新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用 (Novel aggregation-induced emission Golgi fluorescence probe and preparation method and application thereof ) 是由 王东 肖培宏 马可 唐本忠 于 2021-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用,荧光探针的化学结构通式为：本发明的荧光探针分子为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光高尔基体荧光探针,该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体,以噻吩环及双建为π共轭桥,氰基结构单元作为电子受体,苯磺酰胺作为高尔基体靶向基团来构建具有聚集诱导发光性质的新型高尔基体荧光探针,合成路线简单,成本低；聚集诱导发光荧光探针通过苯磺酰胺基团与高尔基体上的环氧化酶结合实现高尔基体靶向,细胞毒性小,光稳定性高,高尔基体定位特异性好,可用于活细胞实时动态高分辨荧光成像。(The invention discloses a novel aggregation-induced emission Golgi fluorescence probe and a preparation method and application thereof, wherein the general chemical structure of the fluorescence probe is as follows: the fluorescent probe molecule is an aggregation-induced emission Golgi fluorescent probe with a novel D-pi-A structure, and the fluorescent probe takes different substituted triphenylamine structural units as electron donors in a molecular system, takes a thiophene ring and double construction as a pi conjugate bridge, takes a cyano structural unit as an electron acceptor, and takes benzenesulfonamide as a Golgi targeting group to construct a fluorescent probe with aggregation-induced emissionThe novel Golgi fluorescent probe has the advantages of simple synthetic route and low cost; the aggregation-induced emission fluorescent probe realizes Golgi body targeting by combining a benzene sulfonamide group with cyclooxygenase on the Golgi body, has small cytotoxicity, high light stability and good Golgi body positioning specificity, and can be used for real-time dynamic high-resolution fluorescent imaging of living cells.)
技术领域
本发明涉及荧光分子探针技术领域，具体涉及新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
高尔基体(Golgi apparatus)，又称为高尔基复合体，是由光面膜组成的囊泡系统，包括扁平囊泡(saccules)、大囊泡(vacuoles)、小囊泡(vesicles)三个基本成分。高尔基体作为真核细胞中非常重要的亚细胞器，在酶的激活、囊泡转运、分泌蛋白的加工、溶酶体的降解和细胞极化等方面发挥着关键的作用。研究表明高尔基结构和功能的紊乱是导致神经退行性疾病(如阿尔兹海默症、帕金森症)发生的重要原因。因此，研究高尔基体的形态和功能，对于揭示与高尔基体相关的疾病的发生发展、药物筛选、疾病诊断、监测治疗等起着至关重要的作用。
近年来，基于有机小分子探针的荧光成像技术具有灵敏性高、选择性好等优势，为生命科学的研究和疾病诊断提供了一种可视化手段，在生物成像领域取得了广泛应用。目前商用高尔基体荧光探针主要是Golgi-Tracker Red和Golgi-Tracker Green，这些探针存在合成步骤复杂、价格昂贵、高尔基体定位特异性不高，在细胞质中容易团聚和发生荧光淬灭等问题。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用，旨在解决现有高尔基体荧光探针合成步骤复杂、价格昂贵、高尔基体定位特异性不高，在细胞质中容易团聚和发生荧光淬灭的问题。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针，其中，所述荧光探针的化学结构通式为：
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针，其中，所述荧光探针的化学结构通式中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。
一种所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，包括：
将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，得到反应溶液；其中，所述化合物A的化学结构通式为：
对所述反应溶液进行萃取并合并有机相后，进行干燥及减压浓缩处理，得到粗产物；
以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物进行纯化，得到新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，所述搅拌回流的温度为70～90℃，所述搅拌回流的时间为11～13h。
