一种免疫调节剂的制备方法
阅读说明：本技术 一种免疫调节剂的制备方法 (Preparation method of immunomodulator ) 是由 刘金玲 肖美添 叶静 张娜 李航 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种免疫调节剂的制备方法,采用响应面(RSD)法优化提取工艺,从海带中提取岩藻聚糖,并通过乙醇重沉淀法和Q sepharose fast flow(Q FF)阴离子交换柱层析分离纯化岩藻聚糖,最终得到四个纯度较高的岩藻聚糖组分：SF1、SF2、SF3、SF4。并且评价了岩藻聚糖SF1、SF2、SF3、SF4对RAW 264.7细胞毒性、NO释放、促炎细胞因子分泌以及MAPK信号通路中ERK 1/2、JNK和p38蛋白表达水平的影响。结果表明：SF1显著促进NO释放,抑制促炎细胞因子分泌,上调ERK 1/2、JNK和p38磷酸化水平。以上结果说明SF1有望成为免疫疾病或功能性食品的新型免疫调节剂。(The invention discloses a preparation method of an immunomodulator, which adopts a Response Surface (RSD) method to optimize an extraction process, extracts fucosan from kelp, separates and purifies the fucosan through an ethanol reprecipitation method and Q sepharose fast flow (Q FF) anion exchange column chromatography, and finally obtains four fucosan components with higher purity: SF1, SF2, SF3, SF 4. And the effect of fucoidan SF1, SF2, SF3, SF4 on RAW264.7 cytotoxicity, NO release, pro-inflammatory cytokine secretion and expression levels of ERK 1/2, JNK and p38 proteins in the MAPK signaling pathway were evaluated. The results show that: SF1 significantly promotes NO release, inhibits proinflammatory cytokine secretion, and up-regulates the phosphorylation levels of ERK 1/2, JNK and p 38. The above results indicate that SF1 is expected to be a novel immunomodulator for immune diseases or functional foods.)
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，尤其涉及一种免疫调节剂的制备 方法。
背景技术
免疫系统(固有免疫和适应免疫)具有免疫监视、防御、调控的 作用。先天免疫是第一道防线，它不需要先遇到病原体或者其他外来 物质，就可以立即对入侵者做出反应。除了皮肤和黏膜屏障，单核细 胞、巨噬细胞和中性粒细胞等吞噬细胞也属于先天免疫。免疫是人体 的一种生理功能，机体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而 破坏和排斥进入人体的病原菌、微生物等抗原物质，或机体自身产生 的损伤细胞和肿瘤细胞等，在人类健康中发挥至关重要的作用。调查 显示，心血管疾病、癌症和神经退行性疾病成为威胁人类健康的三大 疾病。现已有研究表明，免疫反应很有可能应用于肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病等重大疾病的治疗。在研究多糖免疫刺激活 性的报道中，大多数研究都涉及巨噬细胞。免疫调节多糖可以增加活 性氧(ROS)、一氧化氮(NO)的产生以及促炎细胞因子的分泌，如 TNF-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、IL-12等。
海洋被认为是一个巨大的潜在药库，从海洋中开发利用活性物质 是当前认识海洋、利用海洋的一个重要内容。其中，海洋褐藻生物量 丰富，含有多糖种类繁多，以褐藻中海带为研究对象所提取制备的水 溶性多糖同样复杂多样。已有研究报道海带中的不同硫酸多糖具有免 疫调节作用。例如，Qiao等发现岩藻聚糖中有较高含量的硫酸盐基 团，并且与巨噬细胞有较高的免疫刺激活性有关。此外，Khilchenko 等研究发现制备的脱乙酰和脱硫酸盐基团的岩藻聚糖几乎丧失了所 有活性，说明同时存在乙酰基和硫酸盐基团对岩藻聚糖的生物活性至 关重要。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了提供一种方便快速的方法从海带中提取分 离具有免疫调节活性的岩藻聚糖。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种免疫调节剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，采用水提法从海带中提取岩藻聚糖粗品，制成多糖溶液；
