连接核酸与蛋白或肽的方法
阅读说明：本技术 连接核酸与蛋白或肽的方法 (Method for linking nucleic acids to proteins or peptides ) 是由 门冬 张先恩 周昆 曹姗姗 周娟 于 2021-02-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种连接核酸与蛋白或肽的方法,涉及生物交联的技术领域。上述连接核酸与蛋白或肽的方法,包括以下步骤：(1)目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶形成融合蛋白；(2)融合蛋白中的DNA拓扑异构酶催化共价连接目标核酸。本发明利用DNA拓扑异构酶能够识别、剪切和连接特定的目标核酸序列的性质,实现了稳定、高效、定点、定向共价连接目标核酸与目标蛋白或肽,而且不影响蛋白及核酸的结构或性能。(The invention provides a method for connecting nucleic acid and protein or peptide, and relates to the technical field of biological crosslinking. The method for linking a nucleic acid to a protein or peptide as described above, comprising the steps of: (1) the target protein or peptide forms a fusion protein with the DNA topoisomerase; (2) the DNA topoisomerase in the fusion protein catalyzes covalent attachment of the target nucleic acid. The invention realizes stable, efficient, fixed-point and directional covalent connection of target nucleic acid and target protein or peptide by utilizing the property that DNA topoisomerase can recognize, cut and connect a specific target nucleic acid sequence, and does not influence the structures or performances of the protein and the nucleic acid.)
技术领域
本发明涉及涉及生物交联的技术领域，具体涉及基于DNA拓扑异构酶催化的核酸与蛋白或肽的定点共价连接，以及蛋白核酸复合物。
背景技术
蛋白质作为所有生命活动的承担者，功能多种多样，例如转运蛋白运输货物，细胞表面蛋白受体接收并传递信号，蛋白酶催化一系列生化反应等。而以核酸结构为指导，可以构建出结构精密、功能多样的核酸-蛋白复合物。目前核酸与蛋白的连接方法按连接形式分为非共价结合以及共价结合。现有的非共价结合方法主要有：亲和素(或链霉亲和素)与生物素的作用，通过在蛋白上修饰生物素(或融合亲和素)与偶联亲和素(修饰生物素)的核酸相互作用，来实现蛋白核酸连接；金属离子与蛋白识别结构域的结合，如镍离子与聚组氨酸的结合，通过在蛋白上融合寡聚组氨酸，核酸上修饰nitrilotriacetic acid(NTA)，在聚组氨酸-镍离子-NTA的螯合下，实现蛋白核酸连接；抗原抗体的亲和以及蛋白的核酸适配体也是重要的非共价结合手段。目前共价结合主要通过化学交联，如利用蛋白表面的氨基与烷硫基(Alkylthiol)修饰的核酸在交联剂(如sSMCC)的作用下形成共价结合；通过在蛋白上修饰MKHKGS短肽以及核酸上修饰Z-QG(N-carbobenzyloxy glutaminyl glycine)，在谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)的作用下产生共价结合。
目前存在的核酸蛋白结合方法中，非共价结合亲和力低、受环境影响大。而共价结合技术中，修饰过程易造成蛋白变性、蛋白与核酸交联随机性大。因此，目前蛋白核酸连接技术有待发展，急需要一种稳定、高效、反应条件温和的共价定点连接技术。
发明内容
有鉴于此，本发明致力于提供一种连接核酸与蛋白或肽的方法，利用DNA拓扑异构酶能够识别、剪切和连接特定目标核酸序列的性质，实现了稳定、高效、定点、定向共价连接目标核酸与目标蛋白或肽，而且不影响蛋白及核酸的结构或性能。
本发明第一方面提供了一种连接核酸与蛋白或肽的方法，包括以下步骤：
(1)目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶形成融合蛋白；
(2)融合蛋白中的DNA拓扑异构酶催化共价连接目标核酸。
DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体互相转变的酶的总称，是普遍存在的核酶(nuclear enzymes)，其主要作用是释放DNA的超螺旋和扭转张力来促进DNA复制、转录、重组和染色质重塑，通过在DNA上产生一个暂时的单链或者双链缺口，同时在酶活性位点的酪氨酸与断裂链的一端产生一个暂时的磷酸二酯键来催化DNA链的断裂和结合。DNA拓扑异构酶可以分成两类：Type I:类型一的酶功能上为剪切引入暂时单链DNA缺口。Type II：类型二的酶功能上为剪切引入暂时双链DNA缺口。