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，化合物A与4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯的质量比为1.3～1.4：1。
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，所述混合溶液中四氢呋喃与水的体积比为3～5：1。
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，碳酸钾与四三苯基膦钯的质量比为4.5～5：1。
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，所述对所述反应溶液进行萃取并合并有机相后，进行干燥及减压浓缩处理，得到粗产物的步骤包括：
利用二氯甲烷对反应溶液进行萃取，并对萃取后的反应溶液中的有机相进行合并；
使用无水硫酸钠对合并有机相后的反应溶液进行干燥，并对干燥后的反应溶液进行减压浓缩处理，得到粗产物。
所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，其中，所述洗脱剂中石油醚与乙酸乙酯的体积比为100:1～20：1。
一种所述的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针在高尔基体检测中的应用。
有益效果：本发明的荧光探针分子为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光高尔基体荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体，以噻吩环及双建为π共轭桥，氰基结构单元作为电子受体，苯磺酰胺作为高尔基体靶向基团来构建具有聚集诱导发光性质的新型高尔基体荧光探针，合成路线简单，成本低；聚集诱导发光荧光探针通过苯磺酰胺基团与高尔基体上的环氧化酶结合实现高尔基体靶向，细胞毒性小，光稳定性高，高尔基体定位特异性好，可用于活细胞实时动态高分辨荧光成像。
附图说明
图1是本发明实施例提供的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的合成路线图；
图2是本发明实施例提供的聚集荧光淬灭高尔基体荧光探针的合成路线图；
图3是本发明实施例1中制备的荧光探针AIE-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图；
图4是本发明实施例1中制备的荧光探针AIE-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱图；
图5是本发明实施例2中制备的荧光探针ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图；
图6是本发明实施例2中制备的荧光探针ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱图；
图7是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱图；
图8是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi固体的荧光发射光谱图；
图9是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的荧光发射光谱图；
图10是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的最大荧光强度I/I0值图；
图11是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业高尔基体探针(Golgi-Tracker Red)在Hela细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像图；
图12是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业线粒体探针(Mito-Tracker Red)在Hela细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像图；
图13是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi对Hela细胞的毒性实验图；
图14是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业高尔基体探针(Golgi-Tracker Red)在Hela细胞中的光稳定性实验图。
具体实施方式
本发明提供一种新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
高尔基体作为真核细胞中非常重要的亚细胞器，在酶的激活、囊泡转运、分泌蛋白的加工、溶酶体的降解和细胞极化等方面发挥着关键的作用。参与肿瘤转移的多种调控蛋白在高尔基体中进行加工修饰，并通过高尔基体调节囊泡的运输，转运到特定的细胞部位。此外，研究表明高尔基结构和功能的紊乱是导致神经退行性疾病(如阿尔兹海默症、帕金森症)发生的重要原因。因此，研究高尔基体的形态和功能，对于揭示与高尔基体相关的疾病的发生发展、药物筛选、疾病诊断、监测治疗等起着至关重要的作用。
目前商用高尔基体荧光探针主要是Golgi-Tracker Red和Golgi-Tracker Green，这些探针存在合成步骤复杂、价格昂贵、高尔基体定位特异性不高，在细胞质中容易团聚和发生荧光淬灭等问题。2001年，香港科技大学唐本忠院士首次提出“聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)”的新概念，引发了发光材料的革命。不同于传统的有机荧光染料，聚集诱导发光材料在溶液中不发光或者发很弱的荧光，但在聚集状态下发出强烈的荧光，发光效率高，斯托克斯位移大，光稳定性好，检测背景低，并且在检测过程中可以实现荧光从无到有的显著变化，在长时生物示踪、活体成像、脑部血管3D成像和光声、光动力治疗等方面具有更广泛的应用。因此，开发高尔基靶向的聚集诱导发光诊断一体化探针分子，对完善聚集诱导发光分子设计理论，揭示高尔基体相关疾病的发病机制，推动高尔基体相关疾病的早期诊断和后期治疗具有非常重要的研究意义。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了一种新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针，其中，所述荧光探针的化学结构通式为：其中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。由上述荧光探针的化学结构通式可以看出，本发明实施例提供的荧光探针为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光高尔基体荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体(D,Donor)及转子，以噻吩环及双键为π共轭桥(π-bridge)，氨基结构单元作为电子受体(A,Acceptor)，苯磺酰胺作为高尔基体靶向基团。不同于商用高尔基体荧光探针，本发明实施例提供的聚集诱导发光高尔基体荧光探针通过苯磺酰胺基团与高尔基体上的环氧化酶(COX-2)结合实现高尔基体靶向，具有细胞毒性小、光稳定性高、高尔基体定位特异性好等显著优势。
