户显示试验结果。通常，显示器将包含LCD，但其他类型的显示器也是可能的(例如，使用“电子墨水”)。在那些试验装置(或更具体地，其部件)需要电源来操作的那些实施方案中，则试验装置将优选地配备有集成电源，例如电池。非常小且便宜的电池在市场上很容易买到。装置还可以配备一个开关以连接集成电源并启动装置。

具有显示器的组合式妊娠测试棒/试验结果读取装置可被称为“数字化妊娠测试”，并且此类数字化测试装置是可商购的并且可在本公开的益处下进行调整以提供根据本发明的试验装置。

微处理器将理想地被编程以使得试验结果读取部件读取试验结果；解释试验结果；并将结论显示给用户。

用于读取试验结果的部件将优选地包含至少一个光源和至少一个光探测器。至少一个光源优选地是发光二极管(LED)。至少一个光探测器优选地是光电二极管或光电晶体管。光源照射试验的检测区，该区在试验进行期间倾向于以取决于应用于试验的样本中感兴趣分析物浓度的方式积聚经标记物质。

装置通常可以使用参考区——这是微流体或侧流试验流动路径的一部分，用于参考从检测区获得的读数。参考区的使用是本领域技术人员公知的，有助于说明未结合的经标记试剂，其可能位于流动路径和/或被测试样本的流动路径的背景染色。

在一个实施方案中，光源在不同时间发射不同波长的光，并且光探测器区分不同波长。另外或替代地，光学挡板(固定的或可调节的)可用于控制由特定光源照射的区域。可以使用的那种光学布置的更多细节公开于例如EP 1,484,601、US 6,055,060和US 5,889,585。为免生疑问，本文所用的术语“光”并非意在仅指人类观察者可见的电磁波谱部分中的辐射，并且包括例如紫外线和红外线辐射。然而，在光谱的可见光部分内的部件，对光谱的可见光部分灵敏的部件可以是优选的，并根据所使用的经标记试剂进行选择。

微处理器或计算机化控制构件可以包含一个或更多个存储的分析物阈值，试验结果可以与该阈值进行比较，以允许试验结果读取装置解释结果并显示适当的结论(例如妊娠或未妊娠)给用户。微处理器或控制构件可以用算法编程以测量试验结果，将其与预定阈值进行比较，并显示结论。

对照

在一些实施方案中，期望测试装置还包含某种对照功能。这在自检装置中是常规的，以提供测试已正确运行的一些指示。

通常，对照功能将包含使用对照区，如果足够的样本已被施加到试验装置的加样区，则标经记试剂将趋向于在该对照中积聚。通常，经标记的试剂是经标记的抗体或其他试剂，其以干燥形式可释放地沉积在试纸的上游或近端部分，例如在试剂区中，并在被样本再水化的情况下移动，并被固定在对照区的捕获剂捕获。对照表明是否已将足够的样本施加到测试装置，并表明测试试剂已在合理程度上保留了它们的结合特性，并且经标记的试剂已被移动到足够的程度。用于形成对照区的经标记试剂可以是用于检测分析物的第一组经标记试剂的第二组试剂。可以使用用于检测分析物的经标记试剂和用于形成对照区的单独的经标记试剂组的混合物，这两个组都参与形成对照区。

关于本发明的每个方面所描述的实施方案对于每一个其他方面的实施方案都进行了必要的修改。此处引用的文件在法律允许的最大范围内以引用方式并入。在此提及的现有技术文件在法律允许的最大范围内被并入。

现在将通过示例性的实施例并参考附图进一步描述本发明的各种特征，其中：

图1A显示了用于检测样本中分析物(101)的存在的试验装置(100)的实施方案。该试验装置包含加样区(102)、加样区下游的试剂区(104)、试剂区下游的捕获区(110)、捕获区下游的检测区(108)、检测区下游的对照区(109)和对照区下游的水槽垫(105)。当样本被施加到加样区(102)的情况下，它在箭头(103)指示的方向上沿着试验装置的流动路径流动。

试剂区(104)包含测试可移动的经标记偶合物(106)和对照可移动的经标记偶合物(107)。测试可移动的经标记偶合物(106)包含与结合试剂(113)(例如抗体)偶合的标记(114)，测试可移动的经标记偶合物(106)结合分析物(101)或第一阴性标志物(112)。对照可移动的经标记偶合物(107)包括与结合成员偶合的标记物(114)，该结合成员被对照区(109)处的固定结合成员(116)结合。测试可移动的经标记偶合物也可用作对照偶合物。

