一种vegf-crm197重组融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种vegf-crm197重组融合蛋白疫苗及其制备方法和应用 (VEGF-CRM197 recombinant fusion protein vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 张文耀 陈国友 于 2021-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种VEGF-CRM197重组融合蛋白疫苗及其制备方法和应用。具体地,本发明提供了一种丧失VEGF生物学活力但保留免疫原性的VEGF截短体VEGF1-107抗原片段,并融合白喉毒素突变体CRM197重组表达,形成VEGF重组融合蛋白。所述VEGF重组融合蛋白与液体佐剂联合使用后可以诱导小鼠和恒河猴体内产生高滴度高抗体,阻滞VEGF-A与其受体结合,从而抑制VEGF-A对血管内皮细胞增殖促进作用。(The invention provides a VEGF-CRM197 recombinant fusion protein vaccine, a preparation method and application thereof. Specifically, the invention provides a VEGF truncation VEGF1-107 antigen fragment which loses VEGF biological activity but retains immunogenicity, and fusion diphtheria toxin mutant CRM197 is subjected to recombinant expression to form a VEGF recombinant fusion protein. After the VEGF recombinant fusion protein is used together with a liquid adjuvant, high-titer high antibodies can be induced to be generated in mice and rhesus monkeys, and VEGF-A is blocked from being combined with a receptor thereof, so that the effect of promoting the proliferation of vascular endothelial cells by the VEGF-A is inhibited.)
技术领域
本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及血管内皮生长因子（VEGF）疫苗的制备及其应用。
背景技术
VEGF/VEGFR信号通路是肿瘤组织血管生成至关重要的限制性步骤，也是促进肿瘤转移的关键因子。血管内皮生长因子A（VEGF-A）是执行肿瘤血管和淋巴管生成最密切相关的细胞因子，激活VEGF/VEGFR信号通路，可导致上皮细胞存活、有丝分裂、转移和分化、血管渗透。VEGF介导血管的高渗透已经被证实与恶性肿瘤的转移密切相关。研究表明，肿瘤组织通过组织缺氧导致VEGF-A的基因表达水平，在许多肿瘤组织中VEGF-A的表达水平都发生显著上调，例如非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌等。因此，通过阻断VEGF/VEGFR信号通路抑制血管生成是一种非常有前景的癌症治疗手段。VEGF人源化单克隆抗体已经广泛应用于转移性结直肠癌和肺癌的治疗，临床上已证实VEGF单克隆抗体可以显著延长转移性结直肠癌和肺癌患者的生存期。虽然肿瘤免疫治疗在免疫抑制剂和CAR-T等领域取得重大突破，但免疫抑制剂单抗和CAR-T治疗费用都非常昂贵。单抗药物用药剂量大、生产成本高等因素，长期使用易引起严重过敏反应。
近年来，随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，采用激活机体特异性抗肿瘤免疫功能的肿瘤疫苗治疗癌症成为恶性肿瘤治疗领域的研究热点。肿瘤疫苗是通过肿瘤相关抗原来激活肿瘤特异性的免疫反应，已达到杀伤、清除肿瘤细胞的目的，它是一种治疗性的主动免疫治疗方法。癌症疫苗策略主要包括多肽疫苗、DNA疫苗、抗原冲击树状突细胞等。截止目前有少数的靶向VEGF或VEGFR的抗血管生成疫苗进行了早期的研究，在临床前研究中取得了较好的抑制生长的效果。然而常规多肽疫苗缺乏足够的免疫原性，无法诱导体内产生中和抗体，而含有空间表位的VEGF疫苗，通常因含有VEGF生物学活性，导致疫苗注射过程中认为引入VEGF活性组分。目前已报道的靶向抑制血管生成的癌症疫苗主要采取了两种策略。其中一种VEGF疫苗为VEGF121含三个VEGFR2结合位点R82E、K82E、H82E的突变，该突变体VEGF生物学活性大大减弱。然而通过临床试验结果显示该疫苗诱导的中和抗体弱，无法有效阻断VEGF165与其受体结合。
另一种已报道的VEGF疫苗是hVEGF26-104合成多肽疫苗，该合成多肽为确保不含VEGF生物学活性，包含了C51A-C60A的突变。最近的报道显示，虽然hVEGF26-104合成多肽疫苗免疫食蟹猴可观察到一定的抗VEGF抗体滴度，但在I期临床中该多肽疫苗未诱导明显的抗人VEGF165抗体、未引起VEGF浓度水平降低，也未观察到临床上的获益。因此，VEGF疫苗的设计与制备面临的重要问题是如何突破免疫耐受，刺激同源蛋白产生免疫应答，产生抗VEGF的中和抗体。一方面多肽疫苗存在免疫原性低的缺陷，另一方面VEGF多肽表位是否可以刺激足够的抗VEGF中和抗体还未在临床上获得确证。
因此，本领域亟待开发一种无VEGF生物学活性、免疫原性高、诱导产生的抗VEGF抗体效果更好的疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无VEGF生物学活性且具有高免疫原性的VEGF融合蛋白疫苗，所述疫苗包括VEGF抗原片段（1-107）与白喉毒素突变体CRM197融合的重组融合蛋白，该疫苗不具有VEGF生物学活性、但具有强免疫原性，与液体佐剂组合后可以打破免疫机体免疫耐受，诱导机体持续产生抗VEGF中和抗体。
本发明的第一方面，提供了一种重组融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所示结构：
Z1-Z2-Z3 （I）
其中，Z1为VEGF抗原片段元件；
Z2为连接肽元件或无；和
Z3为白喉毒素突变体CRM197蛋白元件；
“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头；
所述VEGF抗原片段具有如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，其丧失VEGF生物学活力但保留免疫原性；并且所述白喉毒素突变体CRM197蛋白具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述VEGF抗原片段具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述VEGF抗原片段具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-10氨基酸，较佳地为0-5个氨基酸。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性，较佳地，至少95%的序列同一性，更佳地至少96%、97%、98%、或99%的序列同一性。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下特征：
(1)所述VEGF抗原片段是在如SEQ ID NO:8所示的VEGF121的氨基酸序列基础上，截去C末端14个氨基酸残基得到的；
(2)所述VEGF抗原片段不具有VEGF生物学活性；
(3)所述VEGF抗原片段可以诱导生物体内产生抗VEGF165抗体和中和抗体。
本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的重组融合蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述融合蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码具有式I结构的融合蛋白：
Z1-Z2-Z3 （I）
其中，Z1为VEGF抗原片段；
Z2为连接肽或无；和
Z3为白喉毒素突变体CRM197蛋白；
“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中，所述VEGF抗原片段具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述VEGF抗原片段具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述白喉毒素突变体CRM197蛋白具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:1所示的重组融合蛋白，其具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示的重组融合蛋白，其具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:9所示的重组融合蛋白，所述融合蛋白的N端含有sumo标签，其具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述载体含有本发明的第二方面所述的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述表达载体用于表达所述重组融合蛋白。
在另一优选例中，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
在另一优选例中，所述表达载体为原核表达载体。
在另一优选例中，所述表达载体为真核表达载体，可以应用于构建表达所述VEGF融合蛋白疫苗的真核细胞系。
