利用基因工程菌和酵母耦合发酵大规模产cmp-唾液酸的方法
阅读说明：本技术 利用基因工程菌和酵母耦合发酵大规模产cmp-唾液酸的方法 (Method for large-scale production of CMP-sialic acid by coupling fermentation of genetically engineered bacteria and yeast ) 是由 张洪涛 游星 周文 黎玉 詹晓北 于 2021-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用基因工程菌和酵母耦合发酵大规模产CMP-唾液酸的方法,属于发酵工程技术。本发明以工业化大肠杆菌为基础,在大肠杆菌中异源表达了CMP-唾液酸酶Neu5Ac,构建得到了基因工程菌株,将构建得到的任一种株工程菌和酵母进行混合发酵,以CMP和唾液酸为底物,从而合成CMP-唾液酸,为酸性母乳寡糖—唾液酸化寡糖的唾液酸化步骤工业化生产提供一条可行途径,不仅得率高,而且价格低廉,打破由于CMP-唾液酸价格昂贵,而难以大量合成唾液酸基寡糖的瓶颈问题。在发酵罐条件下反应4h,CMP-唾液酸的产量可高达24.5g/L,具有明显社会效益,市场前景广阔。(The invention discloses a method for producing CMP-sialic acid on a large scale by coupling fermentation of genetically engineered bacteria and yeast, belonging to the fermentation engineering technology. The invention takes industrialized escherichia coli as a base, heterologously expresses CMP-sialidase Neu5Ac in the escherichia coli, constructs a genetic engineering strain, performs mixed fermentation on any one of the constructed engineering strains and yeast, takes CMP and sialic acid as substrates, thereby synthesizing CMP-sialic acid, provides a feasible way for industrial production of the sialylation step of the acid breast milk oligosaccharide-sialylation oligosaccharide, has high yield and low price, and breaks the bottleneck problem that the large-scale synthesis of sialylation oligosaccharide is difficult due to the high price of CMP-sialic acid. The reaction is carried out for 4 hours under the condition of a fermentation tank, the yield of the CMP-sialic acid can reach 24.5g/L, and the method has obvious social benefit and wide market prospect.)
技术领域
本发明涉及利用基因工程菌和酵母耦合发酵大规模产CMP-唾液酸的方法，属于发酵工程技术。
背景技术
HMO(Human milk oligosaccharides)是人乳中含有的所有低聚糖的统称，也叫人乳寡糖，是母乳中仅次于乳糖的第二大类碳水化合物成分和第三大营养成分，占母乳干物质的10％。目前，HMO已经被鉴定出来的种类高达200余种，HMO可分为三种主要的类型：(1)A.岩藻糖基化的中性HMO占总量的35～50％，代表物质2'-岩藻糖基半乳糖(2'-FL)是所有HMO中含量最高的，占近30％；(2)非岩藻糖基的中性HMO，占总量的42～55％，代表物质乳糖-N-新四糖(LNnT)；(3).唾液酸化的酸性HMO。占总量的12～14％，分为3'-唾液酸乳糖(3'-SL)和6'-唾液酸乳糖(6'-SL)。其中3'-唾液酸乳糖(3'-SL)和6'-唾液酸乳糖(6'-SL)表现出了极好的营养品质，目前科学家们都在研究如何高效的合成3'-唾液酸乳糖(3'-SL)和6'-唾液酸乳糖(6'-SL)。尤其是最近报告双唾液酸化修饰的DSLNT具有降低婴儿肠炎的发生，使得母乳寡糖中唾液酸基寡糖的合成成为一个新的关注领域。