捕获区(110)包含对第一阴性标志物(112)特异的固定的捕获物质(115)(例如，固定的抗体)。

检测区(108)包含对分析物(101)特异的固定的结合试剂(111)(例如，固定的抗体)。

测试窗口(117)提供在检测区(108)和对照区(109)上方的试验装置外壳(未示出)中，使得用户能够查看或由试验读取器读取。捕获区(110)通过测试窗口(117)是不可见的并且被试验装置外壳遮蔽。

图1B显示了如何通过图1A中所示的试验装置获得阳性试验结果。在这种情况下，分析物(101)存在于样本中，但第一阴性标志物(112)不存在于样本中。测试可移动的经标记偶合物(106)和对照可移动的经标记偶合物(107)被样本移动并从试剂区(104)向下游流动。分析物(101)被测试可移动的经标记偶合物(106)的结合试剂(113)结合，从而形成复合物。复合物未在捕获区(110)被捕获，这是因为捕获区(110)处的固定的捕获物质(115)对第一阴性标志物(112)具有特异性并且样本中不存在第一阴性标志物。检测区(108)中的固定的结合试剂(111)结合复合物中的分析物，从而捕获复合物。对照可移动的经标记偶合物(107)结合在对照区(109)处。这使得测试线信号(118)和对照线信号(119)的形成，这两者都可通过测试窗口(117)看到，指示阳性结果。

图1C显示了在样本中不存在分析物(101)和第一阴性标志物(112)的情况下，如何通过图1A的试验装置获得阴性结果。对照可移动的经标记偶合物(107)被样本移动，从试剂区(104)向下游流动并在对照区(109)处结合。测试可移动的经标记偶合物(106)被样本移动，但由于不存在分析物(101)而不能在检测区(108)处结合。这引起仅控制线信号(119)产生并且用户在测试窗口(117)处可见，指示阴性结果。

图1D显示了在样本中存在分析物(101)和第一阴性标志物(112)的情况下，如何通过图1A的试验装置获得阴性结果。测试可移动的经标记偶合物(106)和对照可移动的经标记偶合物(107)被样本移动并从试剂区(104)向下游流动。第一阴性标志物(112)和分析物(101)被测试可移动的经标记偶合物(106)的结合试剂(113)结合以形成复合物。捕获区中固定的捕获物质(115)结合复合物的第一阴性标志物(112)，使得复合物在捕获区(110)处被捕获。由于捕获区(110)在检测区(108)的上游，测试可移动的经标记偶合物(106)在它到达检测区(108)之前被隔离。因此，尽管样本中存在分析物(101)，但测试可移动的经标记偶合物(106)在检测区(108)处的积聚量不足以给出阳性结果。对照可移动的经标记偶合物(107)被样本移动并结合在对照区(109)。这使得用户在测试窗口(117)处仅能看到控制线(119)，指示阴性结果。捕获区(110)在视野中被遮挡。

图2显示了图1所示类型的试验装置的简化示意图。该试验装置包括试剂区(1)、试剂区(1)下游的捕获区(5)和捕获区(5)下游的检测区(7)。试剂区(1)包含可移动的经标记偶合物(2)，可移动的经标记偶合物包含可检测标记(3)和用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)以及用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件(4b)。捕获区(5)包含固定的捕获物质(6)，其能够捕获含经标记偶合物(2)和第一阴性标志物(10)的复合物。检测区(7)包含固定的结合构件(8)，用于捕获含经标记偶合物(2)和分析物(9)的复合物。在存在分析物(9)且不存在第一阴性标志物(10)的情况下(左图)，用于将经标记偶合物与分析物(4a)相关联的构件结合分析物，从而形成复合物。该复合物在检测区(7)处被捕获，因为检测区(7)处的固定的结合构件(8)与复合物的分析物(9)结合。在存在分析物(9)和第一阴性标志物(10)的情况下(右图)，用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合分析物(9)，并且用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件(4b)结合第一阴性标志物(10)。应当注意，在该实施方案中，用于将标记的偶合物与分析物相关联的构件(4a)和用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件(4b)是不同的(例如不同的抗体)。但是，它们可以是相同的，例如结合分析物和第一阴性标志物两者的相同抗体。形成含经标记偶合物、分析物(9)和第一阴性标志物(10)的复合物。该复合物在捕获区(5)处被捕获，因为固定的捕获物质(6)与复合物的第一阴性标志物(10)结合。在该试验装置中，捕获区(5)从视野中被遮蔽，而检测区(7)对用户可见或可由试验读取器读取。