在另一优选例中，所述载体含有两个开放阅读框，其中一个开放阅读框包含本发明第二方面所述的多核苷酸序列和编码sumo标签的核苷酸序列，编码sumo标签的核苷酸序列在所述多核苷酸序列的5’端，另一开放阅读框包含编码大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述表达载体为含两个开放阅读框的表达载体，其中一个开放阅读框包含如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，另一开放阅读框包含编码大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的核苷酸序列，如SEQ ID NO:11所示。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有本发明的第三方面所述的表达载体或者基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、昆虫细胞、SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、Origami B（DE3）。
在另一优选例中，所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢细胞（CHO）。
本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的重组融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(i)培养本发明的第四方面所述的宿主细胞；
(ii)使用诱导剂诱导所述宿主细胞表达重组融合蛋白，从而获得表达的重组融合蛋白；
(iii)分离所述表达的重组融合蛋白，从而得到经分离的重组融合蛋白。
在另一优选例中，在所述宿主细胞中，表达的重组融合蛋白以重组融合蛋白包涵体形式表达。
在另一优选例中，步骤(iii)所述的分离包括对重组融合蛋白包涵体变性和复性。
在另一优选例中，所述重组融合蛋白包涵体变性和复性的方法，包括以下步骤：
(i)用洗涤缓冲液洗涤所述重组融合蛋白包涵体；
(ii)将所述重组融合蛋白包涵体与不超过所述重组融合蛋白包涵体等质量体积的工艺用水混匀，再用变性液溶解所述重组融合蛋白包涵体，从而得到溶解的重组融合蛋白；
(iii)将所述溶解的重组融合蛋白用复性液在16～25℃的复性温度下复性，从而得到复性的重组融合蛋白。
在另一优选例中，所述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
(1)培养如本发明第四方面所述的BL21（DE3）菌株宿主细胞，至OD600值为10～20，添加诱导剂，从而获得包含重组VEGF融合蛋白包涵体的BL21（DE3）菌株；
(2)用破菌缓冲液处理所述包含重组VEGF融合蛋白包涵体的BL21（DE3）菌株，收集重组VEGF融合蛋白包涵体，并用破菌缓冲液洗涤所述包涵体，经变性、复性和纯化，从而分离出所述重组VEGF融合蛋白。
在另一优选例中，在步骤(1)中所述培养基为全合成培养基；
所述全合成培养基含1-4g/L KH2PO4，1-5g/L K2HPO4•3H2O，2-10g/L (NH4)2SO4，0.1-2g/L MgSO4•7H2O，10-50wt%葡萄糖，并且在培养过程补加10-5-wt%甘油和10-200g/L硫酸铵。
在另一优选例中，所述破菌缓冲液包含0.4-2mol/L 尿素，0.1-1.0% Triton X-100，和0.1-1.0% Triton X-114。
在另一优选例中，步骤(2)中的洗涤次数为2-5次。
在另一优选例中，所述包涵体先用不超过包涵体等质量体积的工艺用水混匀，再用如下所述变性液溶解：
在另一优选例中，所述变性液包含6 mol/L盐酸胍，1～50 mM DTT。
在另一优选例中，所述变性液先用8 mol/L尿素以1:4的比例稀释，后在复性液中稀释复性方法复性。
在另一优选例中，所述复性液中含有0.1%～0.5% PEG4000。
在另一优选例中，所述复性温度为16℃～25℃。
在另一优选例中，所述纯化为使用阴离子交换层析进行的纯化，所用的阴离子交换介质为Q sepharose。
在另一优选例中，通过添加标签或与辅助蛋白质折叠的伴侣分子共表达，所述重组融合蛋白以可溶形式表达。
在另一优选例中，所述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
(1)培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，使用诱导剂诱导所述宿主细胞表达重组融合蛋白，从而获得表达的重组融合蛋白；
(2)菌体破碎后收集表达上清，通过亲和层析粗纯；
(3)利用特异性蛋白酶切除标签，再次利用亲和层析除标签和添加的蛋白酶；
(4)通过阴离子交换层析和/或分子筛层析精纯获得高纯度的重组融合蛋白。
在另一优选例中，所述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
(1)应用本发明第三方面提供的真核表达载体，构建表达重组VEGF融合蛋白的中华仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞系；
(2)高密度发酵培养如所述CHO细胞，在发酵温度为30～38℃的条件下发酵培养7-21天，培养至细胞密度为10×106-20×106/ml；
(3)收集步骤(2)的发酵上清，分别利用疏水层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析完成纯化。
本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含本发明第一方面所述的重组融合蛋白以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。
在另一优选例中，所述载体还含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在另一优选例中，所述载体中还含有细胞转染试剂。
在另一优选例中，所述组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，所述疫苗组合物包含本发明第一方面所述的重组融合蛋白以及疫苗上可接受的载体，所述疫苗上可接受的载体优选为药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述疫苗组合物可以为二联疫苗或多联疫苗。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。
在另一优选例中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合；
在另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
在另一优选例中，所述佐剂选自下组：Montanide ISA 51 VG、磷酸铝佐剂、MF59、AS04、或其组合。
在另一优选例中，所述疫苗组合物每剂量中的VEGF重组融合蛋白的量为0.1-5mg。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物为注射剂型。
本发明的第七方面，提供了一种如本发明第一方面所述的重组融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、和/或如本发明第六方面所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述疾病选自下组：肿瘤（或癌症）、视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿、湿性年龄相关性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤（或癌症）包括实体肿瘤。
在另一优选例中，所述实体肿瘤选自下组：肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、或其组合。
本发明的第八方面，提供了一种治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用有效量的如本发明第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病选自下组：肿瘤（或癌症）、视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿、湿性年龄相关性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤（或癌症）包括实体肿瘤。
在另一优选例中，所述实体肿瘤选自下组：肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、或其组合。
本发明的第九方面，提供了一种VEGF重组融合蛋白疫苗免疫接种的方法，包括步骤：
(i)将本发明第一方面所述的VEGF重组融合蛋白与佐剂混合后乳化，得到乳化后的VEGF重组融合蛋白疫苗；
(ii)将所述乳化后的VEGF重组融合蛋白疫苗接种于待接种对象。
在另一优选例中，所述佐剂为液体佐剂。
在另一优选例中，所述液体佐剂为Montanide ISA 51 VG；
在另一优选例中，所述“VEGF重组融合蛋白与佐剂混合后乳化”具体是将VEGF重组融合蛋白与Montanide ISA 51 VG按1:（0.5-2）的体积比，利用两个注射器通过接头连接混合，先慢速来回推动10-30次，再快速来回推动30-60次；
在另一优选例中，所述接种的方式为：按0.05-2mg/kg的剂量，每周免疫1次，共免疫4次。
在另一优选例中，所述液体佐剂为磷酸铝佐剂，重组VEGF融合蛋白与磷酸铝佐剂按1:（0.2-5）的体积比混合乳化。
在另一优选例中，所述液体佐剂为MF59，重组VEGF融合蛋白与MF59佐剂按1:（0.2-5）的体积比混合乳化。
在另一优选例中，所述液体佐剂为AS04，重组VEGF融合蛋白与AS04佐剂按1:（0.2-5）的体积比混合乳化。
在另一优选例中，所述待接种对象为人或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人类哺乳动物选自下组：小鼠、大鼠、家兔、恒河猴。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了不同长度VEGF片段的VEGF生物学活性检测结果图。
图2显示了不同长度VEGF片段的免疫原性检测结果图。
图3显示了重组融合蛋白疫苗的重组表达全菌蛋白图。
图4显示了制备后重组融合蛋白疫苗SDS-PAGE纯度示意图。
图5显示了制备后重组融合蛋白疫苗RP-HPLC纯度示意图。