本发明的发明人发现，虽然目前连接蛋白和核酸的技术手段众多，但并没有现有技术提出使用DNA拓扑异构酶催化连接蛋白和核酸。本发明利用DNA拓扑异构酶在催化DNA链的断裂和结合方面的性质，将DNA拓扑异构酶先与目标蛋白或肽组装成融合蛋白，再利用融合蛋白中的DNA拓扑异构酶催化共价连接目标核酸，实现了稳定、高效、定点、定向共价连接目标核酸与目标蛋白或肽。
示例性地，所述目标肽可为有生物活性多肽或人工合成多肽等。例如，细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其它药用小肽以及诊断用多肽等。其中，活性肽又可为免疫活性肽、神经活性肽、胆固醇肽、促进矿物质吸收的肽(CPPS)、酶调节剂(如促胰酶肽)、激素肽如生长激素释放因子(GRFS)、白蛋白胰岛素增效肽、抗菌多肽(如乳酸链球菌素、橡胶素)、抗癌多肽(如肿瘤细胞坏死因子、环已肽)、抗艾滋病肽(如GLQ蛋白)等。
示例性地，所述的目标蛋白可为单体蛋白、寡聚蛋白、多聚蛋白等。按其来源可为动物蛋白、植物蛋白或人工合成蛋白等。所述目标肽可为有生物活性多肽或人工合成多肽等。本发明中，对目标蛋白或肽不作具体限定，可以根据实际需要进行选择。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶直接连接或通过柔性连接肽连接；更优选通过柔性连接肽连接。
需要说明的是，本发明中所述目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶的连接也可通过现有技术中的其他方式进行连接，如通过化学修饰连接，或非共价结合等。
在本发明的一个
具体实施方式
中，所述目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶通过柔性连接肽连接。
所述柔性连接肽的序列可依据目标肽或蛋白进行选择。柔性连接肽的序列，例如可为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG、GGGGSGGGSGG等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述柔性连接肽的序列为GGGGS。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述DNA拓扑异构酶选自Type I拓扑异构酶中的topoI、topoIII、topo V、Reverse gyrase；和/或；所述DNA拓扑异构酶选自TypeII拓扑异构酶中的TopoII、Topo VI、topoIV、DNA旋转酶。
Type I拓扑异构酶为单体酶，分为IA，IB两亚型，含有topoI、topoIII、topo V、Reverse gyrase等。根据结构域功能可以划分为4个域：C端结构域、核心结构域、连接子区域和N端域，其中C端结构域、核心结构域、在催化活性中起主要作用。
topoI酶最初被称为ω蛋白，在原核以及真核中均存在。细菌的topoI酶属于typeIA，仅能释放负螺旋的DNA超结构。真核生物的topoI酶属于type IB，正负的DNA超螺旋均能释放，本发明中优选使用属于type IBtopoI酶。topoI酶有4个关键功能活性位点：Arg488，Arg590，His632和Tyr723。Arg488，Arg590，His632位于核心结构域，Tyr723位于C端结构域。
topoIII酶属于type IA的酶，可以释放和恢复DNA超螺旋，还对RNA分子有着相同的功能。TopoIII进化中高度保守，在原核真核古菌中均存在。
Topo V酶由于其与真核topoI酶类似被划分为type IB，且能释放正负的DNA超螺旋。
Reverse gyrase，反向旋转酶，type IA类，在嗜热古菌和真细菌中存在。该酶可以释放负DNA超螺旋，且可以消耗ATP来给DNA引入正超螺旋。
同属于Type I拓扑异构酶topoI、topoIII、topo V、Reverse gyrase具有类似的结构和功能，识别和剪切连接的核酸序列类似。
Type II拓扑异构酶在真核原核中均有发现，分为TypeIIA、TypeIIB两种亚型，包含TopoII、Topo VI、topoIV、DNA旋转酶。根据结构域功能可以划分为C端域、N端域以及中部功能域，C端域在其对DNA构象识别方面起主要作用，N端域和中部功能域则为其主要活性域。
TopoII酶，属于type IIA，真核生物中发现，可以释放正负DNA超螺旋，依赖ATP，Mg离子。
Topo VI酶，属于type IIB，所有古菌中存在，且在一些植物和寄生性疟原虫中发现。
topoIV酶，属于type IIA，细菌中发现，可释放正负DNA超螺旋，需消耗ATP。
DNA旋转酶，DNA gyrase，属于type IIA，其特殊之处是可以在共价闭合双链DNA上引入负超螺旋，需消耗ATP，也可以释放正DNA超螺旋。
同属于Type II拓扑异构酶TopoII、Topo VI、topoIV、DNA旋转酶具有类似的结构和功能，识别和剪切连接的核酸序列类似。
在本发明的一个具体实施方式中，所述DNA拓扑异构酶选自Type I中的IB亚型，优选topoI。
