化合物JNc-463的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 化合物JNc-463的制备方法及其应用 (Preparation method and application of compound JNc-463 ) 是由 马鑫 毛爱琴 唐春雷 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了化合物JNc-463的制备方法及其应用。本发明所述制备方法包括如下步骤：(1)将色胺与乙酸溶解于甲醇中,加入3,4-二苄氧基苯甲醛,搅拌得到混合溶液Ⅰ；(2)加入NaBH-(3)CN搅拌,得到混合溶液Ⅱ；将步骤(2)配制的混合溶液Ⅱ浓缩,得到粗品；将步骤(3)得到的粗品经硅胶层析后得到化合物JNc-463。本发明所述方法制备的化合物JNc-463用于制备治疗抗高血压药物,可以很好的实现特异性靶向TRPV4-eNOS耦联复合体,克服了非专一性靶点以及副作用较多等问题,满足日益增长的临床需求。(The invention discloses a preparation method and application of a compound JNc-463. The preparation method comprises the following steps: (1) dissolving tryptamine and acetic acid in methanol, adding 3, 4-dibenzyloxybenzaldehyde, and stirring to obtain a mixed solution I; (2) adding NaBH 3 CN is stirred to obtain a mixed solution II; concentrating the mixed solution II prepared in the step (2) to obtain a crude product; and (4) carrying out silica gel chromatography on the crude product obtained in the step (3) to obtain a compound JNc-463. The compound JNc-463 prepared by the method is used for preparing antihypertensive drugs, can well realize specific targeting of TRPV4-eNOS coupled complex, overcomes the problems of non-specific target spots, more side effects and the like, and meets the increasing clinical requirements。)
技术领域
本发明涉及医药应用技术领域，特别涉及化合物JNc-463的制备方法及其应用。
背景技术
抗高血压药物，包括利尿剂、β-受体阻滞剂、Ca2+通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂，是治疗高血压的主要手段。这些药物主要影响交感神经活动或心输出量，导致血压降低。然而，由于它们的全身活性，在治疗期间有副作。因此，在高血压的发展过程中，开发专门针对基本成分的新手段以避免不必要的副作用是很重要的。
瞬时受体电位通道V4(TRPV4)是一类非选择性阳离子通道蛋白，它广泛表达在呼吸道的上皮细胞、巨噬细胞、气道平滑肌等细胞上,可以被多种刺激物激活,如PH、温度、花生四烯酸、渗透压等，而在内皮细胞的功能受到广泛关注，参与了多种血管功能，包括应答血流剪切力，调节血管张力，机械信号传导，血管新生等。
在大导管血管中，一氧化氮(NO)能选择性地介导内皮依赖性松弛。NO的缺失会使血压升高，而欧共体的功能障碍往往伴随着一氧化氮的产生和生物利用度的降低，那么动脉压力反射性和顺应性的降低会进一步升高血压，导致恶性循环。NO的主要来源是血管内皮细胞中的NO合成酶(eNOS)。众所周知，生理刺激如血流剪切力通过eNOS的磷酸化调节NO的产生，eNOS对血管扩张反应有很大贡献。研究表明，TRPV4对NO相关的血管扩张反应至关重要。在正常情况下，TRPV4与eNOS形成耦联复合体，TRPV4被激活后，引起钙离子内流，从而刺激eNOS产生NO，使得血管舒张，但在高血压病理情况下，TRPV4与eNOS的耦联降低，使NO产生降低，血压增高。近年来，在临床中迫切需要疗效更佳，副作用更小，生物利用度好的降压药。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了化合物JNc-463的制备方法及其应用。本发明所述制备方法简单，成本低，制备的化合物JNc-463作为抗高血压药物可以很好的实现特异性靶向TRPV4-eNOS耦联复合体，克服了非专一性靶点以及副作用较多等问题，满足日益增长的临床需求。
本发明的技术方案如下：
化合物JNc-463的制备方法，所述制备方法包括如下合成路线:
所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将色胺与乙酸溶解于甲醇中，加入3，4-二苄氧基苯甲醛，搅拌得到混合溶液Ⅰ；
