阅读说明：本技术 新型乳酸细菌 (Novel lactic acid bacterium ) 是由 A·科许-布拉谢尔 C·弗雷莫 T·德富热尔 A·叶德热乔夫斯基 于 2018-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种携带选自由以下组成的组的2个或3个基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：1)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因和glcK基因,2)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因和ccpA基因,以及3)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因、glcK基因和ccpA基因,其中当所述菌株用于发酵奶时,其提供低乳糖发酵奶和/或在发酵温度下储存时未经历酸化的发酵奶。(The present invention relates to a lactose positive galactose negative streptococcus thermophilus strain carrying mutations in 2 or 3 genes selected from the group consisting of: 1) a gene encoding a mannose-glucose specific PTS protein and a glcK gene, 2) a gene encoding a mannose-glucose specific PTS protein and a ccpA gene, and 3) a gene encoding a mannose-glucose specific PTS protein, a glcK gene and a ccpA gene, wherein the strain provides a lactose-reduced fermented milk and/or a fermented milk that has not undergone acidification when stored at a fermentation temperature when used to ferment milk.)

具体实施方式

本发明已证明，可使用严格解除糖代谢调控的突变来设计嗜热链球菌菌株，其可用于获得低乳糖发酵奶产品和/或可用于生产即使在发酵温度下储存时也未经历后酸化的发酵奶。

本发明人已经很好地证明，这种嗜热链球菌菌株可以通过释放的半乳糖量相对于发酵奶中剩余乳糖量的比率来表征。此比率解释了菌株消耗乳糖(摄取和水解)并将其转化为游离半乳糖和葡萄糖的能力。由于本发明的嗜热链球菌菌株的半乳糖阴性表型，释放的半乳糖表示消耗的乳糖的化学计量。它应被认为是菌株对过度使用的乳糖的有效性。因此，本发明人已经证明，在本发明的半乳糖阴性菌株中，来自乳糖水解的碳水化合物的分解代谢是严格不受调节的，使得乳糖的消耗量增加，而菌株仍然保持可接受的增长以供其在工业水平上使用。本发明的菌株不必是半乳糖阳性的(已经显示在乳糖上不稳定的表型)。

本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。

在一个实施例中，本发明涉及一种携带选自由以下组成的组的基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：1)至少一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因和glcK基因，2)至少一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因和ccpA基因，以及3)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因、glcK基因和ccpA基因；

其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。

在一个实施例中，本发明涉及一种携带编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的一种基因和glcK基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因选自由以下组成的组：manL基因、manM基因、manN基因和manO基因。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因选自由以下组成的组：manL基因、manM基因和manN基因。在一个实施例中，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组的一种基因中携带突变。在一个实施例中，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组的2种基因中携带突变。在一个实施例中，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL基因、manM基因和manN基因中携带突变。

在一个实施例中，本发明涉及一种携带选自由以下组成的组的2或3种基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：1)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因和glcK基因，2)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因和ccpA基因，以及3)编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因、glcK基因和ccpA基因；

其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。

本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在奶发酵期间释放的半乳糖量 相对于剩余乳糖量的比率。

在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株表现出所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。在一个实施例中，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率选自由以下组成的组：大于1.2、大于1.5、大于2和大于3。在一个实施例中，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5。在一个实施例中，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于2。在一个实施例中，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于3。

根据本发明，在奶发酵期间释放的半乳糖量(mM)和剩余乳糖量(mM)可以通过本领域熟知的方法来确定。在一个实施例中，发酵奶中半乳糖和乳糖的浓度通过如下定义的测试B来表征：

测试B：

以1％(v/v，约10⁷CFU/ml)用待测定的嗜热链球菌菌株的培养物(来自在补充有3％蔗糖的M17中生长的过夜培养物的无碳水化合物M17再悬浮细胞)接种预先在90℃下巴氏灭菌10min的含有3％(w/v)奶粉(BBA公司，兰特黎斯公司(Lactalis))的UHT半脱脂奶“LePetit Vendéen”(“酸奶”)。发现此奶含有约175mM乳糖。将接种的奶瓶在43℃的水浴中静置孵育24h，获得发酵奶。将T0样品和发酵奶(T24h)样品(5g)在25g 0.025N H₂SO₄中稀释，随后在4℃下以4600rpm离心10分钟。将上清液通过0.2μm尼龙滤膜(德国阿沙芬堡的菲罗门公司(Phenomenex,Germany,Aschaffenburg))直接过滤到2ml HPLC小瓶中。将样品储存在-20℃下直至进一步分析。在35℃下，通过配备有折射率检测器的高效液相色谱(安捷伦(Agilent)1200HPLC)，使用Aminex HPX-87H阴离子交换柱(伯乐实验室公司(Bio-RadLaboratories Inc.))，使用12.5mM H₂SO₄作为洗脱液和0.6ml min^-1的流速对碳水化合物[特别是半乳糖和乳糖]进行定量。用Chemstation再处理软件(安捷伦公司(Agilent))进行结果的开发。

为了避免疑问，嗜热链球菌物种应理解为是唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivarius subsp.thermophilus)菌株。

表述“乳糖阳性”是指嗜热链球菌菌株能够在作为碳水化合物来源的唯一来源的乳糖上，特别是在补充有2％乳糖的M17培养基上生长。

在一个具体的实施例中，通过以下方法来测定“乳糖阳性”表型：以1％的比率在含有2％乳糖的M17肉汤中接种待测试的嗜热链球菌菌株的过夜培养物，并在37℃下孵育20小时，并且其中在孵育结束时5.5或更低的pH指示乳糖阳性表型。

表述“半乳糖阴性”是指嗜热链球菌菌株不能在作为碳水化合物来源的唯一来源的乳糖上，特别是在补充有2％乳糖的M17培养基上生长。在一个具体的实施例中，通过以下方法来测定“乳糖阴性”表型：以1％在含有2％乳糖的M17肉汤中接种待测试的嗜热链球菌菌株的过夜培养物，并在37℃下孵育20小时，并且其中在孵育结束时6或更高的pH指示乳糖阴性表型。

关于原始菌株的表述“衍生物”(例如，DGCC7710衍生物)是指从原始菌株(例如从DGCC7710菌株)通过将其基因中的一个(诸如glcK、ccpA……)用相同基因的另一个等位基因(特别是突变的等位基因)置换而获得的菌株。在一个实施例中，通过将原始菌株的完整基因(编码序列和启动子)用相同基因的另一个等位基因(编码序列和启动子)置换来获得衍生物。在一个实施例中，通过将原始菌株基因的编码序列用相同基因的另一个等位基因(编码序列)置换来获得衍生物。

因此，本发明涉及：

-携带至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变并携带glcK基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变降低或消除葡萄糖从培养基输入细菌中。在一个实施例中，所述突变的glcK基因编码葡萄糖激酶，所述菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。在一个实施例中，所述乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带降低或消除葡萄糖从培养基输入细菌中的在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变并携带编码葡萄糖激酶的glcK基因中的突变，使得所述菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。在这些实施例的任一个中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因选自由以下组成的组：manL基因、manM基因和manN基因；

-携带至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变并携带ccpA基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变降低或消除葡萄糖从培养基输入细菌中。在一个实施例中，ccpA基因中的突变产生乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其表现出通过测试D测定的所述菌株的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6、至少5.10^-6、至少6.10^-6、至少7.10^-6或至少8.10^-6。在一个实施例中，所述乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带降低或消除葡萄糖从培养基输入细菌中的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变并携带ccpA基因中的突变，使得通过测试D测定的所述菌株的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6。在这些实施例的任一个中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因选自由以下组成的组：manL基因、manM基因和manN基因；

-携带至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变、携带glcK基因中的突变并携带ccpA基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变降低或消除葡萄糖从培养基输入细菌中。在一个实施例中，所述突变的glcK基因编码葡萄糖激酶，所述菌株中的葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但在所述菌株中不为零。在一个实施例中，ccpA基因中的突变产生乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其表现出通过测试D测定的所述菌株的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6、至少5.10^-6、至少6.10^-6、至少7.10^-6或至少8.10^-6。在一个实施例中，所述乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带降低或消除葡萄糖从培养基输入细菌中的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变，携带编码葡萄糖激酶的glcK基因中的突变，使得所述菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零，并且携带ccpA基因中的突变，使得通过测试D测定的所述菌株的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6。在以上实施例中的任一个中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组。

以下部分I至III分别描述了glcK基因的突变、编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变(诸如manL基因、manM基因和manN基的突变)和ccpA基因的突变。

虽然本文分别公开了这些突变(为了清楚起见)，但是一部分的任何实施例可以与另一部分的任何实施例或与两个其他部分的任何实施例组合，以设计如本文中所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，当如通过测试B测定的，将其用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。

为了避免疑义，本发明涉及一种如本文中所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中，当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3，其中所述菌株携带：

1)如本文第II部分中所定义的至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变以及如本文第I部分中所定义的其glcK基因中的突变；或

2)如本文第II部分中所定义的至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变以及如本文第III部分中所定义的其ccpA基因中的突变；或

3)如本文第II部分中所定义的至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变、如本文第I部分中所定义的其glcK基因中的突变以及如本文第III部分中所定义的其ccpA基因中的突变；

I.glcK基因的突变

此部分描述了glcK基因的突变，在本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的上下文中，其可以与编码如本文中所定义的甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变组合使用，或与编码如本文中所定义的甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变和如本文中所定义的ccpA基因的突变组合使用。

在一个实施例中，本发明的菌株的突变的glcK基因编码葡萄糖激酶，所述菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。实际上，本发明人已经证明了编码葡萄糖激酶(GlcK)的glcK基因的一些突变的等位基因，当所述突变的glcK基因存在于乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株时，其中的葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。

表述“编码葡萄糖激酶的glcK基因”是指嗜热链球菌菌株中编码葡萄糖激酶的任何DNA序列，所述葡萄糖激酶催化葡萄糖和ATP向葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP的转化。嗜热链球菌葡萄糖激酶序列的非限制性实例如SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所公开。

在本发明中，嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性由于所述菌株的glcK基因突变而被显著降低但不为零。换句话说，由所述菌株携带的glcK基因的等位基因使得所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。

表述“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”是指菌株的葡萄糖激酶活性符合以下两者：

-所述菌株中的葡萄糖激酶活性显著降低，特别是与携带非突变的glcK基因的菌株中的葡萄糖激酶活性相比；以及

-不为零，即，活性可通过如本文中所定义的测试A检测。

根据本发明，特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”可以通过本领域熟知的方法来确定。因此，用于测量嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性的方法是已知的，并且包括使用市售反应物的酶测定。本文参考Pool等人(2006.MetabolicEngineering[代谢工程]8(5)；456-464)的第2.4段(通过引用并入本文)。在一个具体的实施例中，通过测试A测定本发明嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试A]。

测试A：

获得了待测定的嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在0.8+/-0.2的600nm光密度(OD600)时，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在5ml冷GLCK缓冲液(5mMMgCl2，10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄[pH 7.2])中洗涤，并再悬浮于500μl冷GLCK缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmplete^TM”(罗氏公司(Roche)，供应商参考号04693132001)添加到GLCK缓冲液中。通过向200μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch,Haan,Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白质含量。细胞提取物中的葡萄糖激酶活性通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶分光光度法测定(G-6PDH，EC1.1.1.49)：NADPH耦合测定(Porter等人,1982)，本质上如Pool等人(2006)所述。将每种样品(5、10和20μL)以最终体积250μL添加至测定缓冲液(10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄[pH 7.2]、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM葡萄糖、1mM NADP、1U G-6PDH)中，并且将混合物在30℃下放置5min。通过使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司)测量340nm下的光密度5分钟。一单位的葡萄糖激酶对应于在测定条件下每分钟催化1微摩尔D-葡萄糖磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸的酶的量。葡萄糖激酶活性如下计算：

葡萄糖激酶活性(U/g总蛋白质提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：

-dOD是340nm下光密度(OD)的变化

-V是反应体积(本文中为250μL)

dt＝测量时间(以分钟计)

l＝光路长度(在本文中为0.73cm)

ε＝NADPH的摩尔衰减系数；H⁺(本文中为6220cm2/μmol)

Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)

对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试A给出的葡萄糖激酶比活性值是三次独立实验的平均值。

在特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的第一具体的实施例中，如通过测试A测定的，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为300U/g至1200U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为400U/g至1000U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为选自由200U/g、300U/g和400U/g总蛋白质提取物组成的组的最小值至选自由1000U/g、1200U/g和1500U/g总蛋白质提取物组成的组的最大值。值得注意的是，如测试A中所述，本文公开的葡萄糖激酶活性值是三个独立实验(一式三份)的平均值。

在特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的第二具体实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％的活性。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性”是指DGCC7710菌株中通过测试A测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQID NO:2)的活性[即，使用DGCC7710菌株进行测试A]。基于本发明菌株中的葡萄糖激酶活性和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性(两者均通过测试A测定)来计算百分比值。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性在DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为菌株DGCC7710的葡萄糖激酶活性的15％至40％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。在一个具体的实施例中，并且无论百分比范围如何，均通过本文所述的测试A来测定葡萄糖激酶活性的活性。值得注意的是，本文公开的百分比值是根据葡萄糖激酶活性值计算的，所述葡萄糖激酶活性值是通过测试A测定的三个独立实验(一式三份)的平均值。