图3显示了图2所示类型的试验装置的示意图，不同之处在于：(i)可移动的经标记偶合物(2)包含阳性标志物偶联物(4c)，而不是用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件(图2中标记为(4b))，并且(ii)捕获区(5)包含能够捕获第一阳性标志物或含阳性标志物偶合物的复合物的固定的捕获物质(6a)。在存在分析物(9)和第一阳性标志物(10a)的情况下(左图)，第一阳性标志物(10a)在捕获区(5)处被固定的物质(6a)结合，使得经标记偶合物(2)不能在捕获区(5)处结合。分析物(9)被用于将经标记偶合物于分析物相关联的构件(4a)结合以形成复合物。复合物穿过捕获区(5)并在检测区(7)处结合，因为检测区(7)处的固定的结合构件(8)与复合物的分析物(9)结合。在不存在第一阳性标志物(10a)且存在分析物(9)的情况下(右图)，分析物(9)被用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合以形成复合物。复合物结合在捕获区(5)处，因为捕获区(5)处的固定的捕获物质(6a)与复合物的阳性标志物偶合物(4c)结合。

图4显示了图3所示类型的试验装置的示意图，不同之处在于：(i)可移动的经标记偶合物(2)包含用于将可移动的经标记偶合物与第一阳性标志物或第一阳性标志物偶合物相关联的构件(4d)，而不是阳性标志物偶合物(图3中的(4c))，并且(ii)捕获区(5)包含固定的第一阳性标志物偶合物(6b)，而不是能够捕获第一阳性标志物或含第一阳性标志物偶合物的复合物的固定的捕获物质(图3中标记为(6a))。在存在分析物(9)和第一阳性标志物(10a)的情况下(左图)，第一阳性标志物(10a)被用于将可移动的经标记偶合物与第一阳性标志物或第一阳性标志物偶联物相关联的构件(4d)结合，使得经标记偶合物(2)不能在捕获区(5)处结合。分析物(9)被用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合以形成复合物。复合物穿过捕获区(5)并在检测区(7)处结合，因为检测区(7)的固定的结合构件(8)与复合物的分析物(9)结合。在不存在第一阳性标志物(10a)和存在分析物(9)的情况下(右图)，分析物(9)被用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合以形成复合物。复合物在捕获区(5)结合，因为固定的第一阳性标志物偶合物(6b)与经标记偶合物(2)的用于将可移动的经标记偶合物与第一阳性标志物或第一阳性标志物偶合物相关联的构件(4d)结合。应当理解，图中所示的实施方案可以组合，从而例如，阳性和阴性标志物两者影响到达检测区的经标记偶合物(和样本中存在的分析物)的量和/或更多种阴性和/或阳性标志物影响到达检测区的经标记偶合物。例如，可移动的经标记偶合物可包含针对分析物、第一阴性标志物和第一阳性标志物的结合试剂，，并且捕获区可包含针对第一阴性标志物的固定的捕获物质和固定的第一阳性标志物偶合物。在另一个实施例中，可移动的经标记偶合物可以包含用于分析物、第一阴性标志物的结合试剂，和第一阳性标志物偶合物，并且捕获区可以包含针对第一阴性标志物的固定的捕获物质和针对第一阳性标志物和第一阳性标志物偶合物的固定的捕获物质。

图5显示了使用图3所示装置的改动版本在检测区进行的间接捕获。在该实施方案中，试剂区(1)还包含与第一结合配偶体连接的针对分析物的可移动的结合试剂(8a)，其。检测区(7)包含针对第一结合配偶体的固定的第二结合配偶体(8b)。这样，针对分析物的可移动的结合试剂可以位于检测区(7)处，而无需直接固定到流动路径。