(2)加入NaBH3CN搅拌，得到混合溶液Ⅱ，
(3)将步骤(2)配制的混合溶液Ⅱ浓缩，得到粗品；
(4)将步骤(3)得到的粗品经硅胶层析后得到化合物JNc-463。
进一步地，步骤(1)中，所述甲醇为无水甲醇；所述混合溶液Ⅰ中色胺的摩尔浓度为0.29-0.32mol/L，乙酸的摩尔浓度为0.29-0.32mol/L，3，4-二苄氧基苯甲醛的摩尔浓度为0.29-0.32mol/L。
进一步地，步骤(2)中，所述混合溶液Ⅱ中NaBH3CN的摩尔浓度为0.29-0.32mol/L；所述搅拌的时间为4-6h。
进一步地，步骤(4)中，所述化合物JNc-463的产率为20-22％。
进一步地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将3.12mmol色胺和3.12mmol乙酸溶解于10mL的甲醇溶液中，再加入3.12mmol的3，4-二苄氧基苯甲醛，搅拌1h得到混合溶液Ⅰ；
(2)加入3.12mmol的NaBH3CN，搅拌5h得到混合溶液Ⅱ；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液Ⅱ浓缩，得到粗品；
(4)将步骤(3)得到的粗品在硅胶上层析，得到化合物JNc-463；所述化合物JNc-463的产率为21％。
一种上述制备方法制备的化合物JNc-463的应用，所述化合物JNc-463用于制备治疗高血压、高血脂的药物。
进一步地，所述药物制成片剂、丸剂或颗粒，所述片剂包含化合物JNc-463和辅料；所述辅料包含崩解剂、淀粉中的一种或多种。
进一步地，所述药物制成胶囊剂。
进一步地，所述化合物JNc-463溶于生理盐水配制成注射液；所述注射液中化合物JNc-463的摩尔浓度为1-30μmol/L。
所述层析的洗脱液为CH2Cl2与MeOH，CH2Cl2与MeOH的体积比为20：1。
本发明所述方法制备的化合物JNc-463溶于生理盐水配制成摩尔浓度为8-12μmol/L的溶液，按溶液质量与人体体重质量比0.8-1.2mg/kg的量，通过尾静脉注射给药。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明首先通过结构域位点突变的方法寻找TRPV4蛋白和eNOS的相互作用位点结构域，然后筛选能增强TRPV4-eNOS复合体空间耦联度的化合物，该化合物作用于高血压小鼠模型，对高血压具有很好的疗效；将高血压模型小鼠血管的舒张程度提高了25％-30％；使高血压模型小鼠的血压下降18-26mmHg。
(2)本发明一种可以特异性靶向TRPV4-eNOS耦联复合体的小分子药物，通过作用高血压小鼠模型发现该化合物，通过增强TRPV4-eNOS复合体空间耦联度从而起到抑制高血压的效果，它克服了非专一性靶点以及副作用较多等问题，满足日益增长的临床需求，对于高血压药物的研发具有重大的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的化合物JNc-463对TRPV4和eNOS相互作用效率影响的示意图。
图2为本发明实施例1制备的化合物JNc-463对高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠主动脉舒张影响的示意图。
图3为本发明实施例1制备的化合物JNc-463作用于高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠的降压效果的示意图。
图4为不同浓度化合物JNc-463对TRPV4-eNOS偶联的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：化合物JNc-463的制备方法
将色胺(500mg，3.12mmol)和AcOH(187mg，3.12mmol)溶解于10mL的MeOH溶液中，再在溶液中加入3，4-二苄氧基苯甲醛(994mg，3.12mmol)，该混合物在常温下搅拌1小时。然后加入NaBH3CN(196mg，3.12mmol)，加入后，将混合物在室温下再搅拌5小时。浓缩混合物，得到粗品，在硅胶(CH2Cl2/MeOH＝20/1)上层析，得到白色固体的化合物JNc-463(300mg，产率：21％)。
MS(ESI)：质量计算为C31H30N2O2，462.2，m/z为463.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ10.78(s，1H)，7.50-7.28(m，12H)，7.11-7.04(m，3H)，7.02-6.93(m，2H)，6.83-6.80(m，1H)，5.07(d，J＝8.0Hz，4H)，3.65(s，2H)，2.83(t，J＝6.0Hz，2H)，2.75(t，J＝6.0Hz，2H)。
实施例2
实施例1：化合物JNc-463的制备方法
将色胺2.9mmol和2.9mmolAcOH溶解于10mL的MeOH溶液中，再在溶液中加入2.9mmol的3，4-二苄氧基苯甲醛，该混合溶液在常温下搅拌1h。然后加入2.9mmol的NaBH3CN，加入后，将混合物在室温下再搅拌4h。冷冻浓缩混合溶液，得到粗品，在硅胶(CH2Cl2/MeOH＝20/1)上层析，得到白色固体的化合物JNc-463。
实施例3