在第一和第二具体实施例中，以下菌株可用作测试A中的对照：

-作为阳性对照(即嗜热链球菌菌株，其代表携带非突变的glcK基因的菌株)：2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的菌株DGCC7710；

-作为阴性对照(即具有不可检测的葡萄糖激酶活性的嗜热链球菌菌株)：glcK基因被敲除的嗜热链球菌或glcK基因携带WO 2013/160413、WO 2017/103051或等人(2016)中公开并总结于下表1中的突变之一的嗜热链球菌：

表1：产生葡萄糖激酶活性不可检测的菌株的glcK突变

在奶发酵期间，奶中含有的乳糖(作为奶中的主要碳水化合物来源)被输入到嗜热链球菌菌株中。然后通过β-半乳糖苷酶将细胞内乳糖裂解成葡萄糖和半乳糖(使得1摩尔乳糖产生1摩尔葡萄糖和1摩尔半乳糖)。

特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”还可以用葡萄糖激酶的最大正向速度(在本文中称为Vmax，并定义为葡萄糖+ATP转化为G6P+ADP的速度)或用葡萄糖激酶对其底物即葡萄糖和ATP中的一种或两种的亲和力(称为Km)的倒数来表征。在一个实施例中，本发明菌株的特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”还用所述菌株中的其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)表征。

因此，与本文中定义的特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的第一或第二具体实施例组合，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零。可以通过以下这些参数中的一个或两个来定义特征“所述菌株中的葡萄糖激酶Vmax被显著降低但不为零”：

-如通过测试C测定的，Vmax为200至1500U/g总蛋白质提取物。

-在均通过测试C测定时，Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。

在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的突变的glcK基因编码葡萄糖激酶，其中所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且其中所述菌株中其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零，并由以下这些参数中的一个或两个定义：

-如通过测试C测定的，Vmax为200至1500U/g总蛋白质提取物。

-在均通过测试C测定时，Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。

通过测试C测定本发明的嗜热链球菌中的葡萄糖激酶最大正向速度(Vmax)[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试C]。

测试C：

通过对如测试A中所述制备的粗提取物使用各种葡萄糖浓度(0mM、5mM、10mM、15mM、20mM)来测定最大正向速度(Vmax)。对每个样品进行三次测量，测试C中给出的Vmax值是三次独立实验的平均值。呈现出比速度倒数随葡萄糖浓度倒数的变化的线性回归给出了与图形Y轴相交处的最大正向速度的倒数。

在本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度的一个具体的实施例中，如通过测试C测定的，Vmax为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C测定的，Vmax为300U/g至1200U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，Vmax为400至1000U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C测定的，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的Vmax为选自由200、300和400U/g总蛋白质提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白质提取物组成的组的最大值。

在本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度的一个具体的实施例中，Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax”是指DGCC7710菌株中通过测试C测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQID NO:2)的Vmax[即，使用DGCC7710菌株进行测试C]。百分比值是根据本发明菌株中的葡萄糖激酶的Vmax和DGCC7710菌株的Vmax计算的，两种Vmax均通过测试C测定。在一个具体的实施例中，在均通过测试C测定时，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的10％至50％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的15％至40％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的Vmax为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。

本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。

本发明中的“glcK基因中的突变”是指glcK基因内的任何核苷酸变化，其中所述核苷酸层面的变化使携带此突变的glcK基因(作为唯一的glcK基因)的菌株中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地使所述菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。在一个具体的实施例中，本发明中的“glcK基因中的突变”是指glcK基因的可读框内的任何核苷酸变化，其中所述核苷酸层面的变化使携带此突变的glcK基因(作为唯一的glcK基因)的菌株中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地使所述菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。

因此，尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的glcK基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这两个glcK基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是突变：

-不会引起蛋白质层面的任何改变(沉默变化)并且不会影响glcK RNA的翻译的核苷酸层面的变化；以及

-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不影响如本文中所定义的所得GlcK蛋白的葡萄糖激酶活性和任选地所得GlcK蛋白的最大正向速度。实际上，可以在本发明的嗜热链球菌的glcK基因的层面上观察到此类变化，而不影响保护范围。

在本发明的意义上不被认为是突变的glcK基因的非限制性实例是：

-编码如SEQ ID NO:2中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:1中所定义的多核苷酸；此GlcK类型是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株之一；

-编码如SEQ ID NO:4中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST2)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:3中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:6中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST3)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:5中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:8中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST4)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:7中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:10中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST5)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:9中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:12中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST6)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:11中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:14中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST7)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:13中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:16中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST8)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:15中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:18中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST9)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:17中所定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO:20中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST10)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:19中所定义的多核苷酸。

表3中总结了葡萄糖激酶层面的氨基酸差异以及每种GlcK类型与SEQ ID NO:2的同一性百分比(实例2)。表4中总结了GlcK类型ST2至ST10的菌株中的葡萄糖激酶活性(实例3)。

此外，glcK基因内的一些核苷酸突变被认为不适用于本发明的目的，因为所述突变会产生通过测试A测定的活性为零或低于本文定义的最小值的葡萄糖激酶。不合适突变的非限制性实例描述于表1中。在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌不携带选自由引起glcK基因敲除和glcK基因内大缺失的突变组成的组的突变。

在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因的可读框中携带突变，使得GlcK蛋白质中的氨基酸被取代，携带所述突变的glcK基因的所述菌株中GlcK蛋白质的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因中携带突变，使得GlcK蛋白质中的氨基酸被取代，携带所述突变的glcK基因的所述菌株中GlcK蛋白质的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因中携带突变，使得GlcK蛋白质的长度为322个氨基酸，并且其中所述菌株中葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。

如上所述，在本发明嗜热链球菌的glcK基因层面上可以观察到一些DNA修饰，这些修饰不影响菌株的葡萄糖激酶活性。基于本文中定义的测试A以及本文中定义的对照菌株，本领域技术人员应知道如何鉴定1)编码葡萄糖激酶的glcK基因，携带此glcK基因的菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且任选地其中携带此突变的glcK基因的菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度被显著降低但不为零(如本文中所定义)；2)带有如下修饰的glcK基因，所述修饰对携带此修饰的菌株中的葡萄糖激酶活性没有影响，或3)编码如下葡萄糖激酶的glcK基因，携带此glcK基因的菌株中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为零(如本文中所定义)。

可以通过以下方法将DGCC7710菌株用作对照：用待测定的glcK基因置换其glcK基因以获得DGCC7710的衍生物，并通过测试A(葡萄糖激酶活性)或测试C(Vmax)测定所述DGCC7710衍生物。

本发明人已经鉴定了葡萄糖激酶内的两个位置，所述位置的氨基酸性质已经显示影响葡萄糖激酶的活性，使得葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且影响葡萄糖激酶的Vmax，使得Vmax如本文中所定义被显著降低但不为零：葡萄糖激酶的第144位和第275位(即，glcK基因的第144个和第275个密码子)。值得注意的是，基于本文定义的测试A和C以及对照菌株，本领域技术人员应知道如何鉴定葡萄糖激酶内的其他位置和适当氨基酸，以获得被显著降低但不为零(如本文中所定义)的葡萄糖激酶活性和任选地被显著降低但不为零的最大正向速度，以及因此相应的glcK基因。

在一个实施例中，葡萄糖激酶第275位的氨基酸(由本发明的嗜热链球菌菌株的glcK基因编码)不是谷氨酸(即，是除谷氨酸以外的任何氨基酸)；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子既不是GAA也不是GAG。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第275位的氨基酸不是酸性氨基酸(即，是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸)；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是编码非酸性氨基酸的密码子。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第275位的氨基酸选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是编码选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶275位的氨基酸是赖氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是AAA或AAG。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的核苷酸823-825是AAA或AAG。

在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:25中所定义的序列，其中第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸；以及

b)与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。

在另一个实施例中，葡萄糖激酶第144位的氨基酸(由本发明的嗜热链球菌菌株的glcK基因编码)不是甘氨酸(即，是除甘氨酸以外的任何氨基酸)；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子不是GGT、GGC、GGA或GGG。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第144位的氨基酸不是脂族氨基酸(即，是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸)。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第144位的氨基酸选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是编码选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶144位的氨基酸是丝氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的核苷酸430-432是AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。

在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:46中所定义的序列，其中第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸；以及

b)与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。

为了定义与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO:25中所定义的第275位不考虑用于计算相似性或同一性。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。

在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸(第275位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO:25的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。

为了定义与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO:46中所定义的第144位不考虑用于计算相似性或同一性。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。

在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸(第144位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO:46的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。

在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组，其中所述变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组，其中葡萄糖激酶第275位的氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地分别是赖氨酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是谷氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子既不是GAA也不是GAG；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:25和本文所定义的与SEQ IDNO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是谷氨酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是酸性氨基酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是不编码酸性氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:25和本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是酸性氨基酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是编码选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:25和本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是赖氨酸及其任何保守氨基酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是赖氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子分别是编码赖氨酸的密码子，特别地分别是AAA或AAG；因此，在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:22、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:22、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组；在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因如SEQ ID NO:21中所定义。

在另一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:46、47、48、49、50、51、52、53、54和55组成的组，其中所述变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:46、47、48、49、50、51、52、53、54和55组成的组，其中葡萄糖激酶第144位的氨基酸不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是甘氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子不是GGT、GGC、GGA或GGG；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:46和本文所定义的与SEQ IDNO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是甘氨酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是脂族氨基酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是不编码脂族氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:46和本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是脂族氨基酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是编码选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:46和本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是丝氨酸及其任何保守氨基酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是丝氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是编码丝氨酸的密码子，特别是AAA或AAG；因此，在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:45、56、57、58、59、60、61、62、63和64组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:45、56、57、58、59、60、61、62、63和64组成的组；在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因如SEQID NO:44中所定义。

在定义本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白质的序列时，根据本申请的教导，表达此GlcK蛋白质的菌株中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地此菌株中葡萄糖激酶的Vmax如本文中所定义被显著降低但不为零。

II.编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是manL、manM和manN 基因的突变。

此部分描述了编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是manL、manM和manN基因的突变，在本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的上下文中，其可以与如本文中所定义的glcK基因的突变组合使用，或与如本文中所定义的ccpA基因的突变组合使用，或与如本文中所定义的glcK基因的突变和ccpA基因的突变二者组合使用。

在乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的任何突变是合适的，只要当与如本文中所定义的突变的glcK基因组合时，或与如本文中所定义的ccpA基因的突变组合时，或当与如本文中所定义的突变的glcK基因和突变的ccpA基因二者组合时，当所述菌株用于发酵奶(通过测试B)时，如本文所定义，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。

本发明人已经证明，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中降低或消除葡萄糖从培养基输入的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变，特别是突变的manL基因、突变的manM基因、突变的manN基因或突变的manO基因中的突变在本发明中特别有利。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变引起降低或消除此基因编码的蛋白质的葡萄糖输入活性。在一个实施例中，所述突变的基因是manL基因，并且manL基因的突变引起降低或消除IIAB^Man蛋白质的葡萄糖输入活性。在一个实施例中，所述突变的基因是manM基因，并且manM基因的突变引起降低或消除IIC^Man蛋白质的葡萄糖输入活性。在一个实施例中，所述突变的基因是manN基因，并且manN基因的突变引起降低或消除IID^Man蛋白质的葡萄糖输入活性。

在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是引起基因敲除(即，完全破坏)的突变。

在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是该基因的启动子的突变，特别是该基因的启动子的降低或抑制基因转录的突变。

在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是引入所述基因编码序列中的突变，特别是引起由突变的基因编码的蛋白质的葡萄糖输入活性降低或消除，特别是引起IIAB^Man蛋白质、IIC^Man蛋白质或IID^Man蛋白质的葡萄糖输入活性降低或消除的突变。

在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是如下突变，其在所述基因的编码序列中，产生截短的蛋白质，特别是产生截短的IIAB^Man蛋白质、截短的IIC^Man蛋白质或截短的IID^Man蛋白质，特别是产生具有降低或消除的葡萄糖输入活性的截短的蛋白质(诸如截短的IIAB^Man蛋白质、截短的IIC^Man蛋白质或截短的IID^Man蛋白质)。无论截短的位置如何，引入基因中的突变是产生终止密码子的核苷酸取代，或引起可读框移框并且产生提前终止密码子的缺失、插入或缺失/插入。在一个实施例中，引入基因中的突变是产生终止密码子的核苷酸取代。在一个实施例中，引入基因中的突变是引起可读框移框并且产生提前终止密码子的缺失、插入或缺失/插入。

尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的manL、manM或manN基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这些基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是manL、manM或manN基因的突变：

-不会引起蛋白质层面的任何改变(沉默变化)并且不会影响manL、manM或manNRNA的翻译的核苷酸层面的变化；以及

-在乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中，确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是当与如本文中所定义的突变的glcK基因组合时，或与如本文中所定义的ccpA基因的突变组合时，或当与突变的glcK基因和突变的ccpA基因二者组合时，当所述菌株用于发酵奶(通过测试B)时，其中此改变不能达到如本文所定义的所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)大于1.2的比率。

