Seuss蛋白在调控植物根系生长发育中的应用

文档序号：501557 发布日期：2021-05-28 浏览：23次 >En<

阅读说明：本技术 Seuss蛋白在调控植物根系生长发育中的应用 (Application of SEUSS protein in regulation and control of plant root growth and development ) 是由李传友翟华伟张潇月于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了SEUSS蛋白在调控植物根系生长发育中的应用,SEUSS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。实验证明,在拟南芥seu突变体中表达SEUSS基因可以改善根尖干细胞微环境,进而增强根系生长发育和提高产量。SEUSS蛋白可以调控植物根系生长发育、产量和根尖干细胞微环境。本发明具有重要的应用价值。(The invention discloses an application of SEUSS protein in regulating and controlling the growth and development of plant root systems, wherein the amino acid sequence of the SEUSS protein is shown as SEQ ID NO: 3, respectively. Experiments prove that the expression of the SEUSS gene in the Arabidopsis thaliana seu mutant can improve the microenvironment of root tip stem cells, thereby enhancing the growth and development of root systems and increasing the yield. The SEUSS protein can regulate and control the growth and development of plant root systems, the yield and the microenvironment of root tip stem cells. The invention has important application value.)

SEUSS蛋白在调控植物根系生长发育中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SEUSS蛋白在调控植物根系生长发育中的应用，尤其涉及SEUSS蛋白在调控植物根尖干细胞微环境中的应用。

背景技术

根系是植物特有的营养器官。植物吸收养分及与外界环境的信号交流都离不开根系。植物根系的正常功能为其自身地上各个器官的发育提供充足的保障。目前，土壤及水资源遭受不同程度的污染，这对植物根系正常生长及功能维持造成很大的威胁。而不同区域土壤矿物及营养成分含量也是千差万别，这对作物的种植区域造成很大程度的限制。由于植物根系固着在土壤上，这对研究根系的功能造成一定的困难。如何培育根系功能增强型种植品种是目前植物学家面临的严峻挑战。怎样合理利用基因工程手段分析植物中影响根发育相关基因的功能以及将相关基因运用到育种实践中是急需解决的问题。

植物体成熟的根自下而上基本都是由根冠、分生区、伸长区和成熟区四部分组成，每一部分都有各自的特殊使命。模式植物拟南芥根系结构简单，根部组织透明，是研究根发育的经典模型。在根尖分生区中，分裂不活跃的静止中心(quiescent center，QC)细胞是根干细胞的组织中心。QC及其周围的干细胞共同构成了根尖干细胞微环境(Stem cellniche，SCN)，为根的各个组织持续生长提供动力源泉。SCN的正确建立及其活性的维持依赖QC细胞的特性。QC细胞通过和周围干细胞的信号交流抑制自身分化来保持干细胞活性。目前对于QC细胞与周围的信号交流机制还知之甚少。因此筛选根发育及QC功能缺陷突变体来进一步分析导致该突变的基因在根干细胞微环境建立和维持过程中的功能，进而运用基因工程手段将该基因与育种实践相结合，为培育根系功能增强型品种提供充足的理论支撑。

发明内容

本发明的目的是改善植物根尖干细胞微环境，进而增强根系生长发育、提高产量。

本发明首先保护SEUSS蛋白的应用，可为S1)-S6)中的至少一种：

S1)调控植物根尖干细胞微环境；

S2)培育根尖干细胞微环境改变的转基因植物；

S3)调控植物根系生长发育；

S4)培育根系生长发育改变的转基因植物；

S5)调控植物产量；

S6)培育产量改变的转基因植物。

上述应用中，所述SEUSS蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物根尖干细胞微环境和/或根系生长发育和/或产量相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：3由877个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：1自5’末端起第766-3399位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述SEUSS蛋白的核酸分子的应用，可为S1)-S6)中的至少一种：

S1)调控植物根尖干细胞微环境；

S2)培育根尖干细胞微环境改变的转基因植物；

S3)调控植物根系生长发育；

S4)培育根系生长发育改变的转基因植物；

S5)调控植物产量；

S6)培育产量改变的转基因植物。

上述应用中，所述编码SEUSS蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO：1自5’末端起第766-3399位所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

b4)核苷酸序列是SEQ ID NO：4所示的DNA分子；

b5)与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SEUSS蛋白的DNA分子；

b6)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SEUSS蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：1由3852个核苷酸组成，SEQ ID NO：2由5062个核苷酸组成，SEQID NO：4由5551个核苷酸组成，SEQ ID NO：1自5’末端起第766-3399位所示的DNA分子编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述SEUSS蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述SEUSS蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述SEUSS蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的SEUSS蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述调控植物根系生长发育可为促进植物根系生长发育或减缓植物根系生长发育。

