重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达菌株及其应用
阅读说明：本技术 重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达菌株及其应用 (Recombinant human type I collagen I alpha 1x6, expression strain and application thereof ) 是由 赵健烽 朱逸丽 余继刚 高力虎 冯丽萍 黄建民 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达菌株及其应用。所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1xN由若干个重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa亲水性片段串联而成。本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白。本发明的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性,其69氨基酸长度的重复短肽结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同,应用于人体中不会造成免疫排斥。本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白与传统的罗非鱼皮胶原相比,能够显著提高皮肤含水量、改善皱纹尺寸、深度和纹理,可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。(The invention discloses a recombinant human type I collagen I alpha 1x6, an expression strain and application thereof. The recombinant human I-type collagen I alpha 1xN is formed by connecting a plurality of recombinant human I-type collagen I69 aa hydrophilic segments in series. The recombinant humanized type I collagen expression strain can effectively and stably express the recombinant humanized type I collagen in large quantity. The recombinant human collagen has good hydrophilicity and stability, the repeated short peptide structure of 69 amino acids is 100% identical to the corresponding part of the natural collagen gene sequence, and the recombinant human collagen can not cause immunological rejection when being applied to a human body. Compared with the traditional tilapia skin collagen, the recombinant human type I collagen of the invention can obviously improve the water content of skin, the size, the depth and the texture of wrinkles, and can be widely applied to the fields of biomedical materials, cosmetics and the like.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6的毕赤酵母工程菌及其应用。
背景技术
胶原蛋白是一种生物高分子物质，是维持肌肤和组织器官的形态和结构以及修复各损伤组织的重要物质。其主要存在于人和动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织中重要的结构蛋白质。胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等)，从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是存在以下问题：(1)制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；(2)提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；(3)来源于动物，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；(4)加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；(5)技术门槛低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。
为了解决传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原。因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。范代娣等人应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域，实现了产业化生产(中国专利201310157411.7，201510883010.9等)。。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高企，并存在隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。
因此，越来越多的学者开始利用真核微生物生产重组胶原蛋白。酵母菌具有天然的优势。首先酵母已经在食品、医药化工等行业有着悠久的使用历史，同时可以用于外源蛋白的分泌表达，有利于下游的分离纯化工艺，同时不会像细菌那样存在内毒素及热源等的生物安全性问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲水性优异的重组人源Ⅰ型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用，能高效、安全地进行重组人源Ⅰ型胶原蛋白的胞外分泌表达。
实现本发明目的的技术方案如下：
本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa，氨基酸序列如SEQ No.2所示。
本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1xN，由N段SEQ No.2所示的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa串联而成，N≥2。
在具体的实施方式中，本发明提供了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6即I 414aa，由6段SEQ No.2所示的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa串联而成，氨基酸序列如SEQ No.3所示。其理论分子量约38.345kd。
本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的编码基因，核苷酸序列如SEQ No.4所示。
本发明构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的核苷酸序列如SEQ No.5所示，通过将重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的编码基因双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
本发明构建的分泌表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母PichiapastorisJY0401，保藏编号为CGMCC No.16463，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0401通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
本发明还提供上述重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6在制备去皱护肤品中的应用。
优选地，上述去皱护肤品中，重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的浓度为0.1～0.75％(w/v，g/mL)，更优选为0.5～0.75％(w/v，g/mL)。
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥。本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白与传统的罗非鱼皮胶原相比，能够显著提高皮肤含水量、改善皱纹尺寸、深度和纹理，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为人Ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
图2为重组人源Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的构建示意图。
图4为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的Sc I酶切琼脂糖凝胶电泳图。
图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。
图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。
图8为#8阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
图9为#9阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
图10为#10阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
图11为#10阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
图12为水分改善率结果图。
图13为皱纹改善率结果图。
图14为纹理改善率结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
1.蛋白序列选择
对人Ⅰ型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。根据疏水性分析结果，选择评分低的氨基酸片段，取其中69个短肽单位片段(即重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa，SEQ No.2)，将这个短肽片段收尾连接重复六次整合成新的蛋白，即本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白(即重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6，SEQ No.3)。对重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图2所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。
2.质粒构建及线性化
将重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6翻译成碱基序列(SEQ No.4)，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因Iα1x6，双酶切连接至ppic9K载体的Xho I和Not I之间，图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Iα1x6转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如SEQ No.5所示。SEQ No.5的第244-249碱基处及1513-1521碱基处区域为酶切位点。
提取质粒20μg，使用Sac I酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示。其中M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1为Sac I酶切；2为回收的目的片段。
表1酶切线性化体系配制表
3.电转毕赤酵母细胞GS115
冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母GS115感受态细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650uL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3-4d。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
4.G418筛选高拷贝克隆
将MD平板上长出的克隆用无菌枪头刮下，并悬于1ml YPD培养基中，取50μL涂布于YPD+0.5mg/ml G418、YPD+1mg/ml G418、YPD+2mg/ml G418、YPD+3mg/ml G418和YPD+4mg/mlG418平板上，30℃恒温培养3-4d。
5.PCR鉴定阳性克隆菌株
待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μL YPD液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA，如图6所示。图中，M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1-10：各克隆菌株提取的基因组。