合成唾液酸乳糖的方法主要有化学合成法和生物合成法，由于化学合成法涉及到繁琐的保护和去保护步骤，不适合大规模生产，所以目前利用生物技术合成唾液酸乳糖成为最佳方案。唾液酸乳糖的合成需要将唾液酸活化为胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸(cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid，CMP-Neu5Ac)，然后CMP-Neu5Ac在唾液酸转移酶的催化下，才实现唾液酸乳糖的合成。CMP-Neu5Ac其在细胞内的合成过程是：在CMP-Neu5Ac合成酶(NeuA)的催化下，1分子的CTP和1分子的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)形成化学键，生成CMP-Neu5Ac。该过程是一个需要消耗大量CTP的过程。由于CTP价格昂贵(8000元/公斤)，造成作为唾液酸乳糖合成前体物质CMP-Neu5Ac不仅价格昂贵、并且不容易大量获得，因此限制了唾液酸乳糖的产量。要想降低CMP-Neu5Ac价格，如何实现CTP的廉价合成成为关键。目前尚缺少有效的方法。
发明内容
为了解决目前唾液乳糖合成前体物质CMP-Neu5Ac价格昂贵、不易获得，从而导致CTP生产成本高的问题，本发明构建了在大肠杆菌中异源表达了CMP-唾液酸酶Neu5Ac的基因工程菌，将基因工程菌与酵母加入含有CMP和Neu5Ac的反应体系中，构建了耦合发酵生产CMP-Neu5Ac的方法，实现了CMP-Neu5Ac的高效生产，并降低了生产成本。
本发明提供了一种生产CMP-Neu5Ac的方法，所述方法是利用表达CMP-唾液酸合成酶的基因工程菌株和酵母耦合发酵合成CMP-Neu5Ac。
在一种实施方式中，所述CMP-唾液酸合成酶来源于Neisseria meningitidisM0579、Neisseria meningitidis strain M22819、Pasteurella multocida ATCC43137、Haemophillus ducreyi 35000HP。
在一种实施方式中，所述Neisseria meningitidis M0579的GenBank号为CP007668.1，编码CMP-唾液酸合成酶的基因如第1012519～1013205位所示；所述Neisseriameningitidis strain M22819的GenBank号为CP016646.1，编码CMP-唾液酸合成酶的基因如第1413007～1414122所示；所述Pasteurella multocida ATCC43137的GenBank号为CP008918.1，编码CMP-唾液酸合成酶的基因如第1975338～1976009所示；所述Haemophillus ducreyi 35000HP的GenBank号为AE017143.1，编码CMP-唾液酸合成酶的基因如第540594～541283所示。
在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和/或酵母菌为宿主。
在一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)、T7 Express或JM109(DE3)为宿主。
在一种实施方式中，所述宿主中编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因被敲除。
在一种实施方式中，所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母和面包酵母。
在一种实施方式中，将基因工程菌和酵母分别培养并收集菌体细胞，将菌体细胞加入含有CMP和Neu5Ac的反应体系中。
在一种实施方式中，基因工程菌和酵母的添加比例为(1:3)-(3:1)。
在一种实施方式中，基因工程菌和酵母的添加比例为1:2。
在一种实施方式中，所述基因工程菌的添加量为50-100g/L。
在一种实施方式中，所述啤酒酵母已于2021年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61663。
在一种实施方式中，所述基因工程菌的添加量为50g/L。
在一种实施方式中，反应体系中的CMP和Neu5Ac浓度分别为70～90mM和40～60mM。
在一种实施方式中，CMP的浓度为80mM，Neu5Ac的浓度为60mM。
在一种实施方式中，反应体系中还含有10～40mM的Mg2+。
在一种实施方式中，Mg2+的浓度为20mM。
在一种实施方式中，反应体系中还含有葡萄糖、KH2PO4、DTT、甘油、乙醛。
在一种实施方式中，反应体系中还含有Nymeen S-215吐温80、Trition-100、乙醇中的任一种。
在一种实施方式中，包含200～300mM葡萄糖、10～20mM MgCl2、200～250mMKH2PO4、1～5mM DTT、100～150mM Tris、5～10mL/L甘油、1～6mL/L乙醛、1～4mg/mL NymeenS-215。
在一种实施方式中，在25-35℃、150-250r/min下反应3～5h。
在一种实施方式中，反应时间优选为4h。
本发明还提供了一株啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已于2021年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61663。