上述任一所述的应用中，所述调控植物产量可为提高植物产量或降低植物产量。

上述任一所述的应用中，所述调控植物根尖干细胞微环境可为促进植物根尖干细胞微环境的建立或抑制植物根尖干细胞微环境的建立。

上述任一所述的应用中，所述培育根系生长发育改变的转基因植物可为培育根系生长发育增强的转基因植物或培育根系生长发育减缓的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述培育产量改变的转基因植物可为培育产量增加的转基因植物或培育产量降低的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述培育根尖干细胞微环境改变的转基因植物可为培育促进根尖干细胞微环境建立的转基因植物或培育抑制根尖干细胞微环境建立的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)拟南芥；c6)野生型拟南芥Columbia-0亚型；c7)拟南芥seu突变体。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述SEUSS蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的根尖干细胞微环境改善和/或根系生长发育增强和/或产量提高。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述SEUSS蛋白的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中所述SEUSS蛋白的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中SEUSS蛋白的表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入编码所述SEUSS蛋白的核酸分子实现。编码所述SEUSS蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO：1自5’末端起第766-3399位所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

b4)核苷酸序列是SEQ ID NO：4所示的DNA分子；

b5)与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SEUSS蛋白的DNA分子；

b6)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SEUSS蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述任一所述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述SEUSS蛋白的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述SEUSS蛋白的核酸分子，得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS。所述重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS具体可为将载体pCAMBIA1300的限制性内切酶SmaI和SalI识别序列之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：4所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述转基因植物具体可为实施例2提及的SEUS#1、SEUS#2和SEUS#3。此时出发植物为拟南芥，具体为拟南芥seu突变体。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加出发植物中所述SEUSS蛋白的表达量和/或活性，从而改善根尖干细胞微环境和/或增强根系生长发育和/或提高产量。

上述任一所述的方法中，所述出发植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)拟南芥；c6)野生型拟南芥Columbia-0亚型；c7)拟南芥seu突变体。

上述任一所述拟南芥seu突变体可为SEUSS蛋白功能丧失的拟南芥。在本发明中，所述拟南芥seu突变体记载于如下文献中：Pfluger，J.，and Zambryski，P.(2004).Therole of SEUSS in auxin response and floral organ patterning.Development 131,4697-4707.。具体的，所述拟南芥seu突变体在SEUSS基因的第1个外显子中发生了1个核苷酸的替换(即SEQ ID NO：2自5’末端起第1263位的C突变成T，从而引起了移码并提前终止，造成SEUSS蛋白功能丧失。

上述任一所述根尖干细胞微环境由QC细胞和周围干细胞共同构成，可以为根系的各个组织持续生长提供动力源泉。根尖干细胞微环境的建立及其活性的维持依赖QC细胞的特性。QC细胞是根尖干细胞的组织中心，其位于根尖分生区且分裂不活跃。良好的根尖干细胞微环境主要表现在QC细胞的正常分裂(参见图2中野生型拟南芥)，QC细胞分裂界限整齐统一；不良的根尖干细胞微环境(或者说紊乱的根尖干细胞微环境)主要表现在QC细胞的不正常分裂(参见图2中seu突变体)，QC细胞分裂状况杂乱无章。因此，在本文中，促进根尖干细胞微环境的建立或改善根尖干细胞微环境主要指的使QC细胞正常分裂；抑制植物根尖干细胞微环境的建立要指的使QC细胞不正常分裂。正常分裂还是不正常分裂是以野生植株中QC细胞的分裂情况作为参照的。

实验证明，在拟南芥seu突变体中表达SEUSS基因可以改善根尖干细胞微环境，进而增强根系生长发育和提高产量。SEUSS蛋白可以调控植物根系生长发育、产量和根尖干细胞微环境。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为野生型拟南芥和seu突变体幼苗的生长状态。

图2为野生型拟南芥和seu突变体的根尖干细胞微环境。

图3为seu突变体中核心转录因子WOX5的表达分析。

图4为转SEUSS基因拟南芥对根尖干细胞微环境的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

SEUSS基因的基因组序列如SEQ ID NO：2所示。SEUSS基因的mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。SEUSS基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第766-3399位所示，编码SEQ ID NO：3所示的SEUSS蛋白。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.在下文中，野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。

seu突变体记载于如下文献中：Pfluger，J.，and Zambryski，P.(2004).The roleof SEUSS in auxin response and floral organ patterning.Development 131,4697-4707.具体的，seu突变体在SEUSS基因的第1个外显子中发生了1个核苷酸的替换(即SEQ IDNO：2自5’末端起第1263位的C突变成T，从而引起了移码并提前终止，造成SEUSS蛋白功能丧失。