使用载体上引物PCR鉴定，预期条带大小约2kb，2kb为扩增序列大小，结果如图7所示，其中，M：DNA标准品，从下到上100，200，500，750，1000，2000bp；1-10：各克隆菌株的PCR扩增片段。
6.小试表达
诱导表达：取鉴定的阳性菌株(7#，8#，9#，10#)50μL接入装有10mlBMGY的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至OD600＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10ml BMMY重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96hr样品10000r/min离心2min收集上清液待检测。
三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物：
(1)在离心管中加入500μL培养液上清和1/9体积的100％的TCA，振荡混合，4℃沉淀过夜；
(2)12000r/min离心10min，沉淀为粘稠带黄褐色胶状物，弃上清，收集沉淀，另将EP管倒置于吸水纸上，37℃烘箱静置10～20min，使管壁无明显液体残留；
(3)加入200μL冷丙酮，振荡混匀，样品在室温下静置10min，洗去管壁和管底残留的TCA；
(4)12000r/min离心10min，弃上清，重复步骤(2)和(3)，重复2～3次；
(5)加入上样缓冲液30μL，37℃孵育1h，溶解沉淀；如果沉淀不溶解，可用100μL枪头吹打至沉淀溶解。
表达分析：
SDS-PAGE电泳检测：选取7#，8#，9#，10#阳性菌进行表达情况分析结果如图8、9、10、11所示。其中，M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清；2：阳性菌株培养0小时上清；3：阳性菌株培养24小时上清；4：阳性菌株培养48小时上清；5：阳性菌株培养72小时上清；6：阳性菌株培养96小时上清。
取8#阳性菌进行菌株保藏，命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0401，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.16463。
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性好、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，所以应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明采用的是分泌型表达载体，成功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达，表达产物分泌在上清液中，方便纯化，具有其他重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势，便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母之后，基因整合在毕赤酵母基因组上，所以重组菌的稳定性好，经过多次传代基因不容易发生流失并能保持高效表达的性状，能够很好的实现稳定生产，毕赤酵母生产方法为好氧发酵，菌体密度高，表达量还有很大的提升空间。
实施例2
对照组(对比例1，罗非鱼皮胶原蛋白组)和效果组(重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6)均选取年龄35-55周岁中国女性，面部有细纹和皱纹者，每组30人，每天晚上使用一瓶。测试采取双盲测，第0周和第8周时分别用Milipure智能皮肤水分测试仪和Antera3D皮肤测试仪测试各试验人员面部的水分、皱纹总体尺寸、皱纹深度和纹理四项指标。
(1)对照组(对比例1)
成分：罗非鱼皮胶原蛋白，浓度0.75％(w/v，g/mL，即7.5g/L)
称取罗非鱼皮胶原蛋白粉末，充分搅拌溶解，于万级背景下的百级区域内0.22μm除菌过滤，分装冻干，冻干后每份装量为15mg固体。使用时溶媒为2ml纯化水。
(2)成分：重组人源Ⅰ型胶原蛋白，浓度0.075％(w/v，g/mL，即0.75g/L)
称取纯度为99％重组人源Ⅰ型胶原蛋白，充分搅拌溶解，按GMP要求0.22μm滤膜除菌过滤，一万级区域内分装冻干，冻干后每份装量为1.5mg固体。使用时溶媒为2ml纯化水。
(3)成分：重组人源Ⅰ型胶原蛋白，浓度0.1％(w/v，g/mL，即1g/L)
称取纯度为99％重组人源Ⅰ型胶原蛋白，充分搅拌溶解，按GMP要求0.22μm滤膜除菌过滤，一万级区域内分装冻干，冻干后每瓶装量为2mg固体。使用时溶媒为2ml纯化水。
(4)成分：重组人源Ⅰ型胶原蛋白，浓度0.25％(w/v，g/mL，即2.5g/L)
称取纯度为99％重组人源Ⅰ型胶原蛋白，充分搅拌溶解，按GMP要求0.22μm滤膜除菌过滤，一万级区域内分装冻干，冻干后每瓶装量为5mg固体。使用时溶媒为2ml纯化水。
(5)成分：重组人源Ⅰ型胶原蛋白，浓度0.5％(w/v，g/mL，即5g/L)
称取纯度为99％重组人源Ⅰ型胶原蛋白，充分搅拌溶解，按GMP要求0.22μm滤膜除菌过滤，一万级区域内分装冻干，冻干后每瓶装量为10mg固体。使用时溶媒为2ml纯化水。
(6)成分：重组人源Ⅰ型胶原蛋白，浓度0.75％(w/v，g/mL，即7.5g/L)
称取纯度为99％重组人源Ⅰ型胶原蛋白，充分搅拌溶解，按GMP要求0.22μm滤膜除菌过滤，一万级区域内分装冻干，冻干后每瓶装量为15mg固体。使用时溶媒为2ml纯化水。
表2～7分别为使用对照组0.75％w/v罗非鱼皮胶原蛋白以及各不同浓度的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的试验人员在使用前和使用8周后的面部皮肤指标测试结果。图12为水分改善率结果图，图13为皱纹改善率结果图，图14为纹理改善率结果图。从表2～7以及图12～14，可以看出重组人源Ⅰ型胶原蛋白应用于人体皮肤，纹理较使用前浅，皮肤含水量相应有所增加，皱纹总体尺寸和皱纹深度均有明显改善，相比于传统的罗非鱼皮胶原蛋白，其去皱效果显著。
表2对照组0.75％w/v罗非鱼皮胶原蛋白的测试结果
表3效果组浓度0.075％w/v重组人源Ⅰ型胶原蛋白的测试结果
表4效果组浓度0.1％w/v重组人源Ⅰ型胶原蛋白的测试结果
表5效果组浓度0.25％w/v重组人源Ⅰ型胶原蛋白的测试结果
表6效果组浓度0.5％w/v重组人源Ⅰ型胶原蛋白的测试结果
表7效果组浓度0.75％w/v重组人源Ⅰ型胶原蛋白的测试结果
序列表
<110> 江苏江山聚源生物技术有限公司
<120> 重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达菌株及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 1440
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp
20 25 30
Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His
35 40 45
Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp
50 55 60
Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn
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Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly
100 105 110
Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro
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Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro
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Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser
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Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro
195 200 205
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Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg
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Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro
245 250 255
Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly
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275 280 285
Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg
290 295 300
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
305 310 315 320
Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys
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Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly
355 360 365
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Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly
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Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn
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Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys
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Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
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Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu
465 470 475 480
Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro
485 490 495
Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly
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Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg
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Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro
530 535 540
Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
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Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro
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Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly
595 600 605
Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro
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625 630 635 640
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Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro
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Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln
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Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser
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Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
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Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro
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Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala
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Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala
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Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly
885 890 895
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu
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Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro
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Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly
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Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro
965 970 975
Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly
980 985 990
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro
995 1000 1005
Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro
1010 1015 1020
Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly
1025 1030 1035 1040
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro
1045 1050 1055
Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala
1060 1065 1070
Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly
1075 1080 1085
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp
1090 1095 1100
Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro
1105 1110 1115 1120
Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly
1125 1130 1135
Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys
1140 1145 1150
Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg
1155 1160 1165
Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1170 1175 1180
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe
1185 1190 1195 1200
Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr
1205 1210 1215
Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp
1220 1225 1230
Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met
1250 1255 1260
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Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly
1285 1290 1295
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Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu
1315 1320 1325
Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp
1330 1335 1340
Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr
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Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr
1365 1370 1375
Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly
1380 1385 1390
Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr
1395 1400 1405
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Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Arg Ile Ile
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<211> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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1 5 10 15
Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser
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Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
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Lys Asp Gly Leu Asn
65
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<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly
1 5 10 15
Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser
35 40 45
Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Asp Gly Leu Asn Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu
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Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser
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Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly
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Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg
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Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly
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Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly
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Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys
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Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly
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Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala
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Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly
340 345 350
Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His
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Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro
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Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly
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Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagggtcaca gaggtttctc tggattgcaa ggtccacctg gtccaccagg ttctccaggt 120
gagcaaggtc cttctggtgc ttctggtcct gctggaccaa gaggtcctcc aggatctgct 180
ggtgctccag gtaaagatgg tttgaacggt cctcaaggac ctcgtggtga caaaggtgaa 240
acaggcgagc agggtgatcg tggtattaag ggacatagag gattttccgg tctgcaggga 300
cctccaggtc ctcctggtag tccaggtgaa cagggaccaa gtggtgctag tggacctgcc 360
ggtcctagag gcccacctgg ttcagctggt gcacctggaa aggatggtct taatggacca 420
cagggaccta gaggcgacaa gggcgagaca ggcgaacaag gcgatagggg aatcaaaggt 480
cataggggtt ttagcggact tcagggacca ccaggaccac ctggatctcc cggcgaacag 540
ggtccatcag gtgcttcagg cccagctggt cccaggggac ctcctggttc tgcaggcgcc 600
cctggtaaag acggacttaa tggtcctcag ggtccacgtg gcgataaggg cgaaaccggt 660
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cgtggcccac caggatcagc aggcgctccc ggcaaggacg gtttaaatgg acctcaaggc 840
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ggcgacagag gaatcaaagg acatcgtggt ttctccggtc tacaaggtcc tcctggacct 1140
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ccaccaggtt ccgctggcgc accaggtaag gacggattga at 1242
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
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ggaccacctg gatctcccgg cgaacagggt ccatcaggtg cttcaggccc agctggtccc 840
aggggacctc ctggttctgc aggcgcccct ggtaaagacg gacttaatgg tcctcagggt 900
ccacgtggcg ataagggcga aaccggtgag cagggcgata gaggcattaa gggtcatcgt 960
ggattcagtg gattacaagg ccctccagga cctccaggct caccaggtga acaaggccca 1020
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ccaccaggta gtgctggcgc tcctggaaaa gatggcctaa acggacccca aggtcctaga 1320
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ggattgaatt aagcggccgc 1520
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