本发明的有益效果：
本发明以工业化大肠杆菌为基础，在大肠杆菌中表达了不同来源的CMP-唾液酸酶Neu5Ac，构建得到了一系列基因工程菌株，将构建得到的任一种株工程菌和酵母进行混合发酵，以CMP和唾液酸为底物，从而合成CMP-唾液酸，为酸性母乳寡糖—唾液酸化寡糖的唾液酸化步骤工业化生产提供一条可行途径，不仅得率高，而且价格低廉，打破由于CMP-唾液酸价格昂贵，而难以大量合成唾液酸基寡糖的瓶颈问题，反应4h，CMP-唾液酸的产量可高达24.5g/L，具有明显社会效益，市场前景广阔。
生物材料保藏
本发明所提供的啤酒酵母，分类学名称为Saccharomyces cerevisiae，于2021年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61663，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为本发明构建的质粒PET28a-neuA双酶切电泳图；其中M：10000DNA Marker；1：PET28a-neuA经Nde I/Sal I双酶切后的重组质粒。
图2为本发明pET-28a-neuA的重组表达质粒的结构图。
图3为基因工程菌株JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-NeuA表达重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图4为本发明利用酵母和基因工程菌株混合发酵合成CMP-唾液酸体系的原理图。
图5为本发明利用酵母和基因工程菌株混合发酵合成CMP-唾液酸检测图；A：TLC检测，1：CMP，2：CDP，3：CTP，4：CMP-Neu5Ac，5：双菌耦合催化产物；B：CMP标品，C：CMP-Neu5Ac标品，D：双菌耦合催化产物。
图6为反应时间对CMP-Neu5Ac合成的影响图。
图7为双菌细胞生物量比对CMP-Neu5Ac合成的影响图。
图8为Neu5Ac浓度对CMP-Neu5Ac合成的影响图。
图9为CMP浓度对CMP-Neu5Ac合成的影响图。
图10为Mg2+浓度对CMP-Neu5Ac合成的影响图。
图11为重组菌JM109(DE3)/pET28a-neuA的重复使用次数图。
具体实施方式
1、CMP-Neu5Ac的HPLC定量分析：
发酵液或者冻干后的CMP-唾液酸直接用于HPLC分析。HPLC色谱条件为AgressifC18 5μm(4.6mm×250mm)；流动相A为0.1M磷酸钾缓冲液和8mM四丁基硫酸氢铵(pH 5.3)，流动相B为70％流动相A与30％甲醇；梯度洗脱程序(A变化)：0-2.5min 100％，2.5-10min100％-60％，10-11min 60％-0％，11-15min保持0％，15-16min 0％-100％，16-30min保持100％；0.6mL/min；进样量为10μL；紫外检测波长270nm；柱温30℃，结果见图5。
2、高密度发酵培养基：酪蛋白(1％)，酵母提取物(0.5％)，Na2HPO4(25mM)，KH2PO4(25mM)，NH4Cl(50mM)，Na2SO4(5mM)，MgSO4(2mM)，1000倍微量金属离子(0.2X)，甘油(0.5％)，葡萄糖(0.05％)，乳糖(0.2％)；1000倍微量金属离子的组成如下：50mM FeCl3,20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，2mM CoCl2，2mM CuCl2，2mM NiCl2，2mM Na2MoO4(钼酸钠)，2mM Na2SeO3(亚硒酸钠)和2mM H3BO3。
3、耦合发酵体系：100g/L啤酒酵母和50g/L JM109(DE3)/pET28a-neuA；在包含70mM/L CMP、60mM/L Neu5Ac、300Mm/L葡萄糖、20Mm/L MgCl2、248.3Mm/L KH2PO4、1Mm/LDTT、150Mm/L Tris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mL Nymeen S-215。
实施例1：异源表达CMP-唾液酸酶基因的工程菌的构建
1、CMP-唾液酸酶基因(neuA)获得
分别以来源于Neisseria meningitidis M0579、Neisseria meningitidisstrain M22819、Pasteurella multocida ATCC43137、Haemophillus ducreyi 35000HP的neuA基因序列为模板(GenBank号分别为CP007668.1(1012519…1013205)、CP016646.1(1413007…1414122)、CP008918.1(1975338…1976009)、AE017143.1(540594…541283))，根据核苷酸序列设计引物(酶切位点分别为Nde I和Sal I)。分别用对应的正向和反向引物来扩增neuA基因，将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小为0.7kb左右(neuA)，其大小与目的基因大小完全吻合。