在本发明的一个具体实施方式中，topoI优选属于type IB中的真核生物的topoI酶。
在本发明的一个具体实施方式中，topoI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或其同源序列。
示例性地，所述同源序列与原序列的同源性约80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
在本发明的一个具体实施方式中，编码topoI的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或其简并序列。
示例性地，所述简并序列与原序列的同源性约80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述topoI识别的核酸序列为5’-n-CCCTT-n-3’，其中n代表零个、一个或多个碱基；优选地，所述n为0-30个碱基。
示例性地，所述n为0-30个核苷酸碱基，例如n可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸碱基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标核酸为双链，其中一条链中包含topoI识别的核酸序列5’-CCCTT-3’。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标核酸为5’-CGTGTCGCCCTTATTCCCATAGTGACTACAGC-3’(SEQ ID NO.3)，其中横线部分为topoI识别的核酸序列。
本发明第二方面提供了一种蛋白核酸复合物，采用上述的连接核酸与蛋白或肽方法获得。
进一步，所述目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶直接连接或通过柔性连接肽连接；更优选通过柔性连接肽连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标蛋白为链球菌G蛋白、荧光蛋白Venus、丙酮酸氧化酶、磷酸乙酰转移酶中的一种。
蛋白核酸复合物可以应用于蛋白类药物的靶向运输。
示例性地，蛋白类药物作为生物大分子不易进入肿瘤细胞，并且在体内循环过程中较易被生物降解。DNA结构可被用作蛋白类生物大分子的运输载体，例如将DNA结构和蛋白类药物制备成蛋白核酸药物复合物，具有结构可设计，尺寸可控，位点精确定位，生物相容性好，无明显细胞毒性，易于功能化修饰等优势，用以实现对蛋白类药物的靶向运输和可控释放，具有重大的理论和实际意义。
蛋白核酸复合物可以同时具备基因编辑和基因沉默的功能。
示例性地，蛋白核酸复合物中连接的双链核酸序列，其两条单链核酸分别具有基因编辑和基因沉默的功能，则获得的核酸复合物能够同时发挥基因编辑和基因沉默的功能，与传统的独立的基因编辑和基因沉默系统相比，此种核酸复合物能够很好地将基因编辑和基因沉默功能相结合，实现协同的基因治疗效果。
蛋白核酸复合物不会影响或增强目标蛋白的功能。
示例性地，荧光蛋白与目标核酸形成复合物后，经过检测发现其显示的荧光强度不变或者荧光强度增强。某蛋白酶与目标核酸形成复合物后，蛋白酶的活性不受影响或酶活力增强。
在本发明的一个具体实施方式中，蛋白核酸复合物的制备方法，包括以下步骤：通过基因重组将目标蛋白或肽与DNA拓扑异构酶融合形成融合蛋白，并将所述融合蛋白与目标核酸混合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法还包括在融合蛋白与目标核酸相混合的混合物中加入金属离子，例如镁离子、钙离子、锰离子等，优选镁离子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述蛋白核酸复合物的制备方法包括：
(1)融合蛋白的克隆：通过分子克隆将目标蛋白基因与topoI酶基因融合形成融合蛋白的基因；(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白的基因克隆入表达载体，并将构建的表达载体转化到宿主细胞表达株中进行诱导表达，即获得融合蛋白；(3)将融合蛋白与目标核酸混合，加入镁离子，37度反应30min，即可获得核酸共价连接的蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，SPG蛋白-目标核酸复合物的制备方法包括以下步骤：
(1)融合蛋白的克隆：通过分子克隆将SPG蛋白基因与topoI酶基因融合形成融合蛋白的基因；
(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白的基因克隆入表达载体，并将构建的表达载体转化到宿主细胞表达株中进行诱导表达，即获得融合蛋白；
(3)将融合蛋白与目标核酸(SEQ ID NO.3)混合，加入终浓度为1mM的镁离子，37度反应30min，即可获得核酸共价连接的蛋白。
本发明第三方面提供了DNA拓扑异构酶在目标蛋白或肽与目标核酸连接中的用途。
进一步，所述DNA拓扑异构酶选自Type I拓扑异构酶中的topoI、topoIII、topo V、Reverse gyrase，和/或；所述DNA拓扑异构酶选自Type II拓扑异构酶中的TopoII、TopoVI、topoIV、DNA旋转酶。
在本发明的一个具体实施方式中，所述DNA拓扑异构酶选自Type I中的IB亚型，优选topoI。