在本发明的意义上不被认为是突变的manL、manM和manN基因(分别编码IIAB^Man蛋白质、IIC^Man蛋白质和IID^Man蛋白质)的非限制性实例是：

-编码如SEQ ID NO:78中所定义的IIAB^Man蛋白质(IIAB^Man类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:77中所定义的多核苷酸；此IIAB^Man类型是DGCC7710菌株之一；

-编码如SEQ ID NO:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110中所定义的IIAB^Man蛋白质(IIAB^Man类型ST2至ST17)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中所定义的多核苷酸。如SEQID NO:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110中所定义的IIAB^Man蛋白质的序列与SEQ ID NO:78具有98.4％至99.6％同一性；

-编码如SEQ ID NO:130中所定义的IIC^Man蛋白质(IIC^Man类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:129中所定义的多核苷酸；此IIC^Man类型是DGCC7710之一；

-编码如SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和156中所定义的IIC^Man蛋白质(IIC^Man类型ST2至ST14)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153和155中所定义的多核苷酸。如SEQ IDNO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和156中所定义的IIC^Man蛋白质的序列与SEQ ID NO:130具有98.5％至99.6％同一性；

-编码如SEQ ID NO:167中所定义的IID^Man蛋白质(IID^Man类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:166中所定义的多核苷酸；此IID^Man类型是DGCC7710菌株之一；

-编码如SEQ ID NO:169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203和205中所定义的IID^Man蛋白质(IID^Man类型ST2至ST20)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO:168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202和204中所定义的多核苷酸。如SEQ ID NO:169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203和205中所定义的IID^Man蛋白质的序列与SEQ ID NO:167具有97.3％至99.6％同一性。

本发明人已经鉴定了manL基因中的至少一种突变，当将其插入起始乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的manL基因中时[在如本文所述的glcK基因、ccpA基因或glcK和ccpA基因二者中突变]，当所述菌株用于发酵奶时，使得达到如本文所定义的所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)大于1.2的比率(如通过测试B测定的)。

在一个实施例中，manL基因中的突变使IIAB^Man蛋白质在第305位被截短。在一个实施例中，manL基因中的突变是在第916位以核苷酸T取代核苷酸G(使得在第306位产生终止密码子)。在第305位被截短的嗜热链球菌IIAB^Man蛋白质在本文中称为IIAB^Man ₃₀₅。

在一个实施例中，在第305位被截短的所述IIAB^Man蛋白质的序列选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:112中所定义的序列；以及

b)与SEQ ID NO:112具有至少90％相似性或同一性的IIAB^Man变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。

为了定义与SEQ ID NO:112具有至少90％相似性的IIAB^Man变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]。在一个具体的实施例中，IIAB^Man变体序列与SEQ ID NO:112具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性。

在一个具体的实施例中，IIAB^Man变体序列与SEQ ID NO:112的差异在于1至30个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIAB^Man变体序列与SEQ ID NO:112的差异在于1至20个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIAB^Man变体序列与SEQ ID NO:112的差异在于1至15个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIAB^Man变体序列与SEQ ID NO:112的差异在于1至10个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIAB^Man变体序列与SEQ ID NO:112的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的IIAB^Man蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:112至128组成的组。

在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的manL基因编码IIAB^Man蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:112和与如本文中所定义的SEQ ID NO:112具有至少90％相似性或同一性的任何IIAB^Man变体序列(特别是SEQ ID NO:113至128)组成的组。在一个实施例中，由本发明的嗜热链球菌菌株携带的manL基因如SEQ ID NO:111中所定义。

本发明人已经鉴定了manM基因中的至少一种突变，当将其插入起始乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的manL基因中时[在如本文所述的glcK基因、ccpA基因或glcK和ccpA基因二者中突变]，当所述菌株用于发酵奶时，使得达到如本文所定义的所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)大于1.2的比率(如通过测试B测定的)。

在一个实施例中，manM基因中的突变使IIC^Man蛋白质在第208位被截短。在一个实施例中，manM基因中的突变是在第625位以核苷酸T取代核苷酸G(使得在第209位产生终止密码子)。在第208位被截短的嗜热链球菌IIC^Man蛋白质在本文中称为IIC^Man ₂₀₈。

在一个实施例中，在第208位被截短的所述IIC^Man蛋白质的序列选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:158中所定义的序列；以及

b)与SEQ ID NO:158具有至少90％相似性或同一性的IIC^Man变体序列，特别是长度为208个氨基酸的序列。

为了定义与SEQ ID NO:158具有至少90％相似性的IIC^Man变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]。在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:158具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性。

在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:158的差异在于1至30个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:158的差异在于1至20个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:158的差异在于1至15个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:158的差异在于1至10个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:158的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的IIC^Man蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:158至165组成的组。

在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的manM基因编码IIC^Man蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:158和与如本文中所定义的SEQ ID NO:158具有至少90％相似性或同一性的任何IIC^Man变体序列(特别是SEQ ID NO:159至165)组成的组。在一个实施例中，由本发明的嗜热链球菌菌株携带的manM基因如SEQ ID NO:157中所定义。

本发明人已经鉴定了manN基因中的至少一种突变，当将其插入起始乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的manN基因中时[在如本文所述的glcK基因、ccpA基因或glcK和ccpA基因二者中突变]，当所述菌株用于发酵奶时，使得达到如本文所定义的所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)大于1.2的比率(如通过测试B测定的)。

在一个实施例中，manN基因中的突变使IID^Man蛋白在第28位被截短。在一个实施例中，manN基因中的突变是在第37-41位具有5个核苷酸A的段中插入核苷酸A(产生具有6个核苷酸A的片段，引起IID^Man蛋白质在第28位的可读框移框和截短)。在第28位被截短的此种嗜热链球菌IID^Man蛋白质在本文中称为IID^Man ₂₈。

在一个实施例中，在第28位被截短的所述IID^Man蛋白质的序列选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:207中所定义的序列；以及

b)与SEQ ID NO:207具有至少90％相似性或同一性的IID^Man变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。

为了定义与SEQ ID NO:207具有至少90％相似性的IID^Man变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]。在一个具体的实施例中，IIC^Man变体序列与SEQ ID NO:207具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性。

在一个具体的实施例中，IID^Man变体序列与SEQ ID NO:207的差异在于1至10个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IID^Man变体序列与SEQ ID NO:207的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的IID^Man蛋白质的序列选自由SEQ ID NO:207至211组成的组。

在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的manN基因编码IID^Man蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:207和与如本文中所定义的SEQ ID NO:207具有至少90％相似性或同一性的任何IID^Man变体序列(特别是SEQ ID NO:208至211)组成的组。在一个实施例中，由本发明的嗜热链球菌菌株携带的manN基因如SEQ ID NO:206中所定义。

无论如本文所定义的glcK基因的突变和如本文所定义的ccpA基因的突变如何(单独存在或组合存在在本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中)，至少一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因如本文所定义突变。无论是哪个实施例，本发明包含一种携带在选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组的一个、两个或三个基因中的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manM中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manN中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变并且在manM中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变并且在manN中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manM中携带突变并且在manN中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变，在manM中携带突变并且在manN中携带突变。

可以使用任何方法来鉴定适合于本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变，特别是manL基因、manM基因或manN基因中的突变。

例如，为了鉴定manL基因、manM基因或manN基因中的合适突变，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：

a)提供DSM32587菌株(其glcK基因突变)

b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的manL、manM或manN基因进行诱变，以获得序列与DSM32587的manL、manM或manN基因的序列不同的manL、manM或manN基因，从而获得man突变的DSM32587菌株；

c)通过测试B测定通过步骤b)的man-突变的DSM32587菌株发酵的奶的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率，其中比率大于1.2意味着突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的manL、manM或manN基因被认为是根据本发明的。

替代性地，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：

a)提供DGCC7710菌株，其中所述菌株的ccpA基因已用如SEQ ID NO:71中所定义的突变的ccpA基因(ccpA_Δ1A114-120)置换，所述菌株在本文中称为DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株；

b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的manL、manM或manN基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株的manL、manM或manN基因的序列不同的manL、manM或manN基因，从而获得man突变的DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株；

c)通过测试B测定通过步骤b)的man突变的DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株发酵的奶的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率，其中比率大于1.2意味着突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的manL、manM或manN基因被认为是根据本发明的。

鉴定后，可以引入根据本发明的突变的manL、manM或manN基因以代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的manL、manM或manN，以获得本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。

III.ccpA基因的突变

此部分描述了ccpA基因的突变，在本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的上下文中，其可以与编码如本文中所定义的甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变组合使用，或与编码如本文中所定义的甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变和如本文中所定义的glcK基因的突变组合使用。

在乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中，ccpA基因中的任何突变是合适的，只要当与如本文中所定义的突变的glcK基因组合时，或与如本文中所定义的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的突变的基因组合时，或当与如本文中所定义的突变的glcK基因和编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的突变的基因二者组合时，当所述菌株用于发酵奶时，如本文所定义，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。

本发明人已经证明，产生本发明的嗜热链球菌菌株的ccpA基因的突变可以通过在携带此突变的ccpA的菌株中通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率来表征。因此，如本文所定义的ccpA突变是ccpA基因的突变，其产生乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率选自由至少4.10^-6、至少5.10^-6、至少6.10^-6、至少7.10^-6或至少8.10^-6组成的组。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少5.10^-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少6.10^-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少7.10^-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少8.10^-6。无论本文中定义的比率的最小值是多少，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率不小于8.10^-3。

为了测定本发明的菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率，使用如本文所述的测试D和测试E：

测试D：

通过测试D测定本发明的嗜热链球菌菌株中的β-半乳糖苷酶活性[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试D]。

获得了待测定的嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在42℃下在M17+30g/l乳糖上生长3小时后，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在1.5ml冷裂解缓冲液(KPO40.1M)中洗涤，并再悬浮于300μl冷裂解缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmplete^TM”(罗氏公司(Roche)，供应商参考号04693132001)添加到裂解缓冲液中。通过向250μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch,Haan,Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKAProtein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白质含量。通过分光光度法监测O-硝基-苯酚-β-半乳糖苷(ONPG)向半乳糖和O-硝基-苯酚(ONP)的水解来确定细胞提取物中的β-半乳糖苷酶活性。将20μL细菌提取物与135μL反应缓冲液(NaPO₄ 0.1M+KCl0.01M+MgSO₄ 0.001M+ONPG 3mM+β巯基乙醇60mM，pH＝6)混合。ONP的产生使管中呈黄色。当出现此颜色时，通过添加250μL终止缓冲液(Na₂CO₃ 1M)来阻断反应。使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司(BIO-TEK))测量420nm下的光密度。一单位的半乳糖苷酶对应于在测定条件下每分钟催化产生1微摩尔ONP的酶的量。β-半乳糖苷酶的活性如下计算：

β-半乳糖苷酶活性(U/g总蛋白质提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：

-dOD是空白样品与测试样品之间在420nm下的光密度(OD)的变化

-V是光密度经测量的反应的体积(在本文中为250μL)

-dt＝表示添加20μL细菌提取物至添加250μL终止缓冲液的持续分钟数

-l＝光路长度(在本文中为0.73cm)

-ε＝ONP的摩尔衰减系数(在本文中为4500cm²/μmol)

-Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)

对于每个样品至少测量三次，并且本文中根据测试D给出的β-半乳糖苷酶比活性值是三次独立实验的平均值。

测试E

为了测定比率，通过测试E测定本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试E]。

获得了待测定的嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在42℃下在M17+30g/L乳糖上生长3小时后，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在1.5ml冷GLCK缓冲液(5mM MgCl2，10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄[pH 7.2])中洗涤，并再悬浮于300μl冷GLCK缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmplete^TM”(罗氏公司(Roche)，供应商参考号04693132001)添加到GLCK缓冲液中。通过向250μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch,Haan,Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白质含量。细胞提取物中的葡萄糖激酶活性通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶分光光度法测定(G-6PDH，EC1.1.1.49)：NADPH耦合测定(Porter等人,1982)，本质上如Pool等人(2006)所述。将每种样品(5、10和20μL)以最终体积250μL添加至测定缓冲液(10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄[pH 7.2]、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM葡萄糖、1mM NADP、1U G-6PDH)中，并且将混合物在30℃下放置5min。通过使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司)测量340nm下的光密度5分钟。一单位的葡萄糖激酶对应于在测定条件下每分钟催化1微摩尔D-葡萄糖磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸的酶的量。葡萄糖激酶活性如下计算：

葡萄糖激酶活性(U/g总蛋白质提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：

-dOD是340nm下光密度(OD)的变化

-V是反应体积(本文中为250μL)

dt＝测量时间(以分钟计)

l＝光路长度(在本文中为0.73cm)

ε＝NADPH的摩尔衰减系数；H⁺(本文中为6220cm2/μmol)

Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)

对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试E给出的葡萄糖激酶比活性值是三次独立实验的平均值。

在一个实施例中，ccpA基因突变不是使所述基因敲除(即，完全破坏)的突变。

在一个实施例中，ccpA基因突变是ccpA基因的编码序列中，特别是ccpA基因的编码序列的前270个核苷酸中的突变。在一个实施例中，所述突变是选自由以下组成的组的突变：

a)位于ccpA基因编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变(即，产生终止密码子)；以及

b)位于ccpA基因的编码序列的前四分之一处(即，在第1个核苷酸与第250个核苷酸之间)引起ccpA基因的可读框移框的突变。

在一个实施例中，引起ccpA基因的可读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第50个核苷酸与第200个核苷酸之间。在一个实施例中，引起ccpA基因的可读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第100个核苷酸与第150个核苷酸之间。无论引起移框的突变位置是哪个，所述突变均选自由缺失、插入或缺失/插入(均不是3的倍数)组成的组。

尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的ccpA基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这两个ccpA基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是ccpA基因的突变：

-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不能获得至少为4.10^-6的编码此经修饰蛋白的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率

在本发明的意义上不被认为是突变的ccpA基因的非限制性实例是：

-如SEQ ID NO:65中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST1)；此ccpA类型是DGCC7710菌株之一；

-如SEQ ID NO:66中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST2)，所述多核苷酸与SEQ IDNO:65具有99.8％同一性；

-如SEQ ID NO:67中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST3)，所述多核苷酸与SEQ IDNO:65具有99.8％同一性；

-如SEQ ID NO:68中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST4)，所述多核苷酸与SEQ IDNO:65具有99.7％同一性；

-如SEQ ID NO:69中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST5)，所述多核苷酸与SEQ IDNO:65具有99.8％同一性；以及

-如SEQ ID NO:70中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST6)，所述多核苷酸与SEQ IDNO:65具有99.7％同一性。

本发明人已经鉴定至少一种突变，在存在于乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ccpA基因中时，该突变使得此菌株能够表现出如本文中所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6。因此，本发明涉及一种在ccpA基因中携带选自由以下组成的组的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：位于ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于ccpA基因的编码序列的前四分之一处引起ccpA基因的可读框移框的突变，其中如本文中所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6。

在一个实施例中，ccpA基因的突变是在第114-120位具有7个核苷酸A的段中核苷酸A的缺失(引起ccpA基因的可读框移框)。嗜热链球菌的此种突变的ccpA基因在本文中被称为ccpA_Δ1A114-120。

在一个实施例中，在密码子66处具有终止密码子的所述ccpA基因的序列选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:71中所定义的序列；以及

b)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的ccpA变体序列。如本文中所定义的ccpA变体携带如上文所定义的突变，即选自由以下组成的组：位于ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于ccpA的编码序列的前四分之一处引起ccpA基因的可读框移框的突变。

为了定义与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的ccpA变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算同一性[即，序列的一个或多个比对部分中相同核苷酸的数量]。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO:71具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQID NO:71的差异在于1至30个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ IDNO:71的差异在于1至20个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ IDNO:71的差异在于1至15个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ IDNO:71的差异在于1至10个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ IDNO:71的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ccpA基因的序列选自由SEQ ID NO:71、72、73、74、75和76组成的组。

在本申请的此部分中，本领域技术人员获得了关于如何鉴定除特别公开的突变以外的ccpA基因的突变的指导。基于上文所定义的比率[如本文所定义的发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率]以及本文所定义的参考菌株，本领域技术人员将知道如何鉴定根据本发明的突变的ccpA基因和获得本发明的嗜热链球菌菌株。

因此，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：

a)提供DGCC7710菌株，其中其manL基因已用如SEQ ID NO:111中所定义的突变的manL基因(编码IIAB^Man ₃₀₅蛋白质的manL基因)置换，在本文中称为DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株；

b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的ccpA基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株的ccpA基因的序列不同的ccpA，从而获得ccpA突变的DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株；

c)通过测试B测定通过步骤b)的ccpA-突变的DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株的发酵的奶的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率，其中比率大于1.2意味着突变的ccpA是根据本发明的。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的ccpA基因被认为是根据本发明的。

替代性地，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：

a)提供DGCC7710菌株，其中其manM基因已用如SEQ ID NO:157中所定义的突变的manM基因(编码IIC^Man ₂₀₈蛋白质的manM基因)置换，在本文中称为DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株；

b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的ccpA基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株的ccpA基因的序列不同的ccpA，从而获得ccpA突变的DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株；

c)通过测试B测定通过步骤b)的ccpA-突变的DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株的发酵的奶的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率，其中比率大于1.2意味着突变的ccpA是根据本发明的。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的ccpA基因被认为是根据本发明的。

本领域技术人员还可以通过以下方法进行操作：

a)提供DGCC7710菌株，其中其manN基因已用如SEQ ID NO:206中所定义的突变的manN基因(编码IID^Man ₂₈蛋白质的manN基因)置换，在本文中称为DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株；

b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的ccpA基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株的ccpA基因的序列不同的ccpA，从而获得ccpA突变的DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株；

c)通过测试B测定通过步骤b)的ccpA-突变的DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株的发酵的奶的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率，其中比率大于1.2意味着突变的ccpA是根据本发明的。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的ccpA基因被认为是根据本发明的。

鉴定后，可以引入本文所鉴定的突变的ccpA基因来代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ccpA基因，从而获得本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。

本发明的菌株的进一步表征

本发明的一部分是，当本文定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株用于通过测试B发酵奶时，其表现出释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3。此特征可以如本文所述用于设计和鉴定本发明的菌株。本发明人已经证明，当将其用于发酵奶时，表现出此比率(由于编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中的突变和glcK基因和/或ccpA基因中的突变)的菌株能够：

1)获得低乳糖发酵奶；和/或

2)即使在发酵温度下储存时，也可获得未经历后酸化的发酵奶。

因此，如果需要，除了通过测试B测定的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率，以及本文针对编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因、glcK基因和ccpA基因定义的突变之外，这2个优点可用于进一步表征本发明的菌株。

在一个实施例中，当通过测试B用于发酵奶时，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除了表现出释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3之外，特征还在于当通过测试B用于发酵奶时，其产生低乳糖发酵奶。

在一个实施例中，当通过测试B用于发酵奶时，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除了表现出释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3之外，特征还在于其产生在发酵温度下储存时未经历后酸化的发酵奶。

在一个实施例中，当通过测试B用于发酵奶时，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除了表现出释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3之外，特征还在于其产生在发酵温度(当通过测试B用于发酵奶时)下储存时未经历后酸化的低乳糖发酵奶。

表述“低乳糖发酵奶”意指在通过测试B的发酵结束时，发酵奶中含有一定量剩余乳糖的发酵奶，其小于60mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM或小于30mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度小于60mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度小于50mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度小于45mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度小于40mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度小于35mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度小于30mM。在一个实施例中，使用本发明的菌株通过测试B获得的发酵奶中剩余乳糖的浓度选自由以下组成的组：小于60mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM和小于30mM。值得注意的是，在测试B中提供的奶中的乳糖量在发酵之前约300mM(60g/L)。

表达“未经历后酸化”意指当接种本发明的菌株并通过测试B发酵时，奶产品的pH降低至酸化速度明确地变得小于0.1mUpH/min(在此定义为pH_终止)时的pH，其中所述pH_终止包括在4.6与5.3之间，并且任选地，pH 6与pH 5.5之间的斜率为至少-0.008UpH/min。

因此，在使用测试B时，不存在后酸化的特征在于发酵奶的pH值停止在4.6与5.3之间。当酸化速度(ΔpH/Δ时间)明确地变得小于0.1mUpH/min(小于0.0001UpH/min)时，认为pH终止(pH_终止)。“明确地变得”意指一旦获得pH_终止，在测试B的剩余时间内(即直到发酵温度下24h)，酸化速度保持在0.1mUpH/min。

在一个实施例中，通过测试B使用本发明的菌株获得的pH_终止包括在4.7与5.2之间。在一个实施例中，通过测试B使用本发明的菌株获得的pH_终止包括在4.8与5.1之间。在一个实施例中，通过测试B使用本发明的菌株获得的pH_终止包括在选自由4.6、4.7和4.8组成的组的最小值与选自由5.1、5.2和5.3组成的组的最大值之间。

在一个实施例中，未经历后酸化的发酵奶的特征在于pH 6和pH 5.5之间的斜率。斜率表示速度的倒数(酸化的速度)。在一个实施例中，斜率为至少-0.009UpH/min。在一个实施例中，斜率为至少-0.01UpH/min。

本发明的一些菌株的实例

本发明还涉及以下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：

-对应于DSM32587菌株(在2017年8月15日保藏在DSMZ)的菌株，其中manL基因的编码序列用SEQ ID NO:111中所示的序列(编码IIAB^Man ₃₀₅)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的manL基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于DSM32587菌株的菌株，其中manM基因的编码序列用SEQ ID NO:157中所示的序列(编码IIC^Man ₂₀₈)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的manM基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于DSM32587菌株的菌株，其中manN基因的编码序列用SEQ ID NO:206中所示的序列(编码IID^Man ₂₈)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的manN基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO:71中所示的序列(ccpA_Δ1A114-120)置换并且manL基因的编码序列用SEQ ID NO:111中所示的序列(编码IIAB^Man ₃₀₅)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的ccpA基因和相同的突变的manL基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO:71中所示的序列(ccpA_Δ1A114-120)置换并且manM基因的编码序列用SEQ ID NO:157中所示的序列(编码IIC^Man ₂₀₈)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的ccpA基因和相同的突变的manM基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO:71中所示的序列(ccpA_Δ1A114-120)置换并且manN基因的编码序列用SEQ ID NO:206中所示的序列(编码IID^Man ₂₈)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的ccpA基因和相同的突变的manN基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO:71中所示的序列(ccpA_Δ1A114-120)置换并且manL基因的编码序列用SEQ ID NO:111中所示的序列(编码IIAB^Man ₃₀₅)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的ccpA基因和相同的突变的manL基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。

-对应于DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO:71中所示的序列(ccpA_Δ1A114-120)置换并且manM基因的编码序列用SEQ ID NO:157中所示的序列(编码IIC^Man ₂₀₈)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的ccpA基因和相同的突变的manM基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2；

-对应于DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO:71中所示的序列(ccpA_Δ1A114-120)置换并且manN基因的编码序列用SEQ ID NO:206中所示的序列(编码IID^Man ₂₈)置换，及其变体；变体在本文中定义为乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其带有相同的突变的ccpA基因和相同的突变的manN基因，并且当如通过测试B测定的，将所述菌株用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。

在一个具体的实施例中，如本文中所定义的菌株变体的基因组序列与获得所述变体的菌株的基因组序列具有至少90％同一性，特别是与获得所述变体的菌株的基因组序列具有至少90％、至少91％、至少95％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.92％、至少99.94％、至少99.96％、至少99.98％或至少99.99％同一性。同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。

本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的组合物、方法和用途

本发明还涉及一种细菌组合物，其包含以下或由以下组成：至少一种、特别是一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在一个具体实施例中，所述细菌组合物是纯培养物，即包含单个细菌菌株或由其组成。在另一个实施例中，细菌组合物是混合的培养物，即包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和至少一种其他细菌菌株。“至少”(关于菌株或细菌)是指1种或多种，并且特别是1种、2种、3种、4种或5种菌株。

因此，在一个实施例中，本发明的细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和至少一种选自由以下组成的组的物种的乳酸细菌：乳球菌属(Lactococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的乳杆菌属(Lactobacillus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、片球菌属(Pediococcus)物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种、双歧杆菌属(Bifidobacterium)物种和酒球菌属(Oenococcus)物种或其任何组合。乳球菌属物种包括嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸生物突变株(Lactococcus lactis subsp.lactis biovardiacetylactis)。双歧杆菌属物种包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，特别是动物双歧杆菌乳乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp lactis)。其他乳酸细菌物种包括明串珠菌属物种、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。

在一个实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和至少一种与本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株不同的嗜热链球菌菌株和/或至少一种乳杆菌属物种的菌株和/或其任何组合。在一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株、一种或几种德氏乳杆菌保加利亚亚种物种菌株和/或一种或数种瑞士乳杆菌物种菌株和/或其任何组合，以及任选地至少一种与本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株不同的嗜热链球菌菌株。在一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株、至少一种与本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株不同的嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种物种菌株。在另一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种物种菌株。

在一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种和/或乳酸乳球菌乳脂亚种。

在本文中所定义的纯培养物或混合培养物形式的任何细菌组合物的一个具体的实施例中，细菌组合物还包含至少一种益生菌菌株，诸如动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

在特定实施例中，如上文所定义的纯培养物或混合培养物形式的细菌组合物为冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，为球粒或冷冻球粒的形式，或为粉末或干粉形式。在特定实施例中，本发明的细菌组合物是以冷冻形式或处于球粒或冷冻球粒的形式，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。在另一个实施例中，如本文定义的细菌组合物是在粉末形式下，如干燥或冷冻干燥的粉末，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。

在一个具体的实施例中，如上文所定义的纯培养物或混合培养物形式并且无论何种形式(冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，颗粒或冷冻颗粒的形式，或粉末或干粉形式)的本发明细菌组合物包含本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其浓度包含在10⁵至10¹²cfu(菌落形成单位)/克细菌组合物范围内。在一个具体的实施例中，本发明的细菌组合物内一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的浓度为10⁷至10¹²cfu/克细菌组合物，并且特别是至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰或至少10¹¹CFU/g细菌组合物。在一个具体的实施例中，当为冷冻或干燥浓缩物的形式时，细菌组合物内纯培养物或混合培养物形式的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的浓度为10⁸至10¹²cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物，并且更优选至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物。