图6显示了重组融合蛋白疫苗免疫小鼠血清抗体滴度检测结果
图7显示了重组融合蛋白疫苗免疫小鼠血清中和抗体检测结果。
图8显示了重组融合蛋白疫苗免疫小鼠血清抑制VEGF刺激血管内皮细胞增殖检测结果。
图9显示了重组融合蛋白疫苗（序列如SEQ ID NO:2）免疫小鼠血清抗体滴度检测结果。
图10显示了重组融合蛋白疫苗序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列比对结果。
图11显示了重组融合蛋白疫苗免疫恒河猴抗体滴度检测结果。
图12显示了重组融合蛋白疫苗免疫恒河猴抗体中和抗体检测结果。
图13显示了重组融合蛋白疫苗免疫后抗体显著抑制肿瘤生长的结果，图中C021为重组融合蛋白疫苗（包含如SEQ ID NO:1所示序列）。
图14显示重组融合蛋白疫苗免疫后抗体显著延长荷瘤小鼠的生存期。
图15显示了VEGF121-CRM197和VEGF107-CRM197免疫小鼠后的抗体滴度检测对比结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，VEGF合成多肽无法刺激动物体内产生高抗体滴度，而VEGF121的截短体VEGF1-107片段丧失VEGF生物学活力但保留免疫原性，可以刺激动物体内产生高滴度抗体。将VEGF抗原片段（1-107）与白喉毒素突变体CRM197融合制得的重组融合蛋白具有强免疫原性，与液体佐剂组合后可以打破免疫机体免疫耐受，诱导机体持续产生抗VEGF中和抗体。实验证明，与VEGF合成多肽相比，本发明的VEGF重组融合蛋白与受体蛋白激酶结构域受体的亲和力更强，免疫动物后动物体内产生的抗体滴度更高。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解相同。
如本发明所用，术语“VEGF1-107片段”、“VEGF抗原片段（1-107）”和“VEGF107”可互换使用。
本发明所述的VEGF1-107片段是在如SEQ ID NO:8所示的VEGF121氨基酸序列基础上截去C末端的14个氨基酸残基，保留VEGF抗原片段从N端至C端的第107位氨基酸。得到的更短的VEGF1-107片段，丧失VEGF生物学活力但保留免疫原性，最大程度降低VEGF生物学活性引起的安全性风险，提高疫苗的免疫效能，并且可以一定程度上减少非特异性抗体的产生。
VEGF121为分泌型血管内皮生长因子，是人体天然存在分子量最小的VEGF剪切体，该分子具有刺激VEGF受体，通过信号传导诱导血管内皮细胞生长的作用。
在另一优选例中，本发明所述的VEGF1-107片段具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的VEGF1-107片段还包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，例如，所述的VEGF1-107片段具有如SEQID NO:6所示的氨基酸序列，其相比于SEQ ID NO:5具有三个氨基酸突变，具体地，第82位的Arg突变为Glu，第84位的Lys突变为Glu，第86位的His突变为Glu。
本发明的VEGF1-107片段具有以下氨基酸序列：
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPK（SEQ ID NO:5）；
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMEIEPEQGQHIGEMSFLQHNKCECRPK（SEQ ID NO:6）。
CRM197
如本发明所用，术语“CRM197”是指白喉毒素突变体CRM197，具体是白喉毒素第52位点上的甘氨酸突变为谷氨酸，其具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。该突变体毒素A片段不能与细胞核内延长因子II结合，使其丧失了细胞毒作用，但在抗原性与免疫原性仍基本与天然的白喉毒素保持一致。
融合蛋白
如本发明所用，术语“重组VEGF融合蛋白”、“VEGF重组融合蛋白”以及“VEGF融合蛋白”、“本发明的重组融合蛋白”可互换使用，均指VEGF抗原片段（1-107）（VEGF1-107片段）与白喉毒素突变体CRM197融合制得的重组融合蛋白VEGF107-CRM197。
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如Z1-Z2-Z3（式I）所示，
其中，其中，Z1为VEGF抗原片段元件；Z2为连接肽元件或无；和Z3为白喉毒素突变体CRM197蛋白元件；“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
如本发明所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的融合蛋白(如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列)的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3 个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N 末端添加或缺失一个或数15个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6×His 等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本发明的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多
2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:1-2任一所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
表达载体和宿主细胞
本发明也涉及包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述融合蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞(如大肠杆菌)，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如酵母细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：大肠杆菌、昆虫细胞、SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择大肠杆菌（例如BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、JM109等）为宿主细胞。在本发明的另一个优选实施方式中，选择CHO细胞为宿主细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽或融合蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
肽接头
本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
在本发明的一个优选实施方式中，所述肽接头的长度一般为0-10个氨基酸，较佳地0-5个氨基酸。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物。所述药物组合物含有上述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂和/或增稠剂，并可制备成如冻干粉、片剂、胶囊、糖浆、溶液或悬浮液的药剂类型。
“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温®)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。所述药物组合物用于 (a)用于治疗或预防癌症或肿瘤（尤其是实体肿瘤）；(b)用于治疗或预防视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿、湿性年龄相关性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿等疾病；(c)诱导产生阻滞VEGF与受体结合的中和抗体。
所述的实体肿瘤选自下组：肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、或其组合。
此外，所述药物组合物可以单独或与其他药物制剂组合施用于需要的对象，用于治疗或预防所述疾病。
疫苗组合物
本发明提供的药物组合物优选是疫苗组合物。所述疫苗组合物包含本发明第一方面所述的重组融合蛋白以及疫苗上可接受的载体，所述疫苗上可接受的载体优选为药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂，所述佐剂优选为液体佐剂。将本发明的疫苗组合物与液体佐剂混合乳化后，可接种于人或非人类哺乳动物，诱导体内抗VEGF中和抗体的产生。
本发明还提供了一种VEGF重组融合蛋白疫苗免疫接种的方法，包括步骤：
(i)将VEGF重组融合蛋白与佐剂混合后乳化，得到乳化后的VEGF重组融合蛋白疫苗；
(ii)将所述乳化后的VEGF重组融合蛋白疫苗接种于待接种对象。
在另一优选例中，所述佐剂选自下组：Montanide ISA 51 VG、磷酸铝佐剂、MF59、AS04、或其组合。
与现有技术策略相比，本发明主要具有如下优点：
(1)本发明选用不具有VEGF生物学活性、但具有强免疫原性的VEGF1-107片段作为抗原，该种抗原更容易在体内诱导产生阻断VEGF与受体结合的中和抗体；
(2)本发明提供了一种人VEGF1-107片段与白喉毒素突变体CRM197融合表达的重组VEGF融合蛋白疫苗，其中CRM197可以显著提高所述疫苗抗原的免疫原性；
(3)本发明提供了多种本发明所述VEGF融合蛋白疫苗的制备方法；
(4)将本发明的重组VEGF融合蛋白疫苗与液体佐剂乳化，可以进一步提高所述疫苗抗原的免疫原性。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：筛选低VEGF生物学活性、高免疫原性的VEGF抗原片段
分别通过大肠杆菌表达系统制备VEGF121（1-121）、VEGF107（1-107）和VEGF82（24-105），制备后利用VEGF响应的荧光素酶报告细胞株检测三种VEGF片段。