在存在分析物(9)且不存在第一阴性标志物(10)的情况下(左图)，用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合分析物，从而形成复合物。与第一结合配偶体连接的针对分析物的可移动的结合试剂(8a)被移动并流向检测区(7)，在此第一结合配偶体被第二结合配偶体(8b)结合。复合物在检测区(7)被针对分析物的可移动的结合试剂(8a)捕获，该结合试剂现在位于检测区(7)处。在分析物(9)和第一阴性标志物(10)存在的情况下(右图)，用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合分析物(9)，并且用于将经标记偶合物与第一阴性标志物相关联的构件(4b)结合第一阴性标志物(10)。形成含经标记偶合物、分析物(9)和第一阴性标志物(10)的复合物。该复合物在捕获区(5)被捕获，因为固定的捕获物质(6)与复合物的第一阴性标志物(10)结合。与第一结合配偶体连接的用于分析物的可移动结合试剂(8a)流向检测区并被第二结合配偶体(8b)结合，但由于复合物在捕获区(5)处被捕获，因此它被阻止到达检测区(7)。

图6显示了图4所示装置的改动版本。在该实施方案中，试剂区(1)还包含与第一结合配偶体连接的可移动的第一阳性标志物偶合物(6c)。捕获区(5)包含针对第一结合配偶体的固定的第二结合配偶体(6d)。这样，可移动的第一阳性标志物偶合物(6c)可以位于捕获区(5)而不直接固定到流动路径上。

在存在含分析物(9)和第一阳性标志物(10a)的样本的情况下(左图)，与第一结合配偶体连接的可移动的第一阳性标志物偶合物(6c)被移动并流向捕获区(5)，在此第一结合配偶体被固定的第二结合配偶体(6d)结合。可移动的经标记偶合物(2)的用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合分析物(9)以形成复合物。可移动的经标记偶合物(2)的用于将经标记偶合物与第一阳性标志物或的分析物相关联的构件(4a)结合第一阳性标志物(10a)，阻止目前位于捕获区(5)的复合物被第一阳性标志物偶合物(6c)捕获。复合物穿过捕获区(5)并在检测区(7)被结合，因为检测区(7)的固定的结合构件(8)结合复合物的分析物(9)。

在存在分析物(9)且不存在第一阳性标志物(10a)的情况下(右图)，与第一结合配偶体连接的可移动的第一阳性标志物偶合物(6c)被移动并流向捕获区(5)，在此第一结合配偶体被固定的第二结合配偶体(6d)结合。可移动的经标记偶合物(2)的用于将经标记偶合物与分析物相关联的构件(4a)结合分析物(9)以形成复合物。复合物被合在捕获区(5)，因为目前位于捕获区(5)的可移动的第一阳性标志物偶合物(6c)被经标记偶合物(2)的用于将可移动的经标记偶合物与第一阳性标志物或第一阳性标志物偶合物相关联的构件(4d)结合。

图7是显示P3G对由包被抗P3G和抗α-hCG的经标记试剂产生的测定信号的影响的图，在一定的hCG浓度范围内，在备有用P3G偶合物的捕获区和抗-β-hCG检测区的多孔载体上测试。

应当注意，图中所示的阳性标志物偶合物可以用阳性标志物代替，例如，如果阳性标志物是不需要偶合的非半抗原标志物。

实施例

现在将参考以下非限制性实施方案描述本发明。

实施例1

本实施例描述了用于孕妇和围绝经期或绝经后女性的临床尿样和掺加后(spiked)尿标准的带有抗hCG检测区和抗FSH捕获区的妊娠试纸的制备，。

生产检测试剂

制备金溶胶标记抗体

测试溶胶

将40mL的在20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液pH6.5中的40μg/mL小鼠抗α-hCG抗体溶液添加到40mL，40nm，A520nm＝OD5.0的金溶胶中(BBI International)，并在室温下在磁力搅拌器上与金溶胶快速混合30分钟。30分钟后，将在50mM碳酸盐缓冲液(pH10.5)中的836.5μL、52.6mg/mL的β酪蛋白溶液加入到反应混合物中，并在室温下再继续混合30分钟。反应混合物中β酪蛋白的最终浓度为0.55mg/mL。固定在金溶胶上的抗α-hCG抗体能够通过hCG和FSH的α亚基结合这些激素。将溶胶溶液倒入Falcon管(50mL)中并将溶液离心(4000rcf，10分钟，15℃)。小心去除上清液，加入洗涤缓冲液(1mL，10mM MES，pH6.5，含0.1mg/mLβ酪蛋白)，将沉淀的溶胶涡旋和超声处理以重新悬浮。重新悬浮后，将溶液离心(5000rcf，10分钟，15℃)。去除上清液并将溶胶重新悬浮在少量储存缓冲液(10mM MES pH6.5，含0.1mg/mLβ酪蛋白)中。通过测量520nm处的吸光度来确定溶胶制剂的最终OD。