本发明还涉及一种用于制造发酵产品的方法，所述方法包括：a)用本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株接种底物，和b)发酵所述接种的底物，以获得发酵产品。在一个具体的实施例中，将本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株以如本文中所定义的细菌组合物诸如纯培养物或混合培养物的形式接种。在一个实施例中，本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株或细菌组合物所添加的底物是奶底物。‘奶底物’是指源自动物和/或植物的奶。在一个具体的实施例中，奶底物源自动物，诸如母牛、山羊、绵羊、水牛、斑马、马、驴或骆驼等。奶可以为天然状态、复原乳、脱脂乳或补充有细菌生长或后续发酵奶处理所必需的化合物的奶。因此，在一个具体的实施例中，本发明还提供一种用于制造发酵乳产品的方法，所述方法包括：a)用本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或细菌组合物接种奶底物，和b)发酵所述接种的奶底物，以获得发酵乳产品。

本发明还涉及本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或本发明的组合物制造发酵乳产品的用途。

本发明还涉及一种发酵乳产品，其使用本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或本发明的细菌组合物获得，特别是通过或可通过本发明的方法获得。因此，本发明涉及一种发酵乳产品，其包含本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在一个具体实施例中，本发明的发酵乳食物产品是新鲜发酵奶。在一个具体的实施例中，本发明的发酵乳产品，特别是如本文中所定义的新鲜发酵奶含有如本文中所定义的于2017年8月15日保藏在DSMZ的DSM32587菌株或其任何变体。

蛋白质、核酸、载体、构建体及其用途

本发明涉及一种编码嗜热链球菌葡萄糖激酶的多核苷酸，所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物(即，其glcK基因已被待测定的glcK多核苷酸置换的DGCC7710菌株)中确定了被降低但不为零的葡萄糖激酶活性。为了测试编码葡萄糖激酶的多核苷酸满足在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的葡萄糖激酶活性特征，用编码待测定的嗜热链球菌葡萄糖激酶的glcK基因置换DGCC7710菌株的glcK基因，获得DGCC7710的衍生物，并通过测试A测定所述DGCC7710衍生物(参见实例4)。

当出现如下情形时，嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)满足在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的葡萄糖激酶活性特征：

a)如通过测试A测定的，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物，如通过测试A测定的，特别是300U/g至1200U/g或400U/g至1000U/g总蛋白质提取物，或

b)当均通过测试A测定时，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％，特别是DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％或15％至40％，其中所述DG7710衍生物中的葡萄糖激酶活性和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性通过测试A测定。

在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为300U/g至1200U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为400U/g至1000U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A测定的，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为选自由200U/g、300U/g和400U/g总蛋白质提取物组成的组的最小值至选自由1000U/g、1200U/g和1500U/g总蛋白质提取物组成的组的最大值。值得注意的是，如测试A中所述，本文公开的葡萄糖激酶活性值是三个独立实验(一式三份)的平均值。

在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的葡萄糖激酶活性是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％的活性。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性”是指DGCC7710菌株中通过测试A测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQ ID NO:2)的活性[即，使用DGCC7710菌株进行测试A]。百分比值是根据DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性计算的，两个葡萄糖激酶活性均通过测试A测定。

在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为菌株DGCC7710的葡萄糖激酶活性的15％至40％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。在一个具体的实施例中，并且无论百分比范围如何，均通过本文所述的测试A在DGCC7710衍生物中测定嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性。值得注意的是，本文公开的百分比值是根据葡萄糖激酶活性值计算的，所述葡萄糖激酶活性值是通过测试A测定的三个独立实验(一式三份)的平均值。

特征“DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”还可以用在DGCC7710衍生物中，葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)或葡萄糖激酶对其底物即葡萄糖和ATP中的一种或两种的亲和力(称为Km)来表征。在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的特征“DGCC7710衍生物中被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性”还可以用DGCC7710衍生物中此葡萄糖激酶的最大正向速度来表征。

因此，与本文中定义的特征“DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的实施例组合，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零。为了测试葡萄糖激酶满足在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的Vmax特征，用编码待测定的嗜热链球菌葡萄糖激酶的glcK基因的可读框(即，本发明的多核苷酸)置换DGCC7710菌株的glcK基因的可读框，获得DGCC7710的衍生物，并通过测试C测定所述DGCC7710衍生物(参见实例4)。表述“DGCC7710衍生物”如上文所定义。

葡萄糖激酶的Vmax的“在DGCC7710衍生物中被显著降低但不为零”特征可以由这些参数中的一个或两个定义：

-如通过测试C测定的，DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物；

-当均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。

在一个具体的实施例中，本发明涉及编码嗜热链球菌葡萄糖激酶的多核苷酸，DGCC7710衍生物中葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且其中DGCC7710衍生物中所述葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零，并由以下这些参数中的一个或两个定义：

-如通过测试C测定的，DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物；

-当均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。

在一个具体的实施例中，如通过测试C测定的，DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为200U/g至1500U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C测定的，DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为300U/g至1200U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为400U/g至1000U/g总蛋白质提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C测定的，DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为选自由200U/g、300U/g和400U/g总蛋白质提取物组成的组的最小值至选自由1000U/g、1200U/g和1500U/g总蛋白质提取物组成的组的最大值。

在一个具体的实施例中，在均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的10％至50％。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax”是指DGCC7710菌株中通过测试C测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQ ID NO:2)的Vmax[即，使用DGCC7710菌株进行测试C]。百分比值是根据DGCC7710衍生物中嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax计算的，两个Vmax均通过测试C测定。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的15％至40％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。

在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第275位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有不是谷氨酸的氨基酸(即是除谷氨酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第275位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有不是酸性氨基酸的氨基酸(即是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第275位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第275位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有是赖氨酸的氨基酸。在一个具体的实施例中，本发明的多核苷酸编码长度为322个氨基酸的嗜热链球菌。

在另一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第144位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有不是甘氨酸的氨基酸(即是除甘氨酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第144位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有不是脂族氨基酸的氨基酸(即是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第144位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的嗜热链球菌葡萄糖激酶，其序列在其第144位(基于如SEQ ID NO:25中所定义的序列编号)具有是丝氨酸的氨基酸。在一个具体的实施例中，本发明的多核苷酸编码长度为322个氨基酸的嗜热链球菌葡萄糖激酶。

在一个具体的实施例中，编码在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的嗜热链球菌葡萄糖激酶的本发明的多核苷酸选自由以下组成的组：

a)如SEQ ID NO:25中所定义的序列，其中第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸；以及

b)与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。在一个实施例中，所述GlcK变体在其第278位具有精氨酸和/或在其第279位具有丝氨酸。

c)如SEQ ID NO:46中所定义的序列，其中第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸；以及

d)与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。

为了定义与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO:25中所定义的第275位不考虑用于计算相似性或同一性。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％相似性或同一性，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。

在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸(第275位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:25的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO:25的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO:25的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO:25的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。

在一个具体的实施例中，嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的序列选自由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组，其中所述变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是谷氨酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是酸性氨基酸。在一个具体的实施例中，作为SEQID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ IDNO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:25或本文所定义的与SEQ ID NO:25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是赖氨酸；因此，在一个具体的实施例中，嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的序列选自由SEQ ID NO:22、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组。

为了定义与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO:46中所定义的第144位不考虑用于计算相似性或同一性。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性或同一性，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。

在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸(第144位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO:46的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO:46的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO:46的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO:46的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。

在一个具体的实施例中，嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的序列选自由SEQ ID NO:46、47、48、49、50、51、52、53、54和55组成的组，其中所述变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是甘氨酸。

在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是脂族氨基酸。在一个具体的实施例中，作为SEQID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ IDNO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO:46或本文所定义的与SEQ ID NO:46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO:46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是丝氨酸；因此，在一个具体的实施例中，嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的序列选自由SEQ ID NO:45、56、57、58、59、60、61、62、63和64组成的组。

在定义嗜热链球菌葡萄糖激酶(由本发明的多核苷酸编码)的序列时，根据本申请的教导，表达此葡萄糖激酶的DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地DGCC7710衍生物中此葡萄糖激酶的Vmax如本文中所定义被显著降低但不为零。

本发明还涉及一种编码322个氨基酸的葡萄糖激酶的多核苷酸。在一个具体的实施例中，所述多核苷酸来自嗜热链球菌菌株。基于遗传密码，本领域技术人员知道多核苷酸是否编码如本文中所定义的嗜热链球菌葡萄糖激酶。在一个具体的实施例中，当编码的葡萄糖激酶的长度为322个氨基酸时，本发明的多核苷酸的长度为969个核苷酸。

本发明的多核苷酸的非限制性实例公开于SEQ ID NO:21中。本发明的多核苷酸的另一个非限制性实例公开于SEQ ID NO:44中。本发明的多核苷酸的其他非限制性实例是如SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中所定义的序列，但是其中第144个密码子或第275个密码子分别编码除甘氨酸或谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是分别编码除脂族或酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是分别编码丝氨酸或赖氨酸。特别地，本发明的多核苷酸的非限制性实例是如SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中所定义的序列，但是其中第275个密码子是AAA或AAG。特别地，本发明的多核苷酸的非限制性实例是如SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中所定义的序列，但是其中第144个密码子是AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。

本发明还涉及本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)用于设计细菌细胞，特别是革兰氏阳性细菌细胞，特别是嗜热链球菌细胞的用途。在一个具体的实施例中，使用本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)置换嗜热链球菌菌株的glcK基因，使得嗜热链球菌菌株表达如本文中所定义的葡萄糖激酶。在一个具体的实施例中，由所述获得的嗜热链球菌表达的唯一葡萄糖激酶是如本文中所定义的葡萄糖激酶。在一个具体的实施例中，使用本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)置换乳糖阳性嗜热链球菌菌株的glcK基因。在一个实施例中，使用本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)置换乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的glcK基因。

本发明还涉及一种如上文所定义或鉴定的(突变的)嗜热链球菌ccpA多核苷酸。在一个实施例中，本发明还涉及一种选自由以下组成的组的(突变的)嗜热链球菌ccpA多核苷酸：

a)ccpA多核苷酸，当其代替DGCC7710菌株的ccpA基因插入时，产生表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为如本文中所定义的至少4.10^-6的DGCC7710衍生物。

b)ccpA多核苷酸，当代替先前已经用如SEQ ID NO:111中所定义的manL基因置换了manL基因的DGCC7710菌株(即，DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株)的ccpA基因插入时，产生DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅衍生物，当如通过测试B测定的，将其用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2、大于2.5或大于3

c)ccpA多核苷酸，当代替先前已经用如SEQ ID NO:157中所定义的manM基因置换了manM基因的DGCC7710菌株(即，DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株)的ccpA基因插入时，产生DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈衍生物，当如通过测试B测定的，将其用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2、大于2.5或大于3；

d)ccpA多核苷酸，当代替先前已经用如SEQ ID NO:206中所定义的manN基因置换了manN基因的DGCC7710菌株(即，DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株)的ccpA基因插入时，产生DGCC7710-IID^Man ₂₈衍生物，当如通过测试B测定的，将其用于发酵奶时，所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2、大于2.5或大于3。

对于b)至d)的任何一个，DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅衍生物、DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈衍生物或DGCC7710-IID^Man ₂₈衍生物的特征可以进一步在于其表现出如本文中所定义的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10^-6。

在本上下文中，当适用于DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株、DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株和DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株时，术语“衍生物”意指DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株、DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株和DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株，其中原始ccpA基因(DGCC7710菌株之一)已用待测定的突变的ccpA基因置换。

在本上下文中，DGCC7710-IIAB^Man ₃₀₅菌株意指用如SEQ ID NO:111中所定义的manL基因置换了其manL基因的DGCC7710菌株。类似地，DGCC7710-IIC^Man ₂₀₈菌株意指用如SEQ IDNO:157中所定义的manM基因置换了其manM基因的DGCC7710菌株。类似地，DGCC7710-IID^Man ₂₈菌株意指用如SEQ ID NO:206中所定义的manN基因置换了其manN基因的DGCC7710菌株。

在一个实施例中，突变的ccpA多核苷酸不是ccpA基因的敲除等位基因(即，破坏的等位基因)。

在一个实施例中，ccpA基因突变是ccpA基因的编码序列中，特别是ccpA基因的编码序列的前270个核苷酸中的突变。在一个实施例中，所述突变是选自由以下组成的组的突变：

a)位于ccpA基因编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变(即，产生终止密码子)；以及

b)位于ccpA基因的编码序列的前四分之一处(即，在第1个核苷酸与第250个核苷酸之间)引起ccpA基因的可读框移框的突变。

在一个实施例中，引起ccpA基因的可读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第50个核苷酸与第200个核苷酸之间。在一个实施例中，引起ccpA基因的可读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第100个核苷酸与第150个核苷酸之间。无论引起移框的突变位置是哪个，所述突变均选自由缺失、插入或缺失/插入(均不是3的倍数)组成的组。

在一个实施例中，突变的ccpA多核苷酸的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ IDNO:71中所定义的序列；以及b)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的ccpA变体序列。具有至少90％同一性的ccpA变体的定义详见第III段。以上ccpA基因的突变。