2、重组蛋白表达质粒的构建
将步骤1中得到的PCR产物分别纯化回收后，用Nde I和Sal I双酶切，纯化回收片段。然后将pET28a空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化到E.coli JM109，在氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上涂布，37℃过夜培养，将长出的菌落进行菌落PCR，电泳，PCR产物电泳后成功发现出700bp左右片段(neuA基因的长度为687bp)左右的片段，该菌落即为含有pET-28a-neuA的阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取，获得大量pET-28a-neuA，用Nde I/Sal I双酶切后的重组质粒，可以看到700bp左右片段(neuA基因的长度为687bp)左右的片段和5400bp左右的线性质粒片段(pET-28a空载体大小为5310bp)(见图1)。pET-28a-neuA载体的构建步骤见图2。
3、基因工程菌株的构建
制备BL21(DE3)△LacZ、T7 Express和JM109(DE3)△LacZ感受态细胞，在一管40μL的感受态中加入5μL的pET-28a-neuA载体，混匀后通过电极法进行转化，转化结束后，取出电转杯，加入1mL SOC培养液，混匀后转入1.5mL离心管中，于37℃培养1h。按每个平板100μL涂布到含Kan(20μg/mL)的LB平板上，37℃倒置过夜培养。从平板上挑取单一菌落，接种于液体LB培养基中，于37℃培养12-18h，然后小量提取质粒DNA，用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定。鉴定正确的基因工程菌株分别命名为BL21(DE3)△LacZ/pET-28a-neuA、JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-neuA、BL21(DE3)△LacZ/pET-28a-M0579neuA、JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-M0579neuA、BL21(DE3)△LacZ/pET-28a-M22819neuA、JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-M22819neuA、BL21(DE3)△LacZ/pET-28a-HdneuA或JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-HdneuA、T7 Express/pET-28a-neuA、T7 Express/pET-28a-M0579neuA、T7 Express/pET-28a-M22819neuA、T7 Express/pET-28a-HdneuA。
4、基因工程菌株的大规模获取
将步骤3得到的重组菌株进行培养富集，并验证其蛋白产物。
(1)方法1：将重组菌株接种至含20μg/mL Kan的10mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h-16h，再按2％(2mL/100mL)的接种量转接到含20μg/mL Kan的100mLLB液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至OD600约为0.6后，加入终浓度为0.1-0.8mmol/L的IPTG进行诱导，200r/min摇瓶培养20h。4℃、8 000×g离心10min收集菌体。
(2)方法2：将重组菌株接种至含20μg/mL Kan的10mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h-16h，按照5％(5mL/100mL)的接种比例接种含20μg/mL Kan的高密度发酵培养基，37℃、200r/min摇瓶培养至OD600约为0.6后，加入终浓度为0.1-0.8mmol/L的IPTG进行诱导，200r/min摇瓶培养20h。4℃、8 000×g离心10min收集菌体。
将诱导前及诱导20h的菌液分别与SDS-PAGE Loading缓冲液混匀，100℃加热10min，得到诱导前、后样品，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。
部分菌株生产的目的蛋白的SDS-PAGE结果见图3(泳道1为对照，泳道2为JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-neuA)检测目的蛋白的表达，从图3可以看出在与对照组现相比，诱导组在25kD-35kD之间有明显的表达条带，其分子量与文献报道的NeuA相一致，其余的重组菌株表达的蛋白也在25kD-35kD之间有明显的表达条带，说明NeuA酶基因酶在重组菌株中成功表达。
实施例2：单基因工程菌转化合成CMP-Neu5Ac
转化条件：20mM MgCl2、1mM DTT、150mM Tris，60mM CTP、60mM Neu5Ac和50g/LJM109(DE3)/pET28a-neuA菌体(湿重)，30℃，200r/min条件下反应2h。