将色胺3.2mmol和3.2mmolAcOH溶解于10mL的MeOH溶液中，再在溶液中加入3.2mmol的3，4-二苄氧基苯甲醛，该混合溶液在常温下搅拌1h。然后加入3.2mmol的NaBH3CN，加入后，将混合物在室温下再搅拌6h。冷冻浓缩混合溶液，得到粗品，在硅胶(CH2Cl2/MeOH＝20/1)上层析，得到白色固体的化合物JNc-463。
应用例：
将实施例1制备的化合物JNc-463溶于0.9％的生理盐水，配制成摩尔浓度为10μmol/L的溶液，按溶液质量与小鼠体重质量比1.0mg/kg的量，通过尾静脉注射方式给药。给药频次为每天一次，直到血压恢复正常值，每次连续给药不超过14天。
应用例2：
将实施例1制备的化合物JNc-463溶于0.9％的生理盐水，配制成摩尔浓度为1μmol/L的溶液，按溶液质量与小鼠体重质量比0.8mg/kg的量，通过尾静脉注射方式给药。给药频次为每天一次，直到血压恢复正常值，每次连续给药不超过14天。
应用例3：
将实施例1制备的化合物JNc-463溶于0.9％的生理盐水(本发明所用生理盐水均为0.9％的生理盐水)，配制成摩尔浓度为30μmol/L的溶液，按溶液质量与小鼠体重质量比1.2mg/kg的量，通过尾静脉注射方式给药。给药频次为每天一次，直到血压恢复正常值，每次连续给药不超过14天。
测试例1：TRPV4和eNOS偶联程度测试
构建高盐饲养以及AngII(强效血管收缩剂)诱导的高血压小鼠模型，按应用例1的方法将实施例1制备的化合物JNc-463溶于生理盐水中，通过尾静脉注射到小鼠体内(1mg/kg)，按生理质量与小鼠体重质量比1.0mg/kg的量将生理盐水直接通过尾静脉注入到小鼠体内作为对照组，2h后分别取小鼠主动脉，利用荧光能量共振转移(FRET)检测TRPV4和eNOS的相互作用(耦联程度)。
如图1所示，化合物JNc-463作用于高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠后，与对照组(直接尾静脉注射生理盐水)相比，TRPV4和eNOS的耦联程度明显增强，说明该化合物对该高血压模型有明显的增强复合体耦联的作用。
测试例2：血管舒张情况
构建高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠模型，按应用例1的方法将实施例1制备的化合物JNc-463溶于生理盐水中，通过尾静脉注射到小鼠体内(1mg/kg)，按生理质量与小鼠体重质量比1.0mg/kg的量将生理盐水直接通过尾静脉注入到小鼠体内作为对照组，2h后分别取小鼠主动脉，利用肌动描记器(myography)检测小鼠胸主动脉的舒张情况。
如图2所示，化合物JNc-463作用于高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠后，与对照组相比，小鼠胸主动脉的舒张程度明显增强，说明该化合物对该高血压模型有明显的舒张血管作用，能够将高血压模型小鼠血管的舒张程度提高25％-30％。
测试例3：降压作用测试
构建高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠模型，按应用例1的方法将实施例1制备的化合物JNc-463溶于生理盐水中，通过尾静脉注射到小鼠体内(1mg/kg)，每天一次，连续注射7天，按生理质量与小鼠体重质量比1.0mg/kg的量将生理盐水直接通过尾静脉注入到小鼠体内作为对照组，检测注射有化合物JNc-463的实验组和对照组的小鼠血压变化情况。
如图3所示，化合物JNc-463作用于高盐饲养以及AngII诱导的高血压小鼠后，与对照组相比，小鼠血压明显下降，说明该化合物对该高血压模型有明显的降压作用，能够将高血压模型小鼠的血压下降18-26mmHg。
测试例4：化合物JNc-463浓度对TRPV4-eNOS偶联的影响
原代分离C57BL/6J小鼠主动脉内皮细胞，在含有NaCl(60mmol)的培养基中置于细胞恒温培养箱培养24h后，加入不同剂量的JNc-463(1μmol/L，3μmol/L 10μmol/L，30μmol/L)，不同剂量的JNc-463是通过生理盐水配制的，继续培养24h后细胞用含有4％多聚甲醛的PBS溶液固定。细胞在封闭液(在PBS中加入5％BSA和0.1％Triton X-100)中经过封闭、渗透化处理，用一抗4度孵育过夜后，清洗三次，然后在室温下用二抗孵育2h。使用goat anti-TRPV4和rabbit anti-eNOS作为一抗，二抗是Alexa Fluor 568和Alexa Fluor 488。通过激光共聚焦显微镜的FRET AB模式检测突变前后两种蛋白的耦联情况。
如图4所示，在高盐原代培养的小鼠主动脉内皮细胞中，JNc-463以剂量依赖的方式增强TRPV4-eNOS的相互作用，剂量为10μmol/L时，JNc-463浓度对TRPV4-eNOS的相互作用的影响减弱。
本发明具体实施例仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后，可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，凡是利用本发明说明书内容所作出的等效结构或等效流程变化，或直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。