步骤2，在步骤1制得的多糖溶液加乙醇至体积分数为30％，离 心(10000r/min，20min)，直至上清液澄清透明；
步骤3，将步骤2中得到的上清液，再加乙醇至体积分数为70％， 离心取沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗涤3次；
步骤4，将步骤3洗涤后的沉淀物经冷冻干燥得到岩藻聚糖粗品 (SF)；
步骤5，将步骤4得到的SF通过QFF柱层析分离纯化岩藻聚糖， 采用苯酚-硫酸法测定各管吸光度，以管数对吸光度绘制洗脱曲线。 按洗脱峰分别收集岩藻聚糖组分，并透析至无NaCl，浓缩，冻干。
优选地，其主要组成单糖为岩藻糖，纯化最终得到四个纯度较高 的岩藻聚糖组分：SF1、SF2、SF3、SF4，含岩藻糖分别为43.96％、 40.02％、38.62％和27.83％，硫酸根含量分别为12.05％、15％、23.79％ 和36.94％。
优选地，所述的高纯度岩藻聚糖通过HPLC分析各组分的分子 量，平均分子量分别为225.28kDa、231.72kDa、234.68kDa和 249.68kDa。
优选地，所述的岩藻聚糖组分SF1主要由D-(+)-甘露糖、L-(+)- 鼠李糖、D-(+)-半乳糖、L-(-)-岩藻糖组成，其摩尔比为0.6249∶ 0.0556∶0.8408∶1。
优选地，所述的高纯度岩藻聚糖SF1显著促进RAW 264.7中 NO及细胞因子的分泌，同时，显著上调ERK 1/2、JNK和p38磷 酸化蛋白的表达水平。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本发明中，制备的岩藻聚糖组分SF1显著促进RAW 264.7中 NO及细胞因子的分泌，同时，显著上调ERK 1/2、JNK和p38磷 酸化蛋白的表达水平。以上结果说明SF1有望成为免疫疾病或功能 性食品的新型免疫调节剂。
附图说明
图1为不同岩藻聚糖组分酸水解产物PMP衍生物的HPLC图。
图2为海带岩藻聚糖组分的红外光谱图。
图3为海带岩藻聚糖组分的紫外光谱图。
图4为岩藻聚糖对RAW 264.7细胞细胞毒性的影响。
图5为岩藻聚糖对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的影 响。
图6为不同岩藻聚糖对细胞因子TNF-α分泌的影响。
图7为不同岩藻聚糖对细胞因子IL-1β分泌的影响。
图8为不同岩藻聚糖对细胞因子IL-6分泌的影响。
图9为SF1对RAW264.7细胞中ERK 1/2、JNK和p38蛋白 水平的影响；
图10为SF4对RAW264.7细胞中ERK 1/2、JNK和p38蛋 白水平的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
一种免疫调节剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：称取5g乙醇回流过的海带粉，加入一定体积的蒸馏水， 在一定温度下提取一定时间。提取后，趁热过200目滤布以除去沉 淀，向上清液加入1/4体积的4％氯化钙溶液以去除海带提取液中的 褐藻酸，待杂质沉淀完全后离心(4000r/min，15min)。将去除杂质后的上清液浓缩，再加入95％的乙醇，使溶液中乙醇体积分数为 70％。待沉淀完全，离心(10000r/min，5min)，沉淀并用无水乙醇 洗涤沉淀3次，冷冻干燥，得岩藻聚糖粗品，计算其提取率。
步骤2：采用响应面(RSD)法优化岩藻聚糖提取工艺，考察了 提取温度(60、70、80、90、100℃)、提取时间(1、2、3、4、5、 h)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)对岩藻聚糖率的影响。经优化，水提最佳提取条件为：提取温度90℃、提取时间 4h，液料比40∶1；在最佳条件下，分别进行三次重复实验，得到 岩藻聚糖的提取率为9.38％；
步骤3：岩藻聚糖的纯化:
3.1：乙醇重沉淀法：取适量岩藻聚糖粗品溶于蒸馏水中，加乙 醇至体积分数为30％，重复离心(10000r/min，20min)步骤，直至 上清液澄清透明。收集上清液，再加乙醇至体积分数为70％，离心 取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤3次，洗涤后的沉淀物经冷冻干燥得到岩藻聚糖粗品(SF)。
3.2：Q sepharose fast flow阴离子交换柱层析分离纯化岩藻聚糖 样品:将岩藻聚糖样品配制成浓度为100mg/mL的溶液并过0.45 μm滤膜。实验通过Q FF柱层析分离纯化岩藻聚糖，取100mL Q FF装柱，用蒸馏水平衡5个柱体积后加入0.3mL样品溶液，分别 配制不同浓度的Na Cl溶液对Q FF等度洗脱，流速为2mL/min， 每管4mL。采用苯酚-硫酸法测定各管吸光度，以管数对吸光度绘制 洗脱曲线。按洗脱峰分别收集岩藻聚糖组分，并透析、浓缩、冻干。
采用乙醇重沉淀法和Q FF阴离子交换柱层析对SF进一步纯化， 最终获得四个纯度较高岩藻聚糖组分。对所得组分进行化学成分分 析，包括单糖组成分析、岩藻糖含量、总糖含量、硫酸基含量，以及 分子量分析等，结果如下表1、2。
表1岩藻聚糖粗品SF的理化性质:
表2岩藻聚糖SF1～SF4组分的理化性质：
本发明中，通过HPLC测定岩藻聚糖组分的平均分子量，组分 SF1～SF4的平均分子量分别为225.28kDa、231.72kDa、234.68kDa、 249.68kDa。