拟南芥的培养条件为：22℃；16h光照/8h黑暗；光照强度为12000Lx。

实施例1、seu突变体的表型及其核心转录因子WOX5的表达分析

一、seu突变体的表型

(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液处理5min，2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌吐温水清洗5次。

(2)完成步骤(1)后，将待测拟南芥种子播种于固体培养基(MS固体培养基或含20μM茉莉酸(jasmonic acid，JA)的MS固体培养基)，4℃春化3天。

(3)完成步骤(2)后，将固体培养基竖直培养6天，观察拟南芥幼苗的生长状态。

拟南芥幼苗的生长状态见图1(Col-0为野生型拟南芥，seu为seu突变体，Control为MS固体培养基，20μMJA为含20μM JA的MS固体培养基)。结果表明，与野生型拟南芥相比，seu突变体的根生长迟缓，向地性丧失，主根长短不一，对茉莉酸超敏感。

(4)完成步骤(3)后，取MS固体培养基上培养的拟南芥幼苗的根尖，利用激光共聚焦显微镜(蔡司LSM710)进行观察。

结果见图2(WT为野生型拟南芥，seu为seu突变体)。结果表明，seu突变体比野生型拟南芥的根尖干细胞微环境紊乱，主要表现为QC细胞发生非正常分裂，根冠干细胞有淀粉粒积累。

二、seu突变体中核心转录因子WOX5的表达分析

核心转录因子WOX5(Gene ID：820297)为在QC细胞中特异表达的基因，其功能对于QC细胞建立和根干细胞微环境维持至关重要，是研究根发育的常用标记基因。相关研究记载于如下文献中：Sarkar，A.K.，Luijten，M.，Miyashima，S.，Lenhard，M.，Hashimoto，T.，Nakajima，K.，Scheres，B.，Heidstra，R.，and Laux，T.(2007).Conserved factorsregulate signalling in Arabidopsis thaliana shoot and root stem cellorganizers.Nature 446，811-814.。

1、实时荧光定量检测seu突变体中WOX5基因的相对表达水平

(1)取待测拟南芥(野生型拟南芥或seu突变体)种子，培养5天，得到待测拟南芥幼苗。

(2)完成步骤(1)后，将所述待测拟南芥幼苗的根尖切下，迅速液氮冷冻，得到待测拟南芥根尖。

(3)完成步骤(2)后，采用Trizo1法提取待测拟南芥根尖的总RNA，反转录，得到待测拟南芥的cDNA。

(4)以待测拟南芥的cDNA为模板，实时定量PCR检测WOX5基因的相对表达水平(Actin7基因为内参基因)。Ct值为反应体系中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。ΔCt＝Ct_WOX5-Ct_Actin，以2-ΔCt的值衡量WOX5基因表达水平。

反应体系为20μL，由10μLSYBR Premix Ex Taq(2×)、0.5μL上游引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL下游引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL待测拟南芥的cDNA和8.5μL ddH₂O组成。

SYBR Premix Ex Taq(2×)为TAKARA公司的产品。

反应程序为：95℃30s；95℃10s，60℃20s，72℃20s，45个循环。

检测WOX5基因的引物为5’-GATTGTCAAGAGGAAGAGAAGGTGA-3’和5’-AGCTTAATCGAAGATCTAATGGCG-3’。

检测Actin7基因的引物为5′-GAGGAAGAGCATTCCCCTCGTA-3′和5′-GAGGATAGCATGTGGAACTGAGAA-3′。

检测结果见图3中A(WT为野生型拟南芥，seu为seu突变体)。结果表明，与野生型拟南芥相比，seu突变体根尖中WOX5基因的相对表达水平显著下降。

该实验均重复3次，结果基本一致。

2、观察pWOX5::GFP标记系在seu突变体中的表达

pWOX5::GFP记载于如下文献中：Blilou，I.，Xu,J.，Wildwater，M.，Willemsen，V.，Paponov，I.，Friml，J.，Heidstra，R.，Aida，M.，Palme，K.，and Scheres，B.(2005).The PINauxin efflux facilitator network controls growth and patterning inArabidopsis roots.Nature 433:39–44.在下文中，pWOX5::GFP命名为pWOX5::GFP标记系。

(1)将pWOX5::GFP标记系和seu突变体杂交，得到F1代。

(2)完成步骤(1)后，种植F1代，得到F2代分离群体。

(3)完成步骤(2)后，在荧光显微镜下观察F2代分离群体，选择能够发出荧光的植株进行酶切鉴定，获得背景为野生型拟南芥的植株和背景为seu突变体的植株。

酶切鉴定步骤如下：

(3-1)分别提取能够发出荧光的植株的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-GAAAATGTTCCGCCTTCGAT-3’和5’-GAATTTGCTGCGGTTCCAACT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到约580bp的PCR扩增产物。