本发明还提供了一种上述新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的制备方法，包括步骤：
S1、将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，得到反应溶液。
考虑到现有商用高尔基体荧光探针合成步骤繁琐、价格昂贵、高尔基体定位特异性不高，在细胞质中容易团聚和发生荧光淬灭，而聚集诱导发光材料普遍发光效率高，斯托克斯位移大，光稳定性好，检测背景低，并且在检测过程中可以实现荧光从无到有的显著变化。本实施例中以化合物A和4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯为原料制备聚集诱导发光高尔基体荧光探针，其中，化合物A的化学结构通式为：
其中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。由上述化合物A的化学结构通式可以看出，化合物A中不同取代的三苯胺结构单元可以作为分子体系中的电子给体(D,Donor)及转子，化合物A中噻吩环及双建可以作为分子体系中的π共轭桥(π-bridge)，化合物A中氰基结构单元可以作为电子受体(A,Acceptor)，4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯中的苯磺酰胺可以作为高尔基体靶向基团，从而合成具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
如图1所示，为本发明实施例中新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针的合成路线图，本实施例中首先将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，在搅拌回流过程中，化合物A和4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯在碳酸钾与四三苯基膦钯的催化作用下发生反应，化合物A脱去卤素基团，4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯脱去硼酸频哪醇酯基团，得到反应溶液，其中，所述反应溶液中含有聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
在一具体实施方式中，所述搅拌回流的温度为70～90℃，所述搅拌回流的时间为11～13h，化合物A与4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯的质量比为1.3～1.4：1，混合溶液中四氢呋喃与水的体积比为3～5：1，碳酸钾与四三苯基膦钯的质量比为4.5～5：1，在此反应条件和反应物比例下能够制备出性能稳定的聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
S2、对所述反应溶液进行萃取并合并有机相后，进行干燥及减压浓缩处理，得到粗产物。
考虑到搅拌回流结束后得到的反应溶液中含有溶剂、催化剂等，本实施例中反应完成后，首先利用二氯甲烷对反应溶液进行萃取，并对萃取后的反应溶液中的有机相进行合并，然后使用无水硫酸钠对合并有机相后的反应溶液进行干燥，并对干燥后的反应溶液进行减压浓缩处理，得到粗产物。
S3、以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物进行纯化，得到新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
考虑到粗产物中除了反应生成的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针外，还含有萃取无法去除的杂质物如反应原料等，本实施例中获得粗产物后，以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物进行纯化，得到纯净的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针。其中，所述洗脱剂中石油醚与乙酸乙酯的体积比为100:1～20：1。
本发明还提供一种上述所述新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针在高尔基体检测中的应用。本发明制备出的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针通过苯磺酰胺基团与高尔基体上的环氧化酶(COX-2)结合实现高尔基体靶向，具有细胞毒性小、光稳定性高、高尔基体定位特异性好等显著优势，对揭示高尔基体相关疾病的发病机制，推动高尔基体相关疾病的早期诊断和后期治疗具有非常重要的研究意义。
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1
如图1所示，在N2的保护下，将100mg化合物A、75mg 4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、122mg碳酸钾与25mg四三苯基膦钯依次加入4mL四氢呋喃和1ml水的混合溶液中，在80℃下搅拌回流12h，待反应完全后通过二氯甲烷萃取反应溶液，合并萃取后的反应溶液中的有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到粗产物；以石油醚/乙酸乙酯(100:1→20:1)作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对粗产物进行纯化，得到85mg黄色固体粉末状产物，即新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针(AIE-Golgi)，其中，AIE-Golgi的产率为73％。