对照溶胶

将20mL在20mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)缓冲液pH 8.0中的12.5μg/mL，Rabbit IgG抗体(Dako)溶液添加到20mL 40nm A520nm＝OD 5.0的金溶胶(BBIInternational)中，并在室温下在磁力搅拌器上与金溶胶快速混合30分钟。30分钟后，将在50mM碳酸盐缓冲液(pH 10.5)中的76μL、52.6mg/mL的β酪蛋白溶液加入到反应混合物中，并在室温下再继续混合30分钟。反应混合物中β酪蛋白的最终浓度为0.1mg/mL。将溶胶溶液倒入Falcon管(50mL)中并将溶液离心(4000rcf，10分钟，15℃)。小心去除上清液，加入洗涤缓冲液(含0.1mg/mLβ酪蛋白的1mL 10mM MES pH6.5)以重新悬浮溶胶。将沉淀的溶胶涡旋和超声处理。重新悬浮后，将溶液离心(5000rcf，10分钟，15℃)。去除上清液并将溶胶重新悬浮在少量储存缓冲液(10mM MES pH 6.5，含0.1mg/mLβ酪蛋白)中。通过测量520nm处的吸光度来确定溶胶制剂的最终OD值。

金溶胶标记结合试剂的制备和固定方法

将抗hCG包被的金溶胶(测试)偶合物和兔IgG包被的金溶胶(对照)偶合物在离心机中离心并去除上清液。将所得颗粒涡旋并超声处理，然后在金溶胶偶合物喷雾缓冲液中重构至所需金的OD的两倍(在本实施例中，测试溶胶为16OD/ml，对照溶胶为10OD/mL)。然后将测试溶胶和对照溶胶按1:1混合，得到含8OD/ml测试溶胶和5OD/ml对照溶胶的喷雾溶液。以下实施例中使用的金溶胶偶合物喷雾缓冲液含100mM Tris pH 7.4、20％w/v蔗糖(Sigma)和10％w/v牛血清白蛋白(Proliant Biologicals SKU#68700)。将玻璃纤维(GEHealthcare)装载到Biodot喷雾装置上。提供Biodot喷雾装置以在玻璃纤维上的所需位置(距下游边缘6.5mm)用测试和对照偶合物浸渍/灌注玻璃纤维。在本实施例中，玻璃纤维在距玻璃纤维下游边缘6.5mm的距离处以1.7μL/cm的绘图速率单次通过OD10偶合物进行喷涂。此外，从距玻璃纤维的下游边缘16mm的距离处以1.7μl/mm的绘图速率喷洒0.56M EDTA水溶液。注入金溶胶的玻璃纤维在55℃下干燥，并在室温下与干燥剂一起储存在密封的箔袋中。

特定结合物质的制备和定位及固定方法

在固定在硝化纤维上之前，将小鼠抗β-hCG抗体在含0.05％(w/v)叠氮化钠的磷酸盐缓冲液(PBSA)中稀释至3mg/mL。在固定在硝化纤维上之前，将抗β-FSH抗体在PBSA中稀释至1.5mg/mL。制备聚乙烯醇(PVA)封闭缓冲液(pH9)(20mM Tris base(Sigma)，1％w/v PVA(80％水解的PVA，9-10K MW Sigma)，0.05％w/v吐温20(Sigma)和150mM NaCl(Sigma))。通过将2％w/v的蔗糖(Sigma)和2.5ml的乙醇(Sigma)添加到47.5mL的PVA封闭缓冲液中来制备PVA封闭溶液。将带有预打孔定位孔至4mm(MDI)的白色背衬硝化纤维切成35cm*40mm的条带。提供Biodot绘图仪以在硝化纤维带上绘制单线抗β-hCG抗体形成检测区和抗βFSH抗体形成捕获区和绘制山羊抗兔(Lampire)在所需位置形成对照区。抗β-hCG抗体以3mg/ml的浓度和1uL/cm的绘制率沉积在距硝化纤维膜底部(上游端)15mm的距离处，抗FSH抗体以3mg/mL的浓度、3μL/cm绘制速率沉积在距硝化纤维素底部(上游端)8mm处，并且山羊抗兔抗体以2mg/mL的浓度、1uL/cm的绘制速率沉积在距硝化纤维膜底部(上游端)22mm处。绘制后，条带在55℃下干燥，使用PVA封闭液封闭，然后在65℃下干燥，并在室温下用干燥剂储存在密封的铝箔袋中。