如本文所定义的(突变的)glcK多核苷酸[编码如本文所定义的突变的嗜热链球菌葡萄糖激酶]和如本文所定义的(突变的)ccpA多核苷酸可用于设计嗜热链球菌菌株，特别是乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。所述用途在于用如本文中所定义的突变的glcK多核苷酸和/或突变的ccpA多核苷酸取代原始嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因，以设计一个或多个原始基因用如本文中所定义的一个或多个(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。本发明还涉及一种设计嗜热链球菌菌株的方法，其包括：1)用如本文中所定义的突变的glcK多核苷酸和/或突变的ccpA多核苷酸取代原始嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因，和2)获得一个或多个原始基因用如本文中所定义的一个或多个(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。

在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株在至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中，特别是在其如本文所定义的manL基因、其manM基因和/或其manN基因中携带突变；因此，通过如本文所定义的突变的glcK多核苷酸和/或突变的ccpA多核苷酸取代此原始嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因将产生本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在所述用途或所述方法的另一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中不携带突变；因此，通过如本文所定义的突变的glcK多核苷酸和/或突变的ccpA多核苷酸取代此原始嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因将产生中间乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其可用作起始菌株来使至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因和/或manN基因突变，以设计本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。

本发明还涉及编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的突变的基因(或多核苷酸)，特别是突变的manL基因、突变的manM基因或突变的manN基因设计嗜热链球菌菌株，特别是乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的用途。在一个实施例中，所述用途在于分别用如本文中所定义的突变的manL、manM或manN多核苷酸取代[或置换]原始嗜热链球菌菌株的manL基因、manM基因或manN基因，以设计原始基因用如本文中所定义的(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。“分别”是指用突变的manL置换原始manL，用突变的manM置换原始manM和/或用突变的manN置换原始manN。本发明还涉及一种设计嗜热链球菌菌株的方法，所述方法包括：1)分别用如本文中所定义的突变的manL、manM或manN多核苷酸取代[或置换]原始嗜热链球菌菌株的manL基因、manM基因或manN基因，和2)获得原始基因用如本文中所定义的(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。

在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株携带其glcK基因中的突变。在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株携带其ccpA基因中的突变。在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株携带其glcK基因中的突变和其ccpA基因中的突变。本发明的目的是，原始嗜热链球菌菌株[携带其glcK基因中的突变和/或其ccpA基因中的突变]中的manL基因、manM基因或manN基因分别取代为如本文所定义的突变的manL、manM或manN多核苷酸，将产生如本发明所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，即表现出释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2、大于1.5、大于2或大于3的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。

在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株携带如以上部分I所定义的其glcK基因中的突变。在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株携带如以上部分III所定义的其ccpA基因中的突变。在所述用途或所述方法的一个实施例中，所述原始嗜热链球菌菌株携带如以上部分I所定义的其glcK基因中的突变和如以上部分III所定义的其ccpA基因中的突变。

在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因分别编码IIAB^Man蛋白质、IIC^Man蛋白质或IID^Man蛋白质，其葡萄糖输入活性被降低或消除。

在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的特征在于，当代替DSM32587菌株的manL基因、manM基因或manN基因单独插入时：

-当如通过测试B测定的，将DSM32587衍生物用于发酵奶时，其表现出所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的manL、manM或manN基因被认为是根据本发明的。

在此上下文中，当适用于DSM32587菌株时，术语“衍生物”意指DSM32587菌株，其中原始manL、manM或manN基因已用待测定的突变的manL、manM或manN基因置换。

在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的特征在于，当代替先前已经用如SEQ ID NO:71中所定义的ccpA基因置换了ccpA基因的DGCC7710菌株(即，DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株)的manL基因、manM基因或manN基因单独插入时：

-当如通过测试B测定的，将DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120衍生物用于发酵奶时，其表现出所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。在一个具体的实施例中，当所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2或大于3时，突变的manL、manM或manN基因被认为是根据本发明的。

在此上下文中，当适用于DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株时，表述“DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120衍生物”意指DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株，其中原始manL、manM或manN基因已用待测定的突变的manL、manM或manN基因置换。在本上下文中，DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株是ccpA基因先前用如SEQ ID NO:71中所定义的ccpA基因置换的DGCC7710菌株。

“单独插入”是指为了表征突变的man基因，将DSM32587菌株或DGCC7710-ccpA_Δ1A114-120菌株的仅一个man基因用待表征的各自的突变man基因置换(或取代)。

在一个实施例中，突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因是突变的manL基因。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL编码嗜热链球菌IIAB^Man蛋白质，其葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是在第305位被截短的嗜热链球菌IIAB^Man蛋白质(IIAB^Man ₃₀₅)。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL编码截短的嗜热链球菌IIAB^Man蛋白质，其序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO:112中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO:112具有至少90％相似性或同一性的IIAB变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的manL基因编码IIAB^Man蛋白，其序列选自由SEQ ID NO:112至128组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因如SEQ ID NO:111中所定义。表述“具有至少90％相似性或同一性的IIAB^Man变体”如II中所定义。编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是以上manL、manM和manN基因的突变。

在一个实施例中，突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因是突变的manM基因。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manM编码嗜热链球菌IIC^Man蛋白质，其葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是在第208位被截短的嗜热链球菌IIC^Man蛋白质(IIC^Man ₂₀₈)。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manM编码截短的嗜热链球菌IIC^Man蛋白质，其序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO:158中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO:158具有至少90％相似性或同一性的IIC^Man变体序列，特别是长度为208个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的manM基因编码IIC^Man蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:158至165组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manM基因如SEQ ID NO:157中所定义。表述“具有至少90％相似性或同一性的IIC^Man变体”如II中所定义。编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是以上manL、manM和manN基因的突变。

在一个实施例中，突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因是突变的manN基因。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN编码嗜热链球菌IID^Man蛋白质，其葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是在第28位被截短的嗜热链球菌IID^Man蛋白质(IID^Man ₂₈)。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN编码截短的嗜热链球菌IID^Man蛋白质，其序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO:207中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO:207具有至少90％相似性或同一性的IID^Man变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的manN基因编码IID^Man蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:207至211组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN基因如SEQ ID NO:206中所定义。表述“具有至少90％相似性或同一性的IID^Man变体”如II中所定义。编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是以上manL、manM和manN基因的突变。

在一个实施例中，提供分离形式的如本文中所定义的多核苷酸。“分离”的多核苷酸基本上或本质上不含如在所述基因天然存在环境中发现的通常与其相伴或相互作用的组分。因此，分离的多核苷酸基本上不含其他细胞物质，或当通过重组技术产生时基本上不含培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。

本发明还涉及包含如本文中所定义的多核苷酸的构建体。在一个实施例中，本发明涵盖一种构建体，其包含有效地连接至调控序列的本发明的多核苷酸。术语“有效地连接”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。调控序列“有效地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。术语“调控序列”包括启动子和/或增强子以及其他表达调控信号。术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。在一个实施例中，构建体独立地或以与“调控序列”实施例组合的方式含有或表达另一种基因，诸如允许选择所述构建体的标记物。存在可以使用的各种标记物，例如提供抗生素抗性，例如对细菌抗生素(诸如红霉素(Erythromycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、链霉素(Streptomycin)和四环素(Tetracycline))的抗性的那些标记物。

因此，在另一方面，提供了一种包含如本文中所定义的多核苷酸或构建体的载体。如本文所用，术语“载体”是指如下任何核酸分子，可以将另一种核酸(例如，本发明的多核苷酸)插入所述核酸分子中，并且可以将其引入细菌菌株诸如嗜热链球菌菌株中并在所述菌株中复制。因此，所述术语是指能够用于将遗传物质引入细菌菌株，特别是嗜热链球菌菌株中的任何核酸构建体(和需要时任何相关的递送系统)。适当载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。在一个实施例中，载体是质粒。如本文所用，术语“质粒”是指可以用作将DNA引入细菌菌株，特别是嗜热链球菌菌株中的载体的环状双链(ds)DNA构建体。可以将构建体或载体引入本文所述的细菌菌株，诸如DGCC7710菌株中。

可以使用任何可用方法将本文公开的本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中。

“引入”(和“引入的”)旨在指以某种方式向嗜热链球菌菌株呈递如本文中所定义的本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒，以使得一种或多种组分能进入嗜热链球菌菌株的内部。所述方法和组合物不依赖于将序列引入嗜热链球菌菌株中的具体方法，只要本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒能够进入嗜热链球菌菌株的内部。引入包括将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒掺入嗜热链球菌菌株中，其中可以将本发明的多核苷酸或构建体掺入嗜热链球菌菌株的基因组中，并且包括瞬时(直接)提供嗜热链球菌菌株的多核苷酸或构建体。

将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中可以通过几种方法进行，包括转化、缀合、转导或原生质体融合。用于通过转化向嗜热链球菌菌株中引入本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒的方法包括但不限于显微注射、电穿孔、稳定的转化方法、短暂转化方法[诸如使用化学(例如，二价阳离子诸如CaCl₂)或机械(电穿孔)手段诱导感受态]、弹道粒子加速(粒子轰击)、直接基因转移、病毒介导的引入、细胞穿透肽或介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)介导的直接蛋白质递送。可以通过缀合将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中，所述方法是需要细胞与细胞物理接触的天然DNA交换的特定方法。可以通过转导将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中，所述方法是通过病毒(例如，噬菌体)感染引入DNA，这也是DNA交换的天然方法。通常，此类方法涉及将多核苷酸掺入病毒DNA或RNA分子内。

本发明还涉及以下突变的man基因自身及其相应的编码蛋白质：

-突变的嗜热链球菌manL，其编码嗜热链球菌的截短的IIAB^Man蛋白质，其序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO:112中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO:112具有至少90％相似性或同一性的IIAB变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因编码IIAB^Man蛋白质，其序列选自由SEQ ID NO:112至128组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因如SEQ ID NO:111中所定义。

-突变的嗜热链球菌manN，其编码嗜热链球菌的截短的IID^Man蛋白质，其序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO:207中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO:207具有至少90％相似性或同一性的IID^Man变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN基因编码IID^Man蛋白，其序列选自由SEQ ID NO:207至211组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN基因如SEQ ID NO:206中所定义。

表述“具有至少90％相似性或同一性的IIAB^Man变体和IID^Man变体”如II中所定义。编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因的突变，特别是以上manL和manN基因的突变。

本发明还涉及一种设计乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的方法：

a)提供乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其携带编码葡萄糖激酶的glcK基因，所述酶的活性如本文所定义的被降低但不为零，并且任选地携带突变的ccpA基因；

b)突变至少一种、特别是一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因和/或manN基因；以及

c)选择乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，当如通过测试B测定的，将其用于发酵奶时，表现出所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。

在一个实施例中，当通过测试B测定时，在步骤c)中选择的菌株表现出在所述发酵奶中的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2、大于2.5或大于3。

在一个实施例中，至少一种编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因，特别是manL、manM或manN基因被突变，诸如编码蛋白质，特别是截短的蛋白质，其葡萄糖输入活性被降低或消除。

本发明还涉及一种设计乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的方法：

a)提供乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其携带至少一种、特别是一种编码至少一种突变的甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质(特别是一种蛋白质)、特别是突变的IIAB^Man蛋白质、特别是突变的IIC^Man蛋白质和/或突变的IID^Man蛋白质的基因，所述蛋白质的葡萄糖输入活性被降低或消除；

b)突变编码葡萄糖激酶的glcK基因，所述酶的活性如本文所定义的被降低但不为零，和/或突变ccpA基因；

c)选择乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，当如通过测试B测定的，将其用于发酵奶时，表现出所述发酵奶中释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.2。

在一个实施例中，当通过测试B测定时，在步骤c)中选择的菌株表现出在所述发酵奶中的释放的半乳糖量(mM)相对于剩余乳糖量(mM)的比率大于1.5、大于2、大于2.5或大于3。

在一个实施例中，编码突变的甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质(其葡萄糖输入活性被降低或消除)的基因编码截短的蛋白质，特别是截短的IIAB^Man蛋白质、截短的IIC^Man蛋白质或截短的IID^Man蛋白质。

在以上定义的2种方法的一个实施例中，该方法进一步包括：

d)选择菌株，当通过测试B用于发酵奶时，其提供低乳糖发酵奶，特别是其剩余乳糖量小于60mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM或小于30mM的发酵奶，

在以上定义的2种方法的一个实施例中，该方法进一步包括

d)选择菌株，当接种至通过测试B发酵的奶时，奶的pH降低至酸化速度明确地变得小于0.1mUpH/min时的pH，其中所述pH_终止包括在4.6与5.3之间，并且任选地，pH 6与pH 5.5之间的斜率为至少-0.008UpH/min。在一个实施例中，当pH_终止包括在选自由4.6、4.7和4.8组成的组的最小值与选自由5.1、5.2和5.3组成的组的最大值之间时，选择菌株。在一个实施例中，当pH 6与pH 5.5之间的斜率为至少0.009或至少0.01UpH/min时，选择菌株。