(1)IPTG诱导浓度的优化
将JM109(DE3)/pET28a-nst分别接种至含20μg/mL Kan的10mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h，再按2％(v/v)的接种量转接到含20μg/mL Kan的100mL LB液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至OD600约为0.6后，分别加入终浓度为0.1、0.2、0.5、0.8、1.0和1.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为16℃，200r/min诱导20h后收集菌体。得到的菌体在上述转化液中催化反应，通过HPLC检测CMP-Neu5Ac的生成。
结果如图5所示，当IPTG诱导浓度低于0.8mmol/L时，CMP-Neu5Ac产量随着IPTG浓度的增加而增加；当IPTG浓度大于0.8mmol/L时，CMP-Neu5Ac产量逐渐降低；且在IPTG浓度为0.8mmol/L时，CMP-Neu5Ac产量最高，为17.7g/L，因此，确定IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol/L。
(2)诱导温度的优化
将JM109(DE3)△LacZ/pET-28a-neuA接种至含20μg/mL Kan的10mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h，再按2％(v/v)的接种量转接到含20μg/mL Kan的100mLLB液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至OD600约为0.6后，在IPTG浓度为0.8mM，诱导温度分别为16℃、30℃、37℃，200r/min诱导20h后收集菌体。收集后的菌体在上述转化液中催化反应，用HPLC检测CMP-Neu5Ac的浓度。
结果如图6所示，当细胞的诱导温度是37℃时，在诱导时间是20h的条件下，CMP-Neu5Ac产量为24.3g/L，高于诱导温度为16℃和30℃时的产量，因此，选取诱导温度37℃为工程菌株的最佳诱导温度，诱导时间为20h。
实施例3：啤酒酵母和工程菌株双菌株耦合发酵合成CMP-Neu5Ac
1、基因工程菌细胞的大规模获得
工程菌细胞的来源有两条途径：(1)高密度发酵培养基中含有乳糖，乳糖诱导酶的表达；(2)IPTG诱导。
方法1，高密度发酵：首先挑工程菌单菌落接种于20μg/ml Kan的50ml LB液体培养基，37℃，200r/min，过夜培养(12h)至生长对数期。然后按5％(5mL/100mL)接种量接种至含25μg/ml Kan的500ml高密度发酵培养基，37℃，200r/min摇瓶培养2h。再20℃，200r/min培养20h。6000rmp离心，收集菌体，用0.5％的生理盐水洗细胞泥一次，再离心收集，菌体用于进一步的全细胞耦合催化。
方法2，IPTG诱导发酵：将工程菌株接种至含20μg/mL Kan的10mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h，再按2％(2mL/100mL)的接种量转接到含20μg/mL Kan的100mL LB液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至OD600约为0.6后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导，200r/min摇瓶培养20h。4℃、8 000r/min离心10min收集菌体。
2、酿酒酵母细胞的获得：本发明所用的酿酒酵母为啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae和Saccharomyces Carlsbergensis)、酿酒酵母和面包酵母：(1)啤酒厂产生啤酒过程中所产生的废啤酒酵母可以用于本专利生产；(2)酿酒酵母、酿酒酵母和面包酵母则通过高密度发酵获得。
YPD平板菌株活化培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，琼脂粉20，pH自然。
酿酒酵母种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉8.5，(NH4)2SO4 1.3，CaCl2·2H2 O0.06，MgSO4·7H2O 0.1，pH自然。
酿酒酵母发酵初始培养基(g/L)：酵母粉12，葡萄糖5，(NH4)2SO4 2.5，CaCl2·2H2O 0.1，MgSO4·7H2O 1.5，pH 6.0。
酵母细胞的培养：酿酒酵母培养在7L发酵罐内进行，初始装液量3L的酿酒酵母发酵初始培养基，接种量10％。温度控制在30℃，通风比为2.0vvm，通过调节搅拌转速将溶氧DO维持在25％以上。发酵开始后菌体先利用初始培养基中的葡萄糖生长，葡萄糖耗尽后溶氧数值则迅速上升，此时就开始流加氨水和蜜二糖，在整个发酵过程中，发酵液的pH用氨水和42.5％的磷酸自动控制在6.0。直到细胞达到200g/L，终止发酵，离心收集酵母细胞，用于下一步的耦合发酵。