试纸构造

在运动学通用层压机模块组装单元的帮助下，将测定部件组装成试纸。将背衬层压板(Lohman)放置在运动卡压板上，并将带有固定捕获、检测和控制区的封闭硝化纤维带固定在背衬层压板上的预定位置。抗-α-hCG和兔IgG金溶胶偶合物注入的玻璃纤维条带固定在背衬层压板上，在硝化纤维带上有2毫米的重叠。辊垫确保条带的所有组分与背衬层压板良好接触。然后使用内部旋转切割机将带子切割成4毫米的单独条带，并与干燥剂一起储存在箔袋中直至准备使用。

制备装置

将试纸与浸渍有缓冲液以控制pH值的吸收性采样器一起组装到塑料外壳部件中。外壳部件包含带有定位销的下半部和带有用于观察硝化纤维条上的线的窗口的上半部以及保持吸收性采样器与试剂区上游的试纸接触的构件。窗口位置使得测试和控制线对用户可见，但捕获区线被隐藏。使用销定位条带，将条带放置在下壳部分。一个4×12毫米的水槽垫(GE Healthcare)被放置在条带的近端。顶盖用于关闭装置。

实施例2

本实施例展示了一种利用阴性妊娠标志物(FSH)结合感兴趣分析物hCG的试验。通过将含抗β-FSH抗体的捕获区定位在作为检测区的抗β-hCG区的上游来证明阴性标志物对hCG试验的灵敏度的影响。由此可以确定作为样本中FSH的功能，FSH捕获区对移动到检测区的经标记颗粒的量的影响。

方法

如实施例1中所描述来制备装置。为了测试FSH浓度对试验灵敏度的影响，从内部志愿者收集了非妊娠的尿样。使用抗α-TSH抗体去除尿液以去除内源性hCG和LH，然后加入一系列浓度的hCG和FSH。通过将掺加后尿液施加到试验装置的吸收性采样器来运行装置。使用内部摄像系统在5分钟时测量检测区的线的强度，并且40名非专业用户还对装置进行了妊娠或未妊娠评分。非专业用户是非SPD工作人员，他们以前从未见过这种类型的妊娠测试。每个非专业用户对7个装置进行目测评分，这些装置以随机顺序呈现给他们。

结果

随着尿样中FSH浓度的增加，相机测量的检测区的线的强度和非专业用户评分为妊娠的装置量都减少了，这表明FSH作为阴性标志物对hCG检测灵敏度的影响。结果示于下表1中。

表1：由内部摄像头系统测量的平均的线的强度和带有抗hCG检测区和抗FSH捕获区的妊娠试纸在视觉上得分为阳性的装置量，这些测试条运行带有hCG和FSH的混合阴性尿液。NT—未测试。

实施例3

本实施例展示了在含妊娠尿液和含垂体hCG的绝经前后尿液的临床样本中，利用妊娠阴性标志物(FSH)与感兴趣的分析物hCG相结合的试验。

方法

如实施例1中所描述来制备装置。为了测试本发明对区分源自妊娠的hCG和垂体hCG的试验能力的影响，使用了从妊娠和围绝经期/绝经后女性收集的尿样。选择了32份妊娠尿液，这些尿液是在相对于预期经期当天的第-5天到第-3天收集的，hCG浓度范围为3-22mIU/mL。还选择了来自围绝经期和绝经后女性的50份尿样，其中，含5-10mIU/ml垂体hCG。通过将尿液施加到试验装置的吸收性采样器来运行装置。使用内部摄像系统在5分钟时测量检测区的线的强度，并且装置还由三名非专业用户(不以阅读装置作为其工作的一部分的SPD工作人员)评分为妊娠或未妊娠。

结果

如下表2所示，尽管hCG的最大浓度高达10mIU/mL，但50份围绝经期/绝经后尿液均未被称为妊娠，而90％的妊娠尿液被称为妊娠，包括那些hCG浓度低至3mIU/ml的。这证明了使用阴性标志物的捕获区在产生敏感妊娠测试中的有效性，该测试在临床样本中保持对妊娠的高特异性。

表2：当使用含5—10mIU/mlhCG的围绝经期/绝经后尿液样本和从第-5天到第-3天(相对于预期经期)的妊娠尿样运行的情况下，由非专业用户评分为妊娠的装置量。