---------------

现在，通过非限制性实例的方式来描述本发明的各种优选特征和实施例。

材料和方法

菌株和生长条件

使本申请中公开的嗜热链球菌菌株(ST)在37℃下在M17肉汤(公司，供应商参考号CM0817)中生长，所述肉汤中添加有30g/L适当碳水化合物，并且必要时添加15g/L的细菌琼脂A型(博尔卡公司(Biokar)，供应商参考号A1010HA)，或在43℃下在奶(UHT半脱脂奶“Le Petit Vendéen”+3％奶粉(BBA公司，兰特黎斯公司)中生长。向高压灭菌的M17肉汤中添加0.2μm过滤的乳糖、蔗糖、半乳糖或葡萄糖。通过在补充有5g/L乳糖和10％甘油的M17中半稀释过夜培养物获得ST菌株的冷冻储液，并储存在-20℃下。

奶发酵期间碳水化合物分解代谢的定量[测试B]

以1％(v/v，约10⁷CFU/ml)用待测定的嗜热链球菌菌株的培养物(来自在补充有3％蔗糖的M17中生长的过夜培养物的无碳水化合物M17再悬浮细胞)接种预先在90℃下巴氏灭菌10min的含有3％(w/v)奶粉(BBA公司，兰特黎斯公司(Lactalis))的UHT半脱脂奶“LePetit Vendéen”(“酸奶”)。发现此奶含有约175mM乳糖。将接种的奶瓶在43℃的水浴中静置孵育24h，获得发酵奶。

将T0样品和发酵奶(T24h)样品(5g)在25g 0.025N H₂SO₄中稀释，随后在4℃下以4600rpm离心10分钟。将上清液通过0.2μm尼龙滤膜(德国阿沙芬堡的菲罗门公司)直接过滤到2ml HPLC小瓶中。将样品储存在-20℃下直至进一步分析。在35℃下，通过配备有折射率检测器的高效液相色谱(安捷伦(Agilent)1200HPLC)，使用Aminex HPX-87H阴离子交换柱(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories Inc.))，使用12.5mM H₂SO₄作为洗脱液和0.6mlmin^-1的流速对碳水化合物进行定量。用Chemstation再处理软件(安捷伦公司)进行结果的开发。

glcK测序

使用引物GlcK-F4(5’-CAGGTATGAGTTTAGCAACGG-3’)和GlcK-R12(5’-ATTCACCACGGCCTGAGAC-3’)进行葡萄糖激酶基因的PCR扩增，[在98℃下进行孵育步骤，5min，随后进行33个98℃，45s；58℃，30s；68℃，3min的循环，在72℃下进行最终延伸步骤7min]。然后根据制造商的说明(通用医疗公司(GE Healthcare))用Illustra^TMExoProStar^TM处理2788bp的PCR产物。通过使用Terminator v3.1循环测序试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))，根据制造商的说明，使用AB3500(Applied Biosystems^TM)和表2中列出的引物进行测序反应。

引物	序列
		GlcK-F4	CAGGTATGAGTTTAGCAACGG
GlcK-R8	AGTTCAATCTTCATCATCTCG
		GlcK-F5	GTAGCCACATTGTTCCTGAC
GlcK-R6	TTGCTGAAGCTACAGTTTCC
		GlcK-R4	TAAGCAAGACTAGCAGCTCC
GlcK-F7	TTGCGTAGTCGTGTTGAAGG
		GlcK-R10	ATTGTCCCTTCATAAGCATCG
GlcK-F11	CGAACTGGGTGCAGATGATG
		GlcK-R12	ATTCACCACGGCCTGAGAC

表2：用于glcK测序的引物的清单。

葡萄糖激酶活性[测试A]

获得了嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在0.8的600nm光密度(OD600)时，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在5ml冷GLCK缓冲液(5mM MgCl2，10mMK₂HPO₄/KH₂PO₄[pH 7.2])中洗涤，并再悬浮于500μl冷GLCK缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmplete^TM”(罗氏公司，供应商参考号04693132001)添加到GLCK缓冲液中。通过向200μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch,Haan,Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白质含量。细胞提取物中的葡萄糖激酶活性通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶分光光度法测定(G-6PDH，EC1.1.1.49)：NADPH耦合测定(Porter等人,1982)，本质上如Pool等人(2006)所述。将每种样品(5、10和20μL)以最终体积250μL添加至测定缓冲液(10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄[pH 7.2]、5mM MgCl2、1mMATP、20mM葡萄糖、1mM NADP、1U G-6PDH)中，并且将混合物在30℃下放置5min。通过使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司)测量340nm下的光密度5分钟。一单位的葡萄糖激酶对应于在测定条件下每分钟催化1微摩尔D-葡萄糖磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸的酶的量。葡萄糖激酶活性如下计算：

葡萄糖激酶活性(U/g总蛋白质提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：

-dOD是340nm下光密度(OD)的变化

-V是反应体积(本文中为250μL)

dt＝测量时间(以分钟计)

l＝光路长度(在本文中为0.73cm)

ε＝NADPH的摩尔衰减系数；H⁺(本文中为6220cm2/μmol)

Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)

对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试A给出的葡萄糖激酶比活性值是三次独立实验的平均值。

GlcK的最大正向速度[测试C]

通过对如“葡萄糖激酶活性”(测试A)中所述制备的粗提取物使用各种葡萄糖浓度(0、5、10、15、20mM)来确定GlcK的最大正向速度(Vmax)。对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试C给出的Vmax值是三次独立实验的平均值。呈现出比速度倒数随葡萄糖浓度倒数的变化的线性回归给出了与图形Y轴相交处的最大正向速度的倒数。

奶酸化性能

在如测试B中所述的奶发酵期间，通过记录随时间变化的pH来评估嗜热链球菌菌株的酸化特性。如前所述使用CINAC系统(法国爱利安斯仪器公司(Alliance Instruments,France)；pH电极Mettler 405DPAS SC，托莱多，西班牙)监测pH达24小时。每5分钟测量并记录一次pH。使用CINAC v2.07软件，计算pH 6.0与pH 5.5(UpH/分钟)之间的斜率[斜率pH 6-5.5]。

ST0菌株的glcK等位基因转移至其他3个嗜热链球菌菌株的基因组中

使用引物GlcK-F1(5’-GAAGCAGTTTGGGGTAGTAG-3’)和GlcK-R2(5’-GAGTTATCTACAGGAGCTGG-3’)获得带有ST0菌株的glcK基因的1889bp PCR产物。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化PCR产物，并在无RNA酶的水中洗脱。使用NanoDrop 2000分光光度计(马萨诸塞州威尔明顿的赛默科技公司(Thermo Scientific,Wilmington,MA))确定PCR产物的浓度。通过基于凝胶的毛细管电泳系统(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen,Hilden,Germany))验证PCR产物的大小和纯度。用1889bp PCR产物转化菌株DGCC7710 ST1.1和ST1.2，并选择glcK基因被ST0菌株的glcK等位基因置换的突变体(通过测序检查ST0菌株的glcK等位基因是否存在)。

结果

实例1：嗜热链球菌集合中葡萄糖分泌菌株的筛选

本申请的发明人为了选择分泌葡萄糖的菌株，使用了另一种方法。通过测试B筛选嗜热链球菌集合中能够在发酵奶中分泌葡萄糖的菌株。使用10mM的量的葡萄糖作为选择的最小阈值。选择了一种菌株ST0，使用测试B，其在发酵奶中释放了30mM葡萄糖。

实例2.鉴定glcK基因中的突变

对ST0菌株中已知参与嗜热链球菌中碳水化合物的分解代谢的几种基因进行测序，并且与我们的集合中其他嗜热链球菌的相应基因序列比对。

在ST0菌株的GlcK序列中鉴定到非保守性氨基酸差异E275K，所述差异在所述集合中其他嗜热链球菌菌株的任何GlcK序列中均未发现；此氨基酸差异是glcK基因第823位A代替G的结果。其他嗜热链球菌菌株的glcK基因编码的葡萄糖激酶的其他比较证实，第275位的赖氨酸(代替谷氨酸)是ST0特有的，并且在107个其他菌株中的任一个中均未发现。

表3中呈现出从这108个菌株引出的葡萄糖激酶中鉴定出的其他氨基酸差异。因此，可以区分出10种不同的葡萄糖激酶类型(如分别在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20中所阐述的GlcK 1型至GlcK10型)。对于后续实验，选择了10个菌株ST1至ST10，所述菌株各自表达独特的葡萄糖激酶。将SEQ ID NO:2用作参考序列，因为在108个所分析菌株的约70％中发现了此GlcK类型。特别地，2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株编码如SEQ ID NO:2中所定义的葡萄糖激酶。值得注意的是，由ST0菌株编码的葡萄糖激酶序列与SEQ ID NO:2之间的唯一氨基酸差异是第275位的氨基酸差异。

表3：通过比较由108个嗜热链球菌编码的GlcK蛋白序列与由ST0编码的GlcK蛋白序列鉴定的GlcK蛋白差异。列出的氨基酸位置指示了GlcK蛋白质之间的所有氨基酸差异。选择来自ST1的GlcK蛋白质序列(SEQ ID NO:2)作为参考序列。此表中未列出的氨基酸位置对于此研究的所有葡萄糖激酶是相同的。“aa diff”栏给出了与SEQ ID NO:2相比的氨基酸差异数。“％id”栏给出了与SEQ ID NO:2的同一性百分比

实例3.ST0菌株的葡萄糖激酶活性的测量以及与其他菌株(ST1至ST10)的比较

使用测试A将ST0菌株的葡萄糖激酶活性与如实例2中报道选择的ST1至ST10菌株的葡萄糖激酶活性比较。结果总结在下表4中。

表4：11个菌株的葡萄糖激酶比活性：10个菌株，ST1至ST10，每一个表示不同的GlcK蛋白质变体，和实例1中鉴定的ST0；ND:未确定

这些数据显示，如通过测试A测定的，菌株ST1至ST10的葡萄糖激酶活性为2014U/g至2791U/g总蛋白质提取物。高于1800U/g总蛋白质提取物的葡萄糖激酶活性被认为表示正常的葡萄糖激酶活性。DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性被认为是参考葡萄糖激酶活性(因为表达最常见的GlcK类型，所述类型被定义为SEQ ID NO:2)。

相反，如通过测试A测定的，表达第275位带有赖氨酸的GlcK蛋白质的ST0菌株的葡萄糖激酶活性为约977U/g总蛋白质提取物，即比DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性低约3倍(35％)。

这些数据显示，本发明人保留的方法能够首次选择表达葡萄糖激酶的半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述葡萄糖激酶的活性被显著降低但不为零。

实例4：比较DGCC7710菌株、带有E275K差异的DGCC7710衍生物和带有零葡萄糖激酶氨基酸改变的DGCC7710的半乳糖阳性变体的葡萄糖激酶活性、Vmax和Km

设计了DGCC7710菌株的衍生物，其中glcK基因编码第275位的谷氨酸(E)被氨基酸赖氨酸(K)置换的葡萄糖激酶。此衍生物(DGCC12534)在2017年8月15日以保藏号DSM32587保藏在DSMZ。其GlcK蛋白质的序列如SEQ ID NO:22中所定义。

同时，产生了DGCC7710的突变体，其中第72位的丝氨酸(S)用脯氨酸(P)置换，从而得到具有如SEQ ID NO:23中所定义的序列的GlcK蛋白[S72P氨基酸取代；在申请WO 2013/160413的菌株DSM25851中报道]。由于S72P氨基酸取代产生零葡萄糖激酶活性(即，不能通过葡萄糖激酶使用葡萄糖的菌株)，所以所述突变体先前被赋予半乳糖阳性(以便能够使用半乳糖，因为表现出零葡萄糖激酶活性的半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在乳糖上预期是不可行的)。因此，预先根据申请WO 2011/026863使DGCC7710菌株的gal操纵子启动子突变，得到具有如SEQ NO:24中所定义的序列的gal操纵子启动子。获得了在GlcK蛋白质中带有S72P氨基酸取代的半乳糖阳性突变体，并称为ST1m-glcK0-gal+。

图1中公开了DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶蛋白质序列的比对。

如材料和方法中所述测定DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶活性、葡萄糖激酶的Vmax和Km。

获得的结果公开于表5和6中。

表5：DGCC7710菌株以及DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株中的葡萄糖激酶比活性和与DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性相比的活性％

表6：DGCC7710菌株以及DSM32587和ST1m0gal+菌株的葡萄糖激酶的Vmax、与DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax相比的葡萄糖激酶Vmax％以及DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶的Km活性；ND：未确定。

表5的数据很好地显示，在DGCC7710衍生物(DSM32587)中，仅用赖氨酸(K)置换GlcK蛋白质第275位的谷氨酸(E)就足以将葡萄糖激酶活性从2756U/g显著降至907U/g(即，DGCC7710活性的33％)。对于ST1m-glcK0-gal+突变体获得的数据证实S72P氨基酸改变足以完全消除葡萄糖激酶活性。与葡萄糖激酶活性一起，本发明人还研究了在DSM32587菌株中观察到的葡萄糖激酶活性的降低是否是由于葡萄糖激酶对其底物(葡萄糖)的亲和力(Km)降低和/或葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)降低。表6的数据证实，在DGCC7710衍生物(DSM32587)中，仅用赖氨酸(K)置换GlcK蛋白质第275位的谷氨酸(E)就足以将葡萄糖激酶的Vmax从2855U/g显著降至914U/g(即，DGCC7710 Vmax的32％)。在ST1m-glcK0-gal+突变体中不存在功能性葡萄糖激酶时，不能确定Vmax。