3、啤酒酵母和工程菌株双菌株耦合发酵合成CMP-Neu5Ac
将步骤1获得的菌体细胞JM109(DE3)/pET28a-neuA和废旧酵母(本实施例中选取啤酒酵母S189)混合直接用于合成CMP-唾液酸(原理见图4)。
(1)反应条件的优化
①反应时间的优化
反应体系1L：酿酒酵母100g/L、工程菌株50g/L、以70mM CMP、60mM Neu5Ac为底物，在包含300mM葡萄糖、20mM MgCl2、248.3mM KH2PO4、1mM DTT、150mM Tris-HCl、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mL Nymeen S-215的体系中，以30℃、150-250r/min为基础，探究反应时间对JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA和酿酒酵母双菌耦合催化合成CMP-Neu5Ac的影响。
从反应开始，每隔1h定时取样，用HPLC方法检测CMP-Neu5Ac生成量，结果如图6所示。从图中可以看出，在反应4h前，CMP-Neu5Ac浓度逐渐增加，因为在反应初期CMP需要在废啤酒酵母的作用下合成CTP，然后CTP和Neu5Ac才能在CMP-Neu5Ac合成酶的催化下合成CMP-Neu5Ac，因此初期CMP-Neu5Ac浓度逐渐增加。在反应4h时CMP-Neu5Ac浓度达到最大值为11.7g/L，但是随着催化时间的增加，CMP-Neu5Ac浓度逐渐降低。这是因为CMP-Neu5Ac不稳定极易降解，反应时间过长CMP-Neu5Ac被降解为CMP和Neu5Ac。所以选择4h为双菌耦合催化的最佳反应时间。
②生物量比例的优化
以反应体系：以70mM/L CMP、60mM/L Neu5Ac为底物，在包含300Mm/L葡萄糖、20Mm/L MgCl2、248.3Mm/L KH2PO4、1Mm/L DTT、150Mm/L Tris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mLNymeen S-215为基础，优化啤酒酵母和工程菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA的生物量比(酿酒酵母:工程菌＝(3:1)-(1:3)，3:1＝150g:50g；2:1＝100g:50g；1:1＝50g:50g；1:2＝50g:100g；1:3＝50:150g)，反应4h，对CMP-Neu5Ac的生产有影响。
从图7可以看出随着JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA菌体浓度的增加，CMP-Neu5Ac产量逐渐降低；当废啤酒酵母与工程菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA生物量比为2:1时，CMP-Neu5Ac产量达到最高。由此可见，废啤酒酵母利用CMP合成CTP的速率是影响CMP-Neu5Ac产量的关键因素。因此，选择废啤酒酵母和工程菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA之间的最佳比为2：1。其中啤酒酵母浓度为100g/L和工程菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA浓度为50g/L。
③Neu5Ac浓度的优化
在反应体系：啤酒酵母100g/L、工程菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA 50g/L、以70mM/L CMP，在包含300Mm/L葡萄糖、20Mm/L MgCl2、248.3Mm/L KH2PO4、1Mm/L DTT、150Mm/LTris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mL Nymeen S-215基础上，仅通过改变Neu5Ac浓度，来探索最佳的Neu5Ac催化浓度，结果如图8所示。
从图中可以看出，在Neu5Ac浓度低于60mmol/L条件下，产物CMP-Neu5Ac的终浓度逐渐上升，在60mmol/L达到最高，但是随着Neu5Ac浓度的增加，CMP-Neu5Ac的终浓度迅速下降。故选取Neu5Ac浓度60mmol/L为最优浓度。
④CMP浓度的优化
在反应体系：啤酒酵母100g/L、工程菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA 50g/L、以Neu5Ac 60mM/L，在包含300Mm/L葡萄糖、20Mm/L MgCl2、248.3Mm/L KH2PO4、1Mm/L DTT、150Mm/L Tris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mL Nymeen S-215基础上，CMP浓度梯度设置为50、60、70、80、90、100mmol/L，反应4h，探究CMP浓度对合成CMP-Neu5Ac的影响，结果如图9所示。