实施例4

本实施例展示了一种利用妊娠的阳性标志物(P3G)结合感兴趣分析物hCG的试验。通过将有抗P3G～偶合物的捕获区定位在作为检测区的抗β-hCG区的上游来证明阴性标志物对hCG试验的灵敏度的影响。因此可以确定作为样本中P3G的功能，P3G偶合物对移动到检测区的颗粒的量的影响。在包被到胶乳颗粒上之前，通过将抗α-hCG和抗P3G抗体混合在一起，将蓝色胶乳颗粒包被该抗体混合物中。在测试中，将包被的胶乳制剂应用于P3G(阳性标志物)和hCG(感兴趣分析物)的各种混合物中的多孔载体，以观察试验中P3G水平对检测区信号的影响。

制备经标记试剂(包被抗α-hCG和抗P3G的胶乳)

2％固体的1ml胶乳(直径400nm)通过离心洗涤(13000rcf，20℃，4分钟)，去除上清液，将沉淀重新悬浮到500μl 100mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)中，得到最终浓度4％固体胶乳。将胶乳在46℃下加热约30分钟，同时轻轻混合。在100mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)中制备了1200μg/ml抗α-hCG(小鼠单克隆)和600μg/ml抗P3G(Fab，小鼠单克隆)的混合物涂层。将抗体混合物在46℃下加热30分钟，同时轻轻混合。

将加热的抗体混合物以等体积加入加热的胶乳中并混合以得到1ml 2％固体的胶乳加上600μg/ml抗α-hCG和300μg/ml抗P3G。将100μl 95％乙醇加0.5％乙酸钠加入混合物中，将所得混合物在46℃温和混合下孵育60分钟。

在去离子水中加入110μl的200mg/ml BSA(ProliantBiologicals，试剂级)以封闭胶乳，并在46℃下混合30分钟。在BSA中封闭后，通过三个离心步骤洗涤胶乳并去除上清液(弃掉上清液)，在每个离心步骤后将沉淀重新悬浮到10mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)中。在最后的离心步骤后去除上清液，并将胶乳重新悬浮到800μl的缓冲液中，该缓冲液含10％BSA和20％蔗糖的100mM TrispH8.5(最终悬浮缓冲液)，产生约2％的固体胶乳。胶乳在使用前在最终重悬缓冲液中以1+7进一步稀释。

制备含抗β-hCG的固定区(检测区)和作为捕获区的P3G-偶合物固定区的多孔载体。

硝化纤维素膜(MDI 12μm)用作多孔载体，在其上沉积了捕获区和单独的检测区。

如实施例1中所描述，使用Biodot绘图仪将含3mg/ml的抗β-hCG的PBSA作为一个区(检测区)施加到距测试条近端10mm处的硝化纤维素膜上。蛋白质浓度为3mg/ml的P3G-偶合物(通过将P3G与作为载体蛋白质的小鼠单克隆抗体连接而制备)沉积在距离作为捕获区的检测区上游的测试条近端5mm处。在干燥步骤之后，将膜在PVA中封闭并干燥，然后与干燥剂一起储存在箔袋中。将所得膜切成4mm宽的试纸，每个试纸有距试纸近端5mm的捕获区和距试纸近端10mm的检测区。

测试在多孔载体上包被有抗P3G和抗α-hCG的胶乳颗粒，该多孔载体制备有P3G偶联物的捕获区和作为检测区的抗β-hCG区。

测试程序或“试验”包括制备包被胶乳加标准缓冲液(样本)的混合物(样本)，所述混合物含不同水平P3G和hCG(5μl稀释胶乳加50μl标准缓冲液)，并将所述混合物施加到含捕获区和检测区的硝化纤维素膜。这是通过将试纸的近端浸入含涂层胶乳和含不同水平P3G和hCG的缓冲标准液的池或混合物中来实现的。在试纸的远端(检测区下游约20毫米)应纸水槽材料作水槽。一旦试纸底部的混合物变干，通过将缓冲液(50μl PBSA加0.1％卵清蛋白)施加到试纸底部并使其穿过洗涤未结合的胶乳的水槽到达试纸的末端。洗涤后，在光学读数系统(图像捕获系统)上测量检测区产生的信号，检测区产生的信号强度报告为数字，检测区的信号强度越高，则数字越大。

为了测试P3G试验对检测区反应的影响，在含0μg/ml P3G但有不同水平hCG的缓冲液中测试胶乳制剂。这在含75ug/ml P3G但也含不同水平的hCG的标准缓冲液中重复进行。