本发明第五方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括目标蛋白或肽和DNA拓扑异构酶。
示例性地，所述目标蛋白或肽与所述DNA拓扑异构酶直接连接或通过柔性连接肽连接；更优选通过柔性连接肽连接。
示例性地，所述DNA拓扑异构酶选自Type I中的IB亚型，优选topoI。
进一步，所述topoI识别的核酸序列为5’-n-CCCTT-n-3’，其中n代表一个或多个核苷酸碱基；优选地，所述n为0-30个核苷酸碱基。
融合蛋白作为制备蛋白核酸复合物的中间产物，融合蛋白不仅会保留目标蛋白与DNA拓扑异构酶两者的功能，而且可能会增强目标蛋白的功能。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种连接核酸与蛋白或肽的方法，利用DNA拓扑异构酶能够识别和剪切特定的目标核酸序列，并且能与剪切后的目标核酸共价连接的性质，实现了稳定、高效、定点、定向共价连接目标核酸与目标蛋白或肽，而且不影响蛋白及核酸的结构或性能。
(2)本发明中利用topoI拓扑异构酶能够识别和剪切具有5’-n-CCCTT-n-3’特定的双链目标核酸序列，能够使目标蛋白同时结合具有不同功能的核酸序列，使获得的蛋白核酸复合物具有更多的功能。
(3)本发明提供了蛋白核酸复合物及其制备方法，通过DNA拓扑异构酶催化连接的方式获得，反应步骤简单，反应条件温和，耗时短，无需引入任何化学试剂，只需加入金属离子在指定温度下反应即可，适合产业化推广。
附图说明
图1所示为本发明topoI催化共价连接目标核酸与目标蛋白的原理示意图。其中，POI表示目标蛋白；topoIB表示topoI拓扑异构酶。
图2所示为融合蛋白SPG-topoI和SPG-topoI-核酸复合物的电泳结果图。其中，泳道1为融合蛋白SPG-topoI对照；泳道2为SPG-topoI-核酸复合物。
图3所示为验证蛋白核酸复合物TopoⅠ-SPG-核酸和融合蛋白SPG-topoⅠ结合抗体IgG的结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
术语“拓扑异构酶”包括其相关突变体或者拓扑异构酶的部分结构域，所述突变体或部分结构域仍然具有拓扑异构酶的功能，能够催化蛋白与核酸进行连接。例如，“topoI”包括其相关突变体或者拓扑异构酶的部分结构域。
术语“目标蛋白”可为任意的蛋白，可根据需要进行选择。
术语“目标核酸”可为任意的核酸序列，只需包含topoI识别的核酸序列5’-CCCTT-3’，对于核酸序列的长度不作具体限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
本发明中topoI拓扑异构酶催化共价连接目标核酸与目标蛋白的原理如图1所示。
实施例1 SPG与topoI蛋白的融合、表达
本实施例中以SPG，(链球菌G蛋白，Streptococcus Protein G)作为目标蛋白，将其与topoI拓扑异构酶进行融合与表达。
(1)融合蛋白的克隆：人工合成SPG与topoI的核苷酸序列。SPG的核酸序列如SEQID NO.4所示，topoI的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本实施例中SPG与topoI拓扑异构酶通过柔性连接肽GGGGS连接而形成融合蛋白，简称为SPG-topoI，其中，融合蛋白SPG-topoI的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白SPG-topoI的基因克隆入表达载体PET32a(蛋白可在多种表达载体和表达宿主中良好表达，这里仅描述在大肠杆菌中的表达并利用镍亲和层析柱纯化)。将构建的表达载体转化到大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，挑取阳性克隆。将挑取的阳性克隆转接到LB培养基，37℃、振荡培养至对数生长期(OD值约为0.5)。向培养物中加入工作终浓度为1mM的IPTG，25℃、振荡培养诱导蛋白表达8小时。Ni亲和层析纯化目标蛋白，即获得纯化的融合蛋白SPG-topoI。
实施例2 SPG与核酸形成的复合物的制备
(1)SEQ ID NO.6：CGTGTCGCCCTTATTCCCATAGTGACTACAGC与SEQ ID NO.7：GAATAAGGGCGACACG所示的目标核苷酸序列1：1相混合，退火形成双链，退火程序为80度，5分钟；55度5分钟；37度3分钟；得到双链的识别序列；
(2)将实施例1中纯化所得融合蛋白SPG-topoI与上述得到的双链相混合，加入终浓度为1mM的镁离子，于37℃反应30min，即可获得与蛋白核酸复合物SPG-topoI-核酸。
(3)将所得蛋白核酸复合物SPG-topoI-核酸进行SDS-PAGE电泳确认，其结果如图2所示，图中从左向右的通道分别表示：1为融合蛋白对照(control)；2为蛋白核酸复合物SPG-topoI-核酸。从图2中可以看出，通道2中相较于对照存在着明显的滞后条带，说明本实施例中的目标蛋白与目标核酸已共价连接形成蛋白核酸复合物SPG-topoI-核酸。
实施例3 验证TopoⅠ-SPG-核酸功能
蛋白核酸复合物SPG-TopoⅠ-核酸与抗体结合的测试，步骤如下：
(1)SPG具有与多种来源的抗体IgG结合的能力，将实施例2制备获得的核酸蛋白复合物SPG-topoⅠ-核酸包被至酶标板中，4度过夜。