本发明中，图1为不同岩藻聚糖组分酸水解产物PMP衍生物的 HPLC图，岩藻聚糖组分的单糖组成摩尔比:SF1主要由D-(+)-甘露 糖、L-(+)-鼠李糖、D-(+)-半乳糖、L-(-)-岩藻糖组成，其摩尔比为 0.6249∶0.0556∶0.8408∶1；SF2主要由D-(+)-甘露糖、L-(+)-鼠李糖、D-(+)-半乳糖、D-(+)-木糖、L-(-)-岩藻糖组成，其摩尔比为0.4962∶0.8136∶0.4747∶0.0460∶1；SF3主要由D-(+)-甘露糖、 L-(+)-鼠李糖、D-(+)-半乳糖、D-(+)-木糖、L-(-)-岩藻糖组成，其摩尔 比为0.2782∶0.6289∶0.5761∶0.0553∶1；SF4主要由D-(+)-甘露 糖、L-(+)-鼠李糖、D-(+)-半乳糖、L-(-)-岩藻糖组成，其摩尔比为 0.7369∶0.6787∶1.7292∶1(摩尔百分比小于1％视为痕迹)。
本发明中，图2为海带岩藻聚糖组分的红外光谱图，通过红外光 谱可知：岩藻聚糖SF及SF1～SF4是硫酸化多糖，硫酸基团的取 代位置主要为轴向C4位置，并且多糖中含有乙酰基。
本发明中，图3通过紫外光谱可知：SF1～SF4中不含有蛋白质 及核酸。
实施例2：
岩藻聚糖SF1对RAW 264.7细胞毒性、NO释放、促炎细胞 因子分泌以及MAPK信号通路中ERK 1/2、JNK和p38蛋白表达 水平的影响。
1、细胞毒性测定
将SF1～SF4用生长培养基稀释为不同浓度。将RAW 264.7细 胞在生长培养基中于37℃培养，然后接种至96孔板(1×104细胞/孔) 中，并在96孔板中分别加入递增浓度的SF1(50-200μg/mL)进行处 理。
孵育24h后，采用MTT法测定细胞存活率：首先除去细胞上清 液，向每个孔中加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)并再温育4h。接 下来，弃去上清液并向细胞培养物中加入100μLDMSO，然后避光摇 动10min直至检测不到可见的颗粒物质。使用酶标仪测定570nm处 的吸光度。SF1对巨噬细胞毒性作用结果如图4所示，在50μg/mL～ 200μg/mL浓度范围内，SF1对巨噬细胞无毒性作用，且具有促进作 用。
2、NO产生量测定(Griess法)
将SF1～SF4用生长培养基稀释为不同浓度。将RAW 264.7细胞 置于48孔板(1×105个细胞/孔)中，于37℃预孵育24h。然后在孔板内 分别加入递增浓度的SF1(50-200μg/ml)进行处理24h。同时，在相 同条件下，用LPS(1μg/mL)和地塞米松(DEM，10ng/mL)处理的细 胞作为对照组。然后，收集细胞培养物上清液并与等体积的Griess 试剂混合，室温下温育30min，酶标仪540nm下测定。结果如图5 所示。
从图5可以看出，空白对照中NO的产生远低于LPS和DEM处 理组，具有显著差异性。同时，不同浓度的SF1处理24h后，NO的 产生呈浓度依赖性，巨噬细胞的NO释放量逐渐增加。实验结果表明 SF1对RAW 264.7细胞具有显著的刺激作用，特别是对于NO的产生 有促进效应。
3.促炎细胞因子含量测定
将SF1～SF4用生长培养基稀释为不同浓度。将RAW 264.7细胞 置于6孔板(1×105个细胞/孔)中，于37℃预孵育24h。然后在孔板内 分别加入递增浓度的SF1(50-200μg/ml)进行处理24h。同时，在相 同条件下，用LPS(1μg/mL)处理的细胞作为对照组。然后，收集细胞 培养物上清液，使用试剂盒测定TNF-α，IL-1β，IL-6的含量。结果 如图6-8所示。
从图6-8可以看出，空白对照中TNF-α，IL-1β，IL-6的产生远低 于LPS处理组，具有显著差异性。同时，不同浓度的SF1处理24h 后，巨噬细胞的TNF-α，IL-1β，IL-6释放量逐渐增加。实验结果表 明SF1能促进RAW 264.7细胞分泌TNF-α，IL-1β，IL-6。
4.MAPK信号通路中ERK 1/2、JNK和p38蛋白表达水平的测 定
将SF1～SF4用生长培养基稀释为不同浓度。将RAW 264.7细胞 置于6孔板(1×105个细胞/孔)中，于37℃预孵育24h。然后在孔板内 分别加入递增浓度的SF1(50-200μg/ml)进行处理24h。同时，在相 同条件下，用LPS(1μg/mL)处理的细胞作为对照组。然后，收集细胞， 制备细胞裂解物，测定其中ERK 1/2、JNK和p38及磷酸化ERK 1/2、 JNK和p38蛋白的浓度。结果如图9所示。
从图9可以看出，LPS(1μg/mL)显著促进RAW264.7细胞中 ERK 1/2、JNK、p38磷酸化水平，然而，非磷酸化ERK 1/2、JNK、 p38蛋白水平的表达不受LPS或者LPS和SF1组合的影响。随着SF1 浓度的提升，p-ERK 1/2、p-JNK及p-p38均呈剂量依赖性增长，说明 SF1可以通过刺激巨噬细胞中MAPK途径调节免疫应答。以上结果 说明SF1有望成为免疫疾病或功能性食品的新型免疫调节剂。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范 围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技 术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改 变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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