将胶乳制剂与含0μg/ml P3G和不同水平的hCG(0、2.5和10mIU/ml hCG)的标准缓冲液混合，并且具有P3G偶联物的捕获区和抗β-hCG作为检测区的试纸，在浸入混合物中的情况下保持垂直，使混合物通过膜移动到施加在远端的水槽中。如上所述洗涤试纸并在成像系统上获取检测区的读数。

重复上述操作，这次将胶乳制剂与包含75μg/ml P3G和0、2.5和10mIU/ml hCG的标准缓冲液混合。遵循上述程序并在内部摄像系统上读取检测区域的读数。

结果

在试验中用0μg/ml P3G测试的胶乳使得大部分经标记试剂在捕获区被捕获，(经标记试剂上的抗P3G在捕获区结合P3G～偶联物)。这显著减少了移动到检测区的经标记试剂的量，使得在检测区看到的对hCG的反应降低。试验中75μg/ml P3G的存在降低了捕获区对经标记试剂的捕获，(由于标准缓冲液中的P3G与经标记试剂上的抗P3G结合，阻止经标记试剂结合P3G～偶合区)允许更多的经标记试剂移动到检测区，在那里可以看到在hCG存在下有明显更强的信号(见图7)。显然，试验中阳性标志物的水平会影响检测区对hCG的反应，这取决于测定中阳性标志物(在这种情况下为P3G)的量。

实施例5

本实施例展示了一种利用妊娠的阴性标志物(FSH)结合感兴趣分析物hCG的试验。通过将含抗β-FSH抗体的捕获区定位在作为检测区的抗β-hCG区的上游，证明了阴性标志物对临床尿样中hCG试验的灵敏度的影响。使用具有生理水平的hCG和FSH的围绝经期和绝经后临床尿样显示FSH捕获区对检测区中产生的试验信号的影响，并与通过将hCG加入FSH和hCG耗尽的尿液池制备的标准品进行比较。

方法

如实施例1中所描述来制备装置。为了测试阴性标志物对临床样本中hCG试验灵敏度的影响，使用从围绝经期/绝经后女性收集的尿样进行了测试。此外，通过将已知浓度的hCG加入FSH和hCG耗尽的尿液池(如实施例2中所述的耗尽FSH和hCG)来制备标准品。共测试了200个围绝经期样本和200个绝经后样本。这些样本中的hCG水平由临床分析仪(DELFIA)测量。此外，25个装置使用将5mIU/ml hCG添加到hCG和FSH耗尽的混合尿液。另外25个装置使用将10mIU/ml hCG添加到hCG和FSH耗尽的混合尿液。通过将尿液施加到试验装置的吸收性采样器来运行装置。使用内部摄像系统在添加样本后5分钟测量检测区中hCG线的强度，并由两名技术人员通过观察hCG线的结果，可见线(指示阳性，因此妊娠结果)或没有线，(指示阴性，因此未妊娠的结果)，对装置进行目测评分为妊娠或未妊娠。测试临床样本和标准品的顺序是随机的，读取测试的技术人员对随机化不知情，以消除任何技术人员读取偏差。

结果

如下表3所示，92％d使用5mIU/ml hCG加入的混合尿液的装置和100％的使用10mIU/ml hCG加入的混合尿液的100％装置被技术人员目测为妊娠。尽管包括高达8.8mIU/ml hCG的hCG浓度，但所有200份围绝经期和200份绝经后尿液样本均由两名技术人员读取者目测为未妊娠。在围绝经期和绝经后尿液中看到的这种hCG水平可能会增加传统妊娠测试中的假阳性结果，所述测试设计用来检测低至5mIU/ml的hCG。

表3：装置中使用的围绝经期、绝经后尿样和通过加入FSH和hCG耗尽的阴性尿液池制备的hCG标准品的hCG浓度范围和目测评分。

图8显示了检测区中hCG测试线的信号强度，由内部摄像头系统测量，根据hCG浓度绘制。对于不存在FSH的掺加后标准，信号强度随着hCG浓度的增加而增加。关于包含hCG和FSH的围绝经期和绝经后样本，显然样本中FSH的存在减少了到达hCG测试区的标志物的量，因为标志物在捕获区结合。这使得hCG检测区的信号降低，因此在hCG检测区提供了真实的结果，因为这些围绝经期和绝经后的样本的结果呈妊娠阴性。