实例5：其他GlcK突变蛋白质的鉴定

鉴定了一种嗜热链球菌菌株(ST20)，所述菌株的glcK基因含有非保守氨基酸差异G144S。在集合(GlcK类型ST1至ST10)的其他嗜热链球菌菌株的任何GlcK序列中均未发现此氨基酸改变。值得注意的是，由ST20菌株编码的葡萄糖激酶序列与SEQ ID NO:2之间的唯一氨基酸差异是第144位的氨基酸差异(表3)。

实例6：在奶发酵过程中，DGCC7710菌株、DSM32587菌株、ST20菌株、ST1m-glcK0-gal+菌株、ST1.1菌株和glcK突变的ST1.1菌株的糖分解代谢和酸化动力学的比较

一方面，考虑到突变E275K和G144S对葡萄糖激酶活性的影响(被降低但不为零)，并且另一方面，考虑到葡萄糖激酶在葡萄糖代谢中的作用，将DGCC7710菌株、DSM32587菌株、ST20菌株、ST1m-glcK0-gal+菌株(上述全部)以及第二亲本菌株(编码如SEQ ID NO:22中所定义的葡萄糖激酶的ST1.1菌株)及其glcK突变的ST1.1菌株(具有E275K取代；ST1.1m-glcK菌株)用于通过测试B发酵奶，并且测定发酵奶中葡萄糖、半乳糖和乳糖的浓度(见材料和方法)。结果总结在下表7中。

表7：用DGCC7710、DSM32587、ST20和ST1m-glcK0-gal+菌株发酵(24h)的奶中碳水化合物的分解代谢

表7的数据显示：

-DSM32587菌株和ST20菌株在奶发酵后分别释放32mM和49mM葡萄糖，而具有高的葡萄糖激酶活性的DGCC7710菌株不释放可检测量的葡萄糖。ST1.1菌株与其glcK突变体(ST1.1m-glcK)之间还可以看到此差异。就ST1m-glcK0-gal+突变体而言，此半乳糖阳性突变体分泌109mM葡萄糖；

-DSM32587菌株和ST20菌株在奶发酵后分别释放73mM和62mM葡萄糖，而DGCC7710菌株释放53mM。ST1.1菌株与其glcK突变体(ST1.1m-glcK)之间还可以看到此细微差异；

-关于发酵奶中剩余乳糖，ST1m-glcK0-gal+突变体几乎消耗奶中存在的所有乳糖(约175mM中的158mM)，使得发酵奶中剩余乳糖的浓度为17mM。相反，对于DSM32587菌株或ST20菌株，剩余乳糖的浓度与DGCC7710菌株的浓度范围相同[95和101对116]。这在ST1.1m-glcK菌株与ST1.1菌株之间也可见[96对119]。

这些数据显示，当使用DGCC7710、DSM32587、ST20、ST1.1和ST1.1m-glcK菌株时(59mM、80mM、66mM、56mM和79mM乳糖消耗53mM、73mM、62mM、44mM和65mM释放的半乳糖)，几乎所有的半乳糖部分(来自乳糖水解)都在发酵奶中释放。需要提醒的是，1摩尔乳糖水解后产生1摩尔葡萄糖和1摩尔半乳糖。葡萄糖部分被菌株部分消耗，因此，在含有175mM乳糖的奶中(测试B)，这意味着奶中剩余乳糖多于菌株消耗的乳糖。

当通过测试B测定时，通过确定发酵奶中释放的半乳糖(mM)相对于发酵奶中剩余乳糖(mM)的比率，也可以解释此行为。此比率在DGCC7710中为0.452，在DSM32587中为0.775，在ST20菌株中为0.544，在ST1.1中为0.373，在ST1.1m-glcK中为0.672，即在上述glcK突变的菌株及其亲本菌株中低于1。此比率表示半乳糖阴性菌株中乳糖摄取和水解的效率。

实例7：乳糖阳性半乳糖阴性ccpA突变的和man突变的嗜热链球菌菌株中糖分解代谢和酸化动力学的测定

基于实例6中所作的观察，本发明人已经测定嗜热链球菌菌株的糖分解代谢和酸化动力学，所述菌株在ccpA基因中突变或在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因(manL、manM或manN基因)中突变。在DGCC7710(ST1)和ST1.1的背景下设计了以下突变体，并通过测试B用于发酵：

-DGCC7710衍生物，其中ccpA基因被在第114-120位具有7个核苷酸A的段中核苷酸A的缺失的ccpA基因(SEQ ID NO:71)置换，引起ccpA基因的可读框移框(ST1m-ccpA)；

-DGCC7710衍生物，具有敲除的ccpA基因(ST1m-KOccpA)；

-DGCC7710衍生物，其中manL基因被第916位核苷酸T取代核苷酸G的manL基因(SEQID NO:111)替换，产生IIAB^Man蛋白质第306位的终止密码子(ST1m-manL)；

-DGCC7710衍生物，其中manM基因被第625位核苷酸T取代核苷酸G的manM基因(SEQID NO:157)替换，产生IIC^Man蛋白质第209位的终止密码子(ST1m-manM)；

-DGCC7710衍生物，其中manN基因被在第37-41位具有5个核苷酸A的段中核苷酸A的插入的manN基因(SEQ ID NO:206)置换，引起IID^Man蛋白质在第28位的可读框移框和截短(ST1m-manN)；

-ST1.1衍生物，其中ccpA基因被在第114-120位具有7个核苷酸A的段中核苷酸A的缺失的ccpA基因(SEQ ID NO:71)置换(ST1.1m-ccpA)；以及

-ST1.1衍生物，其中manL基因被第916位核苷酸T取代核苷酸G的manL基因(SEQ IDNO:111)替换(ST1.1m-manL)。

结果总结在下表8中。

表8：具有ccpA突变的和man突变的菌株及其亲本菌株的发酵奶(24h)中的碳水化合物分解代谢

这些数据显示，ccpA突变的和man突变的菌株都不适合在奶发酵过程中去除乳糖(乳糖浓度为96mM至113mM)。

这些数据证实，使用在ccpA基因中或在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中突变的菌株及其亲本菌株获得的发酵奶中释放的半乳糖相对于剩余乳糖的比率的值与上述实例6中报告的值一致(即，小于1的比率)。

实例8：在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因中突变和在glcK基因和/或ccpA基因中突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的糖分解代谢和酸化动力学的测定

然后，本发明人设计了在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因(manL、manM或manN)中突变和在glcK基因和/或ccpA基因中突变的菌株。因此，基于以下突变的基因，在DGCC7710(ST1)的背景中或在ST1.1的背景中设计了双突变和三突变菌株。

-ST1m-glcK+manM：DSM32587衍生物(携带编码具有取代E275K的葡萄糖激酶的glcK基因；实例2)，其中manM基因被SEQ ID NO:157中所定义的突变的manM基因置换；

-ST1m-ccpA+manL：ST1m-ccpA衍生物(DGCC7710，其携带SEQ ID NO:71中所定义的突变的ccpA基因)，其中manL基因用如SEQ ID NO:111中所定义的突变的manM基因置换；

-ST1m-ccpA+manM：ST1m-ccpA衍生物(DGCC7710，其携带SEQ ID NO:71中所定义的突变的ccpA基因)，其中manM基因用如SEQ ID NO:157中所定义的突变的manM基因置换；

-ST1m-ccpA+manN：ST1m-ccpA衍生物，其中manN基因用如SEQ ID NO:206中所定义的突变的manN基因置换；

-ST1m-glcK+ccpA+manM：DSM32587衍生物，其中ccpA基因用如SEQ ID NO:71中所定义的突变的ccpA基因置换，并且manM基因用SEQ ID NO:157中所定义的突变的manM基因取代；

-ST1.1m-glcK+manM：ST1.1m-glcK衍生物(携带编码具有取代E275K的葡萄糖激酶的glcK基因的ST1.1菌株)，其中manM基因被SEQ ID NO:157中所定义的突变的manM基因置换；以及

-ST1.1m-ccpA+manL：ST1.1m-ccpA衍生物(ST1.1，其携带SEQ ID NO:71中所定义的突变的ccpA基因)，其中manL基因用如SEQ ID NO:111中所定义的突变的manL基因置换。

结果总结在下表9中。

表9：具有双重和三重突变的菌株及其亲本的发酵奶(24h)中的碳水化合物分解代谢

令人惊讶的是，通过测试B，所有半乳糖阴性的单突变菌株(在glcK基因、ccpA基因、manL基因、manM基因和manN基因中的一个基因突变)显示乳糖浓度在100mM左右或以上(95至113)[见表7和8]，引入2或3个突变基因(突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS蛋白质的基因，以及突变的glcK基因和/或突变的ccpA基因)产生当通过测试B用于发酵奶时，去除奶中最初含有的68％至85％的乳糖(即，乳糖浓度为25mM至55mM)的菌株。

有趣的是，不论与非突变的菌株，还是单突变的菌株相比，上文所定义的发酵奶中释放的半乳糖相对于剩余乳糖的比率显著增加。因此，此比率包括在1.780与5.252之间。这表明在发酵奶中剩余乳糖浓度以外，发酵奶中释放的乳糖剩余乳糖的比率也是区分奶发酵过程中适合去除乳糖的半乳糖阴性菌株与不适合去除乳糖的菌株的一个很好的参数。这显示了希望获得低乳糖发酵奶产品(小于60mM)的生产商对于双重或三重突变菌株的兴趣。

实例9：用本发明的双重或三重突变体发酵的奶中的pH_终止。

通过测试B使用DGCC7710、ST1m-glcK+manM、ST1m-ccpA+manL、ST1m-ccpA+manM、ST1m-ccpA+manN、ST1m-glcK+ccpA+manM、ST1.1、ST1.1m-glcK+manM和ST1.1m-ccpA+manL(上述全部)发酵奶[发酵温度下24小时]。

使用CINAC装置记录pH。pH随时间的演变在图2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A和10A中呈现。将在pH 6与pH 5.5之间的速度计算为针对6至5.5的pH值从作为时间的函数的pH的演变中推导的线性模型的斜率。斜率值与速度相反(表10)。还呈现了作为pH的函数的速度的变化(图2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B和10B)。速度确定为作为时间的函数的pH演变的瞬时导数。pH_终止的特征是检测不到速度下降时的pH值(低于0.1mupH/分钟)(表10)。还确定了与pH_终止(TpH_终止)相对应的时间(表10)。

表10：用双重和三重突变菌株及其亲本菌株获得的酸化动力学

表10的数据显示，用双重或三重突变菌株(本发明)发酵的奶比用亲本菌株(4.21和4.31)发酵的奶具有较高的pH_终止(在4.66与4.98之间)。换句话说，此意味着使用双重或三重突变菌株(本发明的)在测试B结束时(发酵温度下24h)获得的pH高于亲本菌株。此表还显示，接种后298至512分钟内获得pH_终止，并保持至24小时(即，超过15小时)。图3A、4A、5A、6A、7A、9A和10A显示与使用亲本菌株时pH规律下降(图2A和8A)相比，在获得pH_终止(使用双重或三重突变菌株)后，发酵奶的pH随时间的稳定性。图3B、4B、5B、6B、7B、9B和10B显示使用双重或三重突变菌株时，酸化(速度)在4.6与5之间的高pH下终止，而使用亲本菌株时，酸化速度在低pH(4.21和4.31)下终止(图2B和8B)。总之，这些结果显示，用本发明的双重或三重突变菌株发酵的奶不存在后酸化。

这些数据还显示，酸化动力学(斜率在pH 6与5.5之间)在工业水平上可接受用于生产发酵乳产品。

总之，这些结果显示生产商对双重或三重突变菌株的兴趣不仅在于希望获得pH值终止在较高范围(4.6-5.3)的发酵产品，而且希望将其工艺保持在不影响发酵乳产品的pH的发酵温度下。

序列

菌株

DGCC编号是杜邦丹尼斯克集合(DuPont Danisco collection)的内部参考；DSM编号是由莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司(Leibniz-InstitutDSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH)(布伦瑞克因霍芬街7B,D-38124(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)))根据布达佩斯条约分配的编号。

就2014年1月14日根据布达佩斯条约以编号DSM28255保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司的嗜热链球菌菌株DGCC7710而言，我们在此证实保藏人丹尼斯克德国有限公司(Danisco Deutschland GmbH)(德国尼布勒市D-25899布希-约翰森大街1号(Busch-Johannsen-Strasse 1,D-25899Niebüll,Germany))已授权申请人(杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition Biosciences ApS))在本申请中引用保藏的生物材料。表述“DGCC7710菌株”和“DGCC7710衍生物”与表述“DSM28255菌株”和“DSM28255衍生物”可互换使用。

2017年8月15日根据布达佩斯条约以编号DSM32587保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司的嗜热链球菌菌株由杜邦营养生物科学公司保藏。

本申请人要求本文所述的保藏的微生物的样品仅可在授予专利的日期之前提供给专家。

就寻求欧洲专利保护的那些指定而言，在提及授予欧洲专利的公告之前或在所述申请被驳回或撤回、或被视为撤回之日之前可获得这些保藏的微生物的样品，且此样品的发放仅限于由请求获得所述样品的请求人指定的专家，且视情况需征得i)申请人和/或ii)欧洲专利局同意。

PCT/RO/134表