将VEGF响应细胞株在96孔板中铺板，待细胞固定后分别添加三种VEGF片段，VEGF片段梯度从500ng/ml倍比稀释，孵育培养24个小时后加入荧光素酶底物检测发光值。
如图1检测结果显示，较高浓度VEGF121可以通过结合响应细胞株细胞膜上的VEGFR2通过信号通路传导诱导荧光素酶表达，浓度和荧光值呈S型曲线；最高浓度500ng/ml的VEGF107和VEGF82均未诱导荧光素酶表达，说明VEGF107和VEGF82不具有VEGF生物学活性。
分别将VEGF121、VEGF107和VEGF82利用完全弗氏佐剂免疫小鼠，每次每只免疫10μg，每组共8只，单周共免疫4次，二次免疫后1周和四次免疫后1周分别采血，并用VEGF165检测抗体滴度。
结果如图2所示，二次免疫后1周V107组100%转阳，V121和V82组均只有1只转阳，V33组均未转阳。至四次免疫后1周，V107组抗体滴度最高，而V82组无转阳小鼠。该结果说明VEGF107的免疫原性最强。
通过筛选发现VEGF107（含1-107氨基酸序列）不具有生物学活力，但具有很强的免疫原性，该VEGF片段非常适合应用于制备VEGF疫苗。
实施例2：pCDFDuet-1-(sumoVEGF107-CRM197)-DsbC质粒构建及表达
将sumoVEGF107-CRM197的DNA编码序列（如SEQ ID NO: 10所示），利用基因合成手段全序列合成并构建至pCDFDuet-1表达质粒的第一个开放阅读框中，其中编码sumo的氨基酸序列位于VEGF107-CRM197（SEQ ID NO: 1）的N端，sumoVEGF107-CRM197的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；在前一步构建的基础上，将大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的DNA编码序列（如SEQ ID NO:11所示），利用基因合成手段全序列合成并构建至pCDFDuet-1表达质粒的第二个开放阅读框。鉴定完成后即完成pCDFDuet-1-(sumoVEGF107-CRM197)-DsbC构建。
取2µL构建好的成pCDFDuet-1-(sumoVEGF107-CRM197)-DsbC质粒加入BL21（DE3）表达工程菌，于冰上孵育30分钟，于42℃热激90秒，于冰上孵育5分钟后加入500µL无抗生素的LB培养基，于37℃摇床培养30分钟，取50µL铺于含100µg/ml链霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜。
挑取pCDFDuet-1-(sumoVEGF107-CRM197)-DsbC质粒转化后平板上的单克隆至LB液体培养基中，37℃培养，当培养基的OD600至10～20时，慢速补加甘油和硫酸铵，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导8小时后收集表达菌体，并用SDS-PAGE方法鉴定表达情况，如图3所示，sumoVEGF107-CRM197表达在上清组分中。
实施例3：重组融合蛋白VEGF107-CRM197的制备
取实施例2中的表达菌体，将菌体破碎后，上清立即用Ni亲和柱层析，洗杂条件为10% Buffer B（约含50mM 咪唑），洗脱条件为50% BufferB（约含250mM咪唑）。亲和层析洗脱产物经sumo标签特异性蛋白酶Ulp1酶切后，再次利用Ni sepharose FF亲和层析，收集流穿液组分，去除仍带有His标签的sumo标签、未被切除标签的目标蛋白、部分与Ni柱高亲和力的标签。
将酶切后不含标签的VEGF107-CRM197流穿组分浓缩后，继续利用Sephacryl S200分子筛层析精细纯化，收集目的蛋白峰，蛋白样品SDS-PAGE鉴定图如图4所示，RP-HPLC分析图如图5所示，二者分析纯度均大于95%。即得到重组融合蛋白疫苗VEGF107-CRM197。
实施例4：重组融合蛋白VEGF107-CRM197与液体佐剂Montanide ISA 51 VG乳化并免疫小鼠
取实施例3中制备的重组融合蛋白VEGF107-CRM197并稀释至0.2mg/ml，取0.5ml稀释后的所述融合蛋白至2ml注射器中，另取0.5ml液体佐剂Montanide ISA 51 VG至另一支2ml注射器中，将两支注射器用接头连接，先慢速来回推动15轮，后再以尽可能地快速来回推动30次即完成乳化。乳化结束后，将所有乳液推动至一侧的注射器中。
将小鼠分为试验组和对照组，每组8只小鼠，体重大于18g。试验组小鼠以100µL/只的量皮下注射乳化后的乳液，对照组皮下注射VEGF抗原，每周免疫1次，第4次免疫1周后采血测定抗VEGF165抗体滴度和抗VEGF165中和抗体。
4.1 重组融合蛋白疫苗（含有如SEQ ID NO:1所示的序列）免疫后小鼠血清中抗VEGF抗体滴度检测：
(1)包被：取ELISA检测96孔板，将VEGF165蛋白用Na2CO3-NaHCO3，pH9.6的包被缓冲液稀释至0.5µg/ml，分别取100µL稀释后VEGF165蛋白加至96孔板的各个孔中，2～8℃孵育过夜。
(2)封闭：次日，弃去包被液，每孔加入150µL含 0.05%（v/v）Tween-20、1% BSA的PBS封闭液，37℃孵育封闭1小时；
(3)洗涤：弃去封闭液后每孔用200 µL含0.05%（v/v）Tween-20的PBS反复洗涤3次，并吸干孔中的液体；
(4)将采集的小鼠血清稀释，取100µL稀释后血清加入96孔板的最左侧孔中，每只小鼠为1行，从左到右倍比稀释，共稀释12个梯度，并以未免疫小鼠血清为对照，加入血清后37℃，孵育1 h；孵育后，弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤3次；
(5)用封闭液将二抗HRP酶标抗鼠抗体稀释为1:5000，每孔加HRP酶标抗体100 µL，37℃，孵育1 h；弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤5次；
(6)显色：每孔加入100 µl TMB，室温避光孵育15 min；
(7)终止：每孔加入100 µl 0.5mol/L 硫酸终止显色；
(8)终止后，用微孔板分光光度计检测各个孔OD450的光吸收值。于450 nm处测定光吸收值，确定血清样品OD值/生理盐水对照组样品OD值≥2.1的最高稀释倍数。
如图6所示，计算8只小鼠最高稀释倍数的几何平均值即为抗体滴度，抗体滴度为3×106，超过VEGF单独抗原组的100倍。
4.2 重组融合蛋白疫苗免疫后免疫小鼠血清中抗VEGF中和抗体检测：
取ELISA检测96孔板，将VEGF165蛋白用Na2CO3-NaHCO3，pH9.6的包被缓冲液稀释至80ng/ml，分别取100µL稀释后VEGF165蛋白加至96孔板的各个孔中，2～8℃孵育过夜。次日，弃去包被液，每孔加入150µL含 0.05%（v/v）Tween-20、1% BSA的PBS封闭液，37℃孵育封闭1小时；洗涤：弃去封闭液后每孔用200 µL含0.05%（v/v）Tween-20的PBS反复洗涤3次，并吸干孔中的液体；将采集的小鼠血清稀释，初始稀释倍数为3倍，取100µL稀释后血清加入96孔板的最左侧孔中，每只小鼠为1行，并以空白组小鼠（未免疫小鼠）血清为对照，从左到右倍比稀释，共稀释12个梯度，加入稀释血清后37 ℃，孵育1 h；孵育后，弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤3次；取VEGF受体VEGFR2激酶结构域受体（KDR）与Fc融合蛋白，用封闭液稀释至160ng/ml，并取100µL加入各孔中，37℃孵育封闭1小时；弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤3次；用封闭液将HRP酶标抗VEGFR2抗体稀释为1:5000，每孔加HRP酶标抗体100µL，37 ℃，孵育1 h；弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤5次；显色：每孔加入100 µlTMB，室温避光孵育15 min；终止：每孔加入100 µl 0.5mol/L 硫酸；终止后，用微孔板分光光度计检测各个孔OD450的光吸收值。
结果如图7所示，OD450值越高表示VEGFR2激酶结构域受体结合到VEGF165含量越高，显色结果中，在对照血清组中，不同浓度的血清不影响显色结果，而在重组融合蛋白疫苗免疫组中，低稀释倍数的血清与包被VEGF的孔板孵育后，VEGFR2激酶结构域受体与VEGF165的结合受到显著的抑制，体现了强的中和抗体活性。
4.3 抑制血管内皮细胞增殖检测：
试验材料：
完全培养基1：ECM培养液中添加5% FBS（V/V），1% ECGS和1% P/S。置于玻璃或塑料瓶中，4℃条件下保存，使用期限不得超过产品表示和有效期。
完全培养基2：ECM培养液中添加0.5%FBS（V/V）、1% P/S。置于玻璃或塑料瓶中，4℃条件下保存，使用期限不得超过产品表示和有效期。
完全培养基3：完全培养基2中加入10%的CCK-8（现用现配）。
试验步骤：
(1)铺板：消化细胞后进行细胞计数，用完全培养基1将细胞稀释到3×104个/ml，接种于 96 孔细胞培养板中，每孔100 µl。37℃、5 % CO2条件下培养 18-24 h。
(2)将96孔细胞培养板中的培养基更换为完全培养基2，使细胞饥饿16-24h。
(3)样品制备：①空白对照组：不含VEGF165的完全培养基2，96孔板每孔120 µl，共计20个孔。②对照组：空白组小鼠血清用含6.25ng/mlVEGF165的完全培养基2进行2倍倍比稀释，共10个梯度浓度，每个梯度做2孔，每孔终体积120 µl。③阳性对照组：avastin（商业化VEGF单抗）用含6.25ng/mlVEGF165的完全培养基2进行2倍倍比稀释，首孔终浓度为800ng/ml，共计10个浓度梯度，每个梯度做2孔，每孔终体积120 µl。④供试样品组：重组融合蛋白疫苗免疫组血清用含6.25ng/mlVEGF165的完全培养基2进行2倍倍比稀释，共计10个梯度浓度，每个梯度2孔，每孔终体积120 µl。
将所有待测样品置于37℃、5 % CO2条件下共孵育2h。
(4)加样共孵育：取步骤(2)制备的细胞培养板，弃去各孔上清，加入步骤(3)中孵育后的不同浓度梯度的待测样品100µl，每孔总体积100µl。37℃、5 % CO2条件下培养 72h。
(5)检测：向步骤(4)培养孵育72小时的各孔中加入10μl的CCK-8，37℃培养箱内孵育5h后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