实施例2
如图2所示，在N2的保护下，将60mg化合物B、50mg 4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、82mg碳酸钾与17mg四三苯基膦钯依次加入4mL四氢呋喃和1ml水的混合溶液中，在80℃下搅拌回流12h，待反应完全后通过二氯甲烷萃取反应溶液，合并萃取后的反应溶液中的有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到粗产物；以二氯甲烷/甲醇(100:1→20:1)作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对粗产物进行纯化，得到66mg黄色固体粉末状产物，即聚集荧光淬灭高尔基体荧光探针(ACQ-Golgi)，其中，ACQ-Golgi的产率为92％。
实施例3
将Hela细胞接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中，培养24小时，将1uM商业高尔基体探针(Golgi-Tracker Red)与细胞在培养基中于37℃孵育30分钟，然后分别将实施例1和实施例2中制备的AIE-Golgi和ACQ-Golgi加入培养基中于37℃孵育30分钟，孵育后细胞用PBS生理盐水洗涤三次，随后加入1ml无血清的培养基待成像用。荧光成像通过CLSM,ZEISS-LSM880共聚焦激光扫描显微镜观察。通过405nm蓝紫色泵浦激光器激发，收集450-640nm波段的探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi的荧光，通过633nm橙红色泵浦激光器激发，收集640-740nm波段的商业高尔基体探针的荧光，使用100x油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
图3和图4为本发明实施例1制备的荧光探针AIE-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图，图5和图6为本发明实施例2制备的荧光探针ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图。从图3～图6可以看出本发明实施例1和实施例2制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi的分子结构。
图7为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱图，图8为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi固体的荧光发射光谱图，图9为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的荧光发射光谱图。从图7～图9可以看出，，本发明实施例1制备的AIE-Golgi的最大吸收峰在420nm左右，发光峰在560nm左右，本发明实施例2制备的ACQ-Golgi的最大吸收峰在390nm左右，发光峰在535nm左右，且当混合溶剂体积比达到80％以上时，荧光发射光强明显增强。
图10为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的最大荧光强度I/I0值图，从图10可以看出，荧光探针AIE-Golgi为聚集诱导发光的探针分子，荧光探针ACQ-Golgi为聚集荧光淬灭的探针分子。
图11为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业高尔基体探针(Golgi-Tracker Red)在Hela细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像图，从图11可以看出，荧光探针AIE-Golgi与商业高尔基体探针共定位的皮尔逊系数为0.92，荧光探针ACQ-Golgi与商业高尔基体探针共定位的皮尔逊系数为0.91。
图12为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业线粒体探针(Mito-Tracker Red)在Hela细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像图，从图12可以看出，探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业线粒体探针(Mito-Tracker Red)共定位系数较低，表明AIE-Golgi和ACQ-Golgi探针高尔基体特异性较高。
图13为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi对Hela细胞的毒性实验图，从图13可以看出，AIE-Golgi探针比ACQ-Golgi具有更低的细胞毒性。
图14为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-Golgi和ACQ-Golgi与商业高尔基体探针(Golgi-Tracker Red)在Hela细胞中的光稳定性实验图，从图14可以看出AIE-Golgi探针比ACQ-Golgi探针和商业高尔基体探针(Golgi-Tracker Red)具有更好的光稳定性。
综上所述，本发明公开了一种新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针及其制备方法与应用，荧光探针的化学结构通式为：本发明的荧光探针分子为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光高尔基体荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体，以噻吩环及双建为π共轭桥，氰基结构单元作为电子受体，苯磺酰胺作为高尔基体靶向基团来构建具有聚集诱导发光性质的新型高尔基体荧光探针，合成路线简单，成本低；聚集诱导发光荧光探针通过苯磺酰胺基团与高尔基体上的环氧化酶结合实现高尔基体靶向，细胞毒性小，光稳定性高，高尔基体定位特异性好，可用于活细胞实时动态高分辨荧光成像。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。