从图中看出CMP-Neu5Ac的浓度随CMP浓度的增加而增加，并在80mmol/L达到最大值。然而当CMP的浓度高于80mmol/L时，CMP-Neu5Ac产量开始下降，表明当CMP浓度高于最佳浓度时，抑制了CMP-Neu5Ac合成的进行。因此选择80mmol/L CMP作为最佳浓度。
⑤Mg2+浓度的优化
以优化的发酵条件为基础：80mM CMP、60mM Neu5Ac为底物，在包含300mM葡萄糖、20mM MgCl2、248.3mM KH2PO4、1mM DTT、150mM Tris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、、4mg/mLNymeen S-215基础上、100g/L啤酒酵母、50g/L JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA溶液中，30℃，200r/min，反应4h。仅仅改变Mg2+浓度，分析Mg2+浓度对JM109(DE3)/pET28a-neuA合成CMP-Neu5Ac的影响。
从图10可以看出在Mg2+浓度低于20mmol/L时，CMP-Neu5Ac浓度逐渐升高；并在20mmol/L时，CMP-Neu5Ac浓度达到最高为15g/L，转化率为40.7％；当Mg2+浓度超过20mmol/L后，合成的CMP-Neu5Ac逐渐降解。因此选择20mM为最佳Mg2+浓度。
(2)在优化条件下发酵生产CMP-唾液酸
耦合发酵合成CMP-唾液酸在7L的发酵中进行，规模为5L，双菌耦合催化合成CMP-Neu5Ac的转化条件：以70mM/L CMP、60mM/L Neu5Ac为底物，在包含300Mm/L葡萄糖、20Mm/LMgCl2、248.3Mm/L KH2PO4、1Mm/L DTT、150Mm/L Tris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mLNymeen S-215(或16g/L吐温80、或3g/L Trition-100、或10-20％乙醇)的体系中，加入在反应体系中浓度为100g/L啤酒酵母和50g/L JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA，30℃，200r/min，反应4h即结束反应。反应混合物在4℃下离心，6000r/min，5min，除去菌体。干燥后得到CMP-唾液酸粗品，CMP-唾液酸产量高达24.5g/L。纯度高达73％。
将基因工程菌BL21(DE3)△LacZ/pET28a-neuA按照上述方法发酵生产CMP-唾液酸，CMP-唾液酸产量可达21.5g/L，纯度可达65％。
表1构建的工程菌株和CMP-唾液酸合成能力及纯度
菌株
CMP-唾液酸(g/L)
纯度
JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA
24.5g/L
73％
BL21(DE3)△LacZ/pET28a-neuA
21.5g/L
65％
JM109(DE3)△LacZ/pET28a-M0579neuA
19.5g/L
58％
BL21(DE3)△LacZ/pET28a-M0579neuA
17.5g/L
60％
JM109(DE3)△LacZ/pET28a-M22819neuA
21.5g/L
65％
BL21(DE3)△LacZ/pET28a-M22819neuA
18.5g/L
60％
JM109(DE3)△LacZ/pET28a-HdneuA
17.9g/L
53％
BL21(DE3)△LacZ/pET28a-HdneuA
16.5g/L
60％
T7 Express/pET28a-neuA
17.2g/L
62％
T7 Express/pET28a-M0579neuA
16.5g/L
60％
T7 Express/pET28a-M22819neuA
17.6g/L
56％
T7 Express/pET28a-HdneuA
18.5g/L
61％
实施例4：重组菌的重复使用次数
工程菌株细胞合成CMP-Neu5Ac是否具有可重复使用性也是其工业应用中考虑的重要因素之一。参见实施例2中的方法，利用以下反应体系：酿酒酵母100g/L、工程菌株50g/L、以70mM/L CMP、60mM/L Neu5Ac为底物，在包含300Mm/L葡萄糖、20Mm/L MgCl2、248.3Mm/LKH2PO4、1Mm/L DTT、150Mm/L Tris、10mL/L甘油、6mL/L乙醛、4mg/mL Nymeen S-215，在200rpm、37℃下反应，反应结束后测定以第一次的转化率设定为100％计算，经过5次重复使用后，工程菌株的CMP-Neu5Ac转化率仍达到第一次的47％。因此，工程菌株JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA既可以用于补料发酵，也可以用于分批发酵。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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