检测结果如图8所示，与avastin单克隆抗体相似，重组融合蛋白疫苗免疫组可以显著抑制血管内皮细胞的增殖，而对照组血清没有明显抑制。
实施例5：重组融合蛋白（包含如SEQ ID NO:2所示的序列）与液体佐剂MontanideISA 51 VG乳化并免疫小鼠
重组融合蛋白（如SEQ ID NO:2所示）的设计、表达及制备过程如实施例2、3所述，不同点在于将VEGF107-CRM197的DNA编码序列（如SEQ ID NO:4所示）利用基因合成手段全序列合成并构建至pCDFDuet-1-DsbC表达质粒上。SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2的序列比对结果如图10所示。
乳化方法及抗体滴度检测方法如实施例4所述。
检验结果如图9所示，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重组融合蛋白也可以诱导小鼠产生高滴度的抗VEGF165抗体滴度。
实施例6：重组融合蛋白疫苗免疫恒河猴
如实施例4所述方法，将重组VEGF融合蛋白（如SEQ ID NO:1所示）与佐剂Montanide ISA 51 VG乳化，乳化后取0.8ml乳化液注射恒河猴肱二头肌部位皮下，每周注射1次，共注射4次，第4次注射后1周采血，分别进行抗VEGF165抗体滴度检测、抗VEGF165中和抗体检测和抑制血管内皮细胞增殖检测。
猴子血清抗VEGF165抗体滴度检测方法类似实施例4中抗VEGF165抗体滴度，唯一的区别是二抗更换为HRP酶标抗猴子抗体。
猴子血清抗VEGF165抗体滴度检测结果如图11所示，该结果显示抗体滴度超过了106，已经显著超出了已报道VEGF疫苗在猴子体内的抗体滴度（不高于8000）。
抗VEGF165中和抗体检测和抑制血管内皮细胞增殖检测方法与实施例4中所述方法相似。结果如图12所示，该结果显示重组VEGF融合蛋白疫苗可以刺激猴子产生抑制VEGF165与其受体结合并抑制血管内皮细胞增殖的抗体，即打破免疫耐受，诱导产生抗VEGF抗体，抑制血管内皮细胞增殖，从而抑制血管生成，并抑制肿瘤生长。
实施例7：重组融合蛋白疫苗免疫后纯化抗体抑制肿瘤生长
如实施例2和3所述方法制备重组VEGF融合蛋白，制备后组合佐剂免疫家兔，每只家兔每次免疫1mg，免疫四次，四次免疫后1月采集兔子血清，疫苗与佐剂组合方法如实施例4所述。
免疫后兔子血清抗体制备：兔子血清经离心、硫酸铵沉淀、收集沉淀后复融等步骤，获得抗体粗提物，利用protein A填料捕获抗体，利用pH 3.0的柠檬酸缓冲液洗脱收集纯化抗体。
选取横纹肌肉瘤A673细胞在37℃且CO2体积比为5%的环境中培养，其生长培养液成分为90%DMEM+10%FBS。菏瘤环节: 先用PBS洗涤细胞3次，加入胰酶进行消化，待细胞变圆后，加入生长培养液，将细胞吹打重悬，计数并控制细胞密度为4×107个/ml。
选取体重为18～22μg的裸鼠，每只注射4×106个细胞，注射体积为100μl/只小鼠。细胞注射后5天，每只小鼠每周注射1次1mg纯化后抗体（其VEGF抗体活性相当于40μg商业化VEGF单抗药物avastin的活性），并分别以未免疫兔子血清纯化抗体和商业化VEGF单抗药物avastin为对照。每周两次量取荷瘤后小鼠肿瘤大小。
结果如图13所示，VEGF融合蛋白疫苗免疫后抗体可以显著抑制肿瘤生长，并显著延长小鼠生存期（图14）。
对比例1
VEGF121-CRM197和VEGF107-CRM197免疫小鼠的对比
采用实施例2和实施例3的方法分别构建表达并制备了VEGF121-CRM197重组融合蛋白和VEGF107-CRM197重组融合蛋白。分别用制备的VEGF121-CRM197和VEGF107-CRM197重组融合蛋白疫苗免疫小鼠，免疫方式如实施例4中所述。
比较VEGF121-CRM197和VEGF107-CRM197免疫小鼠后的抗体滴度，四次免疫后1个月的结果如图15所示，相对于用VEGF121-CRM197免疫小鼠，截去C端的14个氨基酸残基的VEGF107-CRM197免疫小鼠后，产生的抗VEGF特异性抗体滴度可提高2-3倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海惠盾因泰生物科技有限公司
<120> 一种VEGF-CRM197重组融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
<130> P2021-0031
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val
1 5 10 15
Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr
20 25 30
Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe
35 40 45
Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp
50 55 60
Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln
65 70 75 80
Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser
85 90 95
Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Ala Asp Asp
115 120 125
Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr
130 135 140
His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln
145 150 155 160
Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu
165 170 175
Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp
180 185 190
Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr
195 200 205
Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu
210 215 220
Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu
225 230 235 240
Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser
245 250 255
Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu
260 265 270
Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu
275 280 285
Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu
290 295 300
Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly
305 310 315 320
Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys
325 330 335
Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn
340 345 350
Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys
355 360 365
Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu
370 375 380
Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala
385 390 395 400
Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu
405 410 415
Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro
420 425 430
Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn
435 440 445
Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val
450 455 460
Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala
465 470 475 480
Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His
485 490 495
Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro
500 505 510
Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser
515 520 525
Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile
530 535 540
Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr
545 550 555 560
Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val
565 570 575
Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val
580 585 590
Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His
595 600 605
Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His
610 615 620
Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys
625 630 635 640
Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu
645 650 655
Ile Lys Ser
<210> 2
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val
1 5 10 15
Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr
20 25 30
Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe
35 40 45
Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp
50 55 60
Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln
65 70 75 80
Ile Met Glu Ile Glu Pro Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser
85 90 95
Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Ala Asp Asp
115 120 125
Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu
165 170 175
Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp
180 185 190
Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr
195 200 205
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210 215 220
Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu
225 230 235 240
Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser
245 250 255
Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu
260 265 270
Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu
275 280 285
Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu
290 295 300
Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly
305 310 315 320
Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala
385 390 395 400
Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu
405 410 415
Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro
420 425 430
Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn
435 440 445
Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val
450 455 460
Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala
465 470 475 480
Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His
485 490 495
Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro
500 505 510
Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser
515 520 525
Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile
530 535 540
Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr
545 550 555 560
Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val
565 570 575
Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val
580 585 590
Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His
595 600 605
Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His
610 615 620
Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys
625 630 635 640
Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu
645 650 655
Ile Lys Ser
<210> 3
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
atggcaccaa tggctgaagg cggcggtcaa aatcatcacg aagttgttaa attcatggac 60
gtttaccagc gttcttactg ccatcctatc gaaaccctgg tggatatttt ccaggaatat 120
ccggacgaaa ttgaatatat cttcaagccg tcttgtgtgc cgctgatgcg ttgcggcggt 180
tgttgcaatg acgaaggcct ggaatgtgtt cctaccgaag aatctaacat cactatgcag 240
atcatgcgta tcaaaccgca ccagggtcag cacattggcg aaatgagctt tctgcagcac 300
aataagtgcg aatgccgtcc gaaaggtggt ggcggtagcg gtggtggcgg cagcggtggt 360
ggtggtagca tgggcgctga cgatgtggta gactcttcca aaagcttcgt gatggaaaac 420
ttcagctctt atcacggcac caaaccgggt tatgtggact ccattcagaa aggtatccaa 480
aaaccgaaaa gcggtacgca gggcaattac gatgatgatt ggaaggaatt ttactccacc 540
gacaataaat acgacgcggc gggctatagc gtcgataacg aaaatccgct gtctggcaag 600
gcaggcggtg tggtcaaagt tacctatccg ggcctgacca aggtgctggc cctgaaagtg 660
gataacgctg aaactatcaa aaaggagctg ggcctgtctc tgaccgaacc gctgatggaa 720
caggtaggta ccgaggaatt tatcaaacgt ttcggtgacg gcgcttctcg cgtcgtgctg 780
tctctgccgt tcgcggaagg ttctagctcc gttgaataca ttaacaactg ggagcaggcg 840
aaagcgctgt ccgttgaact ggaaatcaac ttcgagacgc gcggcaaacg tggtcaggat 900
gctatgtacg aatatatggc ccaggcttgt gctggtaacc gtgttcgccg ctctgttggc 960
tcctccctga gctgcatcaa cctggactgg gatgttattc gtgataaaac caaaaccaaa 1020
attgaatctc tgaaggaaca cggtccgatc aagaacaaaa tgtctgaatc tccgaataaa 1080
accgtatctg aagaaaaagc gaaacaatac ctggaagaat ttcaccagac cgcgctggaa 1140
cacccagaac tgtctgaact gaaaaccgta accggcacca acccggtttt cgcgggtgcg 1200
aactacgcag catgggcggt taacgtggca caggtcatcg attccgagac cgctgacaac 1260
ctggaaaaaa ccactgcagc actgtccatc ctgccaggca tcggctccgt gatgggtatt 1320
gccgatggcg cggtgcacca caacaccgag gaaattgtgg cccagagcat cgctctgtcc 1380
tccctgatgg ttgcccaggc gatcccactg gtaggcgaac tggttgacat cggtttcgca 1440
gcctataact tcgtcgaaag cattattaac ctgtttcagg ttgtacataa cagctacaac 1500
cgtccggctt actccccagg ccacaaaacc cagccgttcc tgcacgatgg ctacgcggta 1560
agctggaata ccgtcgaaga ttccattatc cgcacgggct tccagggcga gagcggtcac 1620
gacatcaaga tcaccgctga gaacaccccg ctgccgattg ccggcgttct gctgccgacg 1680
atcccgggca agctggatgt taacaaatcc aaaactcaca tcagcgtaaa cggtcgtaaa 1740
atccgtatgc gttgccgcgc catcgacggc gatgtaacct tctgccgccc gaaatccccg 1800