(2)磷酸盐缓冲液清洗三次后，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG，37度孵育30min，磷酸盐缓冲液清洗三次后加入TMB显色液，显色3min后加入2M硫酸终止反应，并检测在450nm处吸光值。
(3)实验结果如图3所示，组1为核酸蛋白复合物SPG-topoⅠ-核酸，组2为融合蛋白SPG-topoⅠ对照，组3为识别序列核酸对照，组4为BSA对照。图3的结果可以看出，核酸蛋白复合物SPG-topoⅠ-核酸、融合蛋白SPG-topoⅠ均保留了与抗体IgG的结合能力，不会影响SPG与抗体IgG结合的能力。
本发明中利用topoI拓扑异构酶能够识别和剪切具有5’-n-CCCTT-n-3’特定的双链目标核酸序列，能够使目标蛋白同时结合具有不同功能的核酸序列，使获得的蛋白核酸复合物具有更多的功能，例如连接的双链核酸序列，其两条单链核酸分别具有基因编辑和基因沉默的功能，则获得的核酸复合物能够同时发挥基因编辑和基因沉默的功能，与传统的独立的基因编辑和基因沉默系统相比，此种核酸复合物能够很好地将基因编辑和基因沉默功能相结合，实现协同的基因治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 连接核酸与蛋白或肽的方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> topoI的氨基酸序列
<400> 1
Met Gly Arg Arg Gln Tyr Phe Tyr Gly Lys Met His Val Gln Asn Arg
1 5 10 15
Asn Ala Lys Arg Asp Arg Ile Phe Val Arg Val Tyr Asn Val Met Lys
20 25 30
Arg Ile Asn Cys Phe Ile Asn Lys Asn Ile Lys Lys Ser Ser Thr Asp
35 40 45
Ser Asn Tyr Gln Leu Ala Val Phe Met Leu Met Glu Thr Met Phe Phe
50 55 60
Ile Arg Phe Gly Lys Met Lys Tyr Leu Lys Glu Asn Glu Thr Val Gly
65 70 75 80
Leu Leu Thr Leu Lys Asn Lys His Ile Glu Ile Ser Pro Asp Glu Ile
85 90 95
Val Ile Lys Phe Val Gly Lys Asp Lys Val Ser His Glu Phe Val Val
100 105 110
His Lys Ser Asn Arg Leu Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Leu Thr Asp Asp
115 120 125
Ser Ser Pro Glu Glu Phe Leu Phe Asn Lys Leu Ser Glu Arg Lys Val
130 135 140
Tyr Glu Cys Ile Lys Gln Phe Gly Ile Arg Ile Lys Asp Leu Arg Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Val Asn Tyr Thr Phe Leu Tyr Asn Phe Trp Thr Asn Val Lys
165 170 175
Ser Ile Ser Pro Leu Pro Ser Pro Lys Lys Leu Ile Ala Leu Thr Ile
180 185 190
Lys Gln Thr Ala Glu Val Val Gly His Thr Pro Ser Ile Ser Lys Arg
195 200 205
Ala Tyr Met Ala Thr Thr Ile Leu Glu Met Val Lys Asp Lys Asn Phe
210 215 220
Leu Asp Val Val Ser Lys Thr Thr Phe Asp Glu Phe Leu Ser Ile Val
225 230 235 240
Val Asp His Val Lys Ser Ser Thr Asp Gly
245 250
<210> 2
<211> 750
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 编码topoI的核苷酸序列
<400> 2
atgggacgta gacaatactt ttacggaaaa atgcatgtac agaatcgcaa cgctaaaaga 60
gatcgtattt ttgttagagt atataacgtt atgaaacgaa ttaattgttt tataaacaaa 120
aatataaaga aatcgtccac agattccaat tatcagttgg cggtttttat gttaatggaa 180
actatgtttt ttattagatt tggtaaaatg aaatatctta aggagaatga aacagtaggg 240
ttattaacac taaaaaataa acacatagaa ataagtcccg atgaaatagt tatcaagttt 300