gtatatgttg gcaacggcgt gcacgcgaac ctgcacgttg ctttccatcg cagcagctcc 1860
gaaaaaattc attccaatga aatcagctct gactctatcg gtgtcctggg ttatcagaaa 1920
accgttgacc acaccaaagt taacagcaaa ctgtccctgt tcttcgaaat taagtcc 1977
<210> 4
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
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aaaccgaaat ccggcactca gggcaactac gacgatgact ggaaagaatt ttacagcacc 540
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gcgatgtacg aatacatggc acaggcatgt gctggtaacc gtgttcgtcg ttctgtgggc 960
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atcgaatctc tgaaggagca cggtccaatt aagaataaga tgtccgaatc cccgaacaaa 1080
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gcgtacaact tcgtagaaag catcatcaac ctgtttcaag ttgttcacaa ttcctataac 1500
cgcccggctt attctccggg tcacaaaacc caaccttttc tgcacgacgg ctatgccgtt 1560
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gatatcaaga tcaccgctga aaatactccg ctgccgatcg cgggcgttct gctgccgact 1680
atcccgggta aactggacgt aaacaagtcc aaaactcaca tcagcgttaa tggtcgcaaa 1740
atccgcatgc gttgtcgtgc catcgacggt gatgtaacct tctgccgccc taaatccccg 1800
gtttacgttg gtaatggcgt tcacgcaaac ctgcatgtcg cttttcaccg ttcctcttcc 1860
gaaaagattc atagcaacga aatctcctct gacagcattg gtgttctggg ttaccagaaa 1920
accgtggacc acaccaaggt aaactctaag ctgagcctgt tcttcgagat caaatct 1977
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
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50 55 60
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Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
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<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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35 40 45
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50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
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Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
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210 215 220
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Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
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Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
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Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
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Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His
405 410 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
435 440 445
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450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
465 470 475 480
Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
485 490 495
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Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser
515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
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<211> 779
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
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130 135 140
Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
145 150 155 160
Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met
165 170 175
Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr
180 185 190
Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln
195 200 205
Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu
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Cys Arg Pro Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe
245 250 255
Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val
260 265 270
Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly
275 280 285
Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr
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Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys
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Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu
325 330 335
Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu
340 345 350
Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile
355 360 365
Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe
370 375 380
Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala
385 390 395 400
Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys
405 410 415
Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly
420 425 430
Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu
435 440 445
Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu
450 455 460
Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr
530 535 540
Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile
545 550 555 560
Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser
565 570 575
Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly
580 585 590
Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile
595 600 605
Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr
610 615 620
Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val
625 630 635 640
Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly
645 650 655
Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro
660 665 670
Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn
675 680 685
Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg
690 695 700
Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro
705 710 715 720
Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His
725 730 735
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740 745 750
Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn
755 760 765
Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
770 775
<210> 10
<211> 2340
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac ggcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgtcggactc agaagtcaat caagaagcta agccagaggt caagccagaa 120
gtcaagcctg agactcacat caatttaaag gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc 180
aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt 240
aaggaaatgg actccttaag attcttgtac gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc 300
cctgaagatt tggacatgga ggataacgat attattgagg ctcacagaga acagattggt 360
ggtgcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat 420
gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac 480
cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgcgtgc ccctgatgcg atgcgggggc 540
tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag 600
attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac 660
aacaaatgtg aatgcagacc aaagggtggc ggtggctctg gtggcggtgg ttccggcggt 720
ggtggctcta tgggcgcaga cgatgttgtt gactcttcta aatcctttgt tatggaaaac 780
ttcagctcct atcacggcac caagccgggt tatgtcgata gcattcagaa aggtatccaa 840
aaaccgaagt ctggcacgca gggtaactac gatgacgatt ggaaggaatt ctacagcacc 900
gacaacaaat atgatgcggc cggttactca gtcgacaacg aaaatccgct gagcggcaag 960
gccggcggtg tggttaaagt gacgtatccg ggcctgacca aggtcctggc cctgaaagtg 1020
gataatgcag aaaccattaa aaaggaactg ggtctgagcc tgacggaacc gctgatggaa 1080
caggttggca ccgaagaatt tatcaaacgc ttcggcgatg gtgccagtcg tgtcgtgctg 1140
tccctgccgt tcgcagaagg tagctctagt gtggaatata ttaacaattg ggaacaagcg 1200
aaggccctgt ccgttgaact ggaaatcaac tttgaaaccc gcggcaaacg tggtcaggat 1260
gcgatgtatg aatacatggc acaagcttgc gcgggtaatc gcgttcgtcg cagcgtcggc 1320
tcctcactgt cttgtatcaa cctggactgg gatgttattc gtgataaaac caagacgaaa 1380
attgaaagtc tgaaggaaca tggcccgatc aagaacaaaa tgagcgaatc tccgaataaa 1440
acggtgtccg aagaaaaggc taaacagtat ctggaagaat tccaccaaac cgcactggaa 1500
catccggaac tgtcagaact gaaaaccgtg acgggtacca acccggtttt tgccggcgca 1560
aattacgcag cttgggctgt gaacgttgcg caagtgattg actcggaaac ggccgataat 1620
ctggaaaaaa ccacggcggc cctgagtatt ctgccgggca tcggttccgt tatgggtatt 1680
gccgacggcg cagtccatca caacaccgaa gaaattgtgg cccagtctat cgcactgtcg 1740
agcctgatgg ttgctcaagc gattccgctg gttggcgaac tggttgatat cggctttgca 1800
gcttacaact tcgtggaaag tatcatcaac ctgtttcagg ttgtccacaa ctcatataat 1860
cgcccggcct actcgccggg tcacaaaacc caaccgttcc tgcatgacgg ctacgcggtt 1920
agctggaata cggtcgaaga ttctattatc cgtaccggct ttcagggtga atctggccac 1980
gacattaaaa tcacggctga aaacaccccg ctgccgattg ccggtgttct gctgccgacc 2040
atcccgggca agctggatgt taataagtca aaaacccata tctcggtcaa cggtcgcaaa 2100
attcgtatgc gctgccgtgc gatcgacggc gatgtgacct tctgtcgtcc gaaaagcccg 2160
gtctatgtgg gcaacggtgt ccatgctaat ctgcacgtgg cgtttcatcg ctctagttcc 2220
gaaaagatcc atagtaacga aatctcatcg gattccattg gtgtgctggg ctaccagaaa 2280
accgtggacc ataccaaagt gaatagtaaa ctgagcctgt tcttcgaaat caaatcctaa 2340
<210> 11
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
atggatgacg cggcaattca acaaacgtta gccaaaatgg gcatcaaaag cagcgatatt 60
cagcccgcgc ccgtagctgg catgaagaca gttctgacta acagcggcgt gttgtacatc 120
accgatgatg gtaaacatat cattcagggg ccaatgtatg acgttagcgg cacggctccg 180
gtcaatgtca ccaataagat gctgttaaag cagttgaatg cgcttgaaaa agagatgatc 240
gtttataaag cgccgcagga aaaacacgtc atcaccgtgt ttactgatat tacctgtggt 300
tactgccaca aactgcatga gcaaatggca gactataacg cgctggggat caccgtgcgt 360
tatcttgctt tcccgcgcca ggggctggac agcgatgcag agaaagaaat gaaagctatc 420
tggtgtgcga aagataaaaa caaagcgttt gatgatgtga tggcaggtaa aagcgtcgca 480
ccagccagct gcgacgtgga tattgccgac cattacgtac ttggcgtcca gcttggcgtt 540
agcggtactc cggcagttgt gctgagcaat ggcacacttg ttccgggtta ccagccgccg 600
aaagagatga aagaattcct cgacgaacac caaaaaatga ccagcggtaa ataa 654
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