gtaggaaagg acaaagtttc acatgaattt gttgttcata agtctaatag actatataag 360
ccgctattga aactgacgga tgattctagt cccgaagaat ttctgttcaa caaactaagt 420
gaacgaaagg tatatgaatg tatcaaacag tttggtatta gaatcaagga tctccgaacg 480
tatggagtca attatacgtt tttatataat ttttggacaa atgtaaagtc catatctcct 540
cttccatcac caaaaaagtt aatagcgtta actatcaaac aaactgctga agtggtaggt 600
catactccat caatttcaaa aagagcttat atggcaacga ctattttaga aatggtaaag 660
gataaaaatt ttttagatgt agtatctaaa actacgttcg atgaattcct atctatagtc 720
gtagatcacg ttaaatcatc tacggatgga 750
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 目标核酸
<400> 3
cgtgtcgccc ttattcccat agtgactaca gc 32
<210> 4
<211> 171
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> SPG的核酸序列
<400> 4
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gttgacgctg ctaccgcgga aaaagttttc aaacagtacg ctaacgacaa cggtgttgac 120
ggtgaatgga cctacgacga cgctaccaaa accttcacgg taaccgagga t 171
<210> 5
<211> 951
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 融合蛋白SPG-topoI的核苷酸序列
<400> 5
atgcagtaca agcttatcct gaacggtaaa accctgaaag gtgaaaccac caccgaagct 60
gttgacgctg ctaccgcgga aaaagttttc aaacagtacg ctaacgacaa cggtgttgac 120
ggtgaatgga cctacgacga cgctaccaaa accttcacgg taaccgagga tggtggaggt 180
ggatcgggac gtagacaata cttttacgga aaaatgcatg tacagaatcg caacgctaaa 240
agagatcgta tttttgttag agtatataac gttatgaaac gaattaattg ttttataaac 300
aaaaatataa agaaatcgtc cacagattcc aattatcagt tggcggtttt tatgttaatg 360
gaaactatgt tttttattag atttggtaaa atgaaatatc ttaaggagaa tgaaacagta 420
gggttattaa cactaaaaaa taaacacata gaaataagtc ccgatgaaat agttatcaag 480
tttgtaggaa aggacaaagt ttcacatgaa tttgttgttc ataagtctaa tagactatat 540
aagccgctat tgaaactgac ggatgattct agtcccgaag aatttctgtt caacaaacta 600
agtgaacgaa aggtatatga atgtatcaaa cagtttggta ttagaatcaa ggatctccga 660
acgtatggag tcaattatac gtttttatat aatttttgga caaatgtaaa gtccatatct 720
cctcttccat caccaaaaaa gttaatagcg ttaactatca aacaaactgc tgaagtggta 780
ggtcatactc catcaatttc aaaaagagct tatatggcaa cgactatttt agaaatggta 840
aaggataaaa attttttaga tgtagtatct aaaactacgt tcgatgaatt cctatctata 900
gtcgtagatc acgttaaatc atctacggat ggacaccacc accaccacca c 951
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 目标核酸序列
<400> 6
cgtgtcgccc ttattcccat agtgactaca gc 32
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 目标核酸序列
<400> 7
gaataagggc gacacg 16
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