(3-2)将步骤(3-1)得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BslI进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，进行如下判断：

如果酶切产物中仅含有一条条带且大小为580bp，则相应的能够发出荧光的植株为背景为seu突变体的植株；

如果酶切产物中仅含有两条条带且大小分别为340bp和240bp，则相应的能够发出荧光的植株为背景为野生型拟南芥的植株；

如果酶切产物中仅含有三条条带且大小分别为340bp、240bp和580bp，则相应的能够发出荧光的植株为杂合体。

(4)将背景为野生型拟南芥的植株和背景为seu突变体的植株单株收种，依次获得野生型F2代阳性拟南芥种子和突变体F2代阳性拟南芥种子。

(5)种植步骤(4)得到的不同株系的野生型F2代阳性拟南芥种子，然后在荧光显微镜下观察，如果均能发出荧光，则相应的野生型-F2代阳性苗为野生型-F2代纯合阳性苗。种植步骤(4)得到的不同株系的突变体F2代阳性拟南芥种子，然后在荧光显微镜下观察，如果均能发出荧光，则相应的突变体-F2代阳性苗为突变体-F2代纯合阳性苗。

(6)分别取生长至5天的突变体-F2代纯合阳性苗和野生型-F2代纯合阳性苗的根尖，激光共聚焦显微镜下观察根尖。

检测结果见图3中B(WT为野生型-F2代纯合阳性苗，seu为突变体-F2代纯合阳性苗)。结果表明，与野生型-F2代纯合阳性苗相比，突变体-F2代纯合阳性苗根尖的荧光表达水平显著降低。

实施例2、转SEUSS基因拟南芥的获得及其对根尖干细胞微环境的影响

一、重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS的构建

1、以野生型拟南芥幼苗的基因组DNA为模板，采用引物1：5’-ACGCGTCGACTATTCAGCAATGGTTCAT-3’(下划线为限制性内切酶SalI的识别位点)和引物2：5’-TCCCCCGGGATCGCGTTCCAATCAAAATTGTTG-3’(下划线为限制性内切酶SmaI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，回收约5551bp的DNA片段。

2、用限制性内切酶SmaI和SalI酶切载体pCAMBIA1300，回收约9kb的载体骨架。

3、用限制性内切酶SmaI和SalI酶切步骤1回收的DNA片段，回收酶切产物。

4、将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS。

将重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS进行测序。测序结果表明，重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS为将载体pCAMBIA1300的限制性内切酶SmaI和SalI识别序列之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：4所示的DNA分子，得到的重组质粒。SEQ ID NO：4中，自5’末端起，第1至943位为SEUSS基因的启动子。

重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS表达SEQ ID NO：3所示的SEUSS蛋白。

二、GV3101/pCAMBIA1300-SEUSS的获得

将重组质粒pCAMBIA1300-SEUSS导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCAMBIA1300-SEUSS。

三、转SEUSS基因拟南芥的获得

1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将GV3101/pCAMBIA1300-SEUSS转至seu突变体中，获得T₁代转SEUSS基因拟南芥种子。

2、将T₁代转SEUSS基因拟南芥种子播种于含有50mg/L潮霉素的MS固体培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T₁代转SEUSS基因阳性苗，T₁代转SEUSS基因阳性苗收到的种子即为T₂代转SEUSS基因拟南芥种子。

3、将不同株系的T₂代转SEUSS基因拟南芥种子播种于含有50mg/L潮霉素MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为SEUSS基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₃代转SEUSS基因拟南芥种子。

4、将T₃代转SEUSS基因拟南芥种子再次播种于含有50mg/L潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₃代纯合转SEUSS基因拟南芥。将其中3个T₃代纯合转SEUSS基因拟南芥株系分别命名为SEUS#1、SEUS#2和SEUS#3，并进行后续实验。

四、分子鉴定

待测拟南芥种子为SEUS#1的T₃代种子、SEUS#2的T₃代种子、SEUS#3的T₃代种子或野生型拟南芥种子。

1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。

2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，培养7天，得到待测拟南芥幼苗。

3、提取待测拟南芥幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-GGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’和5’-GAATTCTTATTTGTATAGTTCA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约720bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测拟南芥幼苗为阳性苗。

结果表明，SEUS#1的T₃代种子、SEUS#2的T₃代种子和SEUS#3的T₃代种子获得的幼苗均为阳性苗。

五、根尖干细胞微环境的影响

待测拟南芥种子为SEUS#1的T₃代种子、SEUS#2的T₃代种子、SEUS#3的T₃代种子、野生型拟南芥种子或seu突变体种子。

1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。

2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，培养5天，得到待测拟南芥幼苗。

3、完成步骤2后，激光共聚焦显微镜下观察待测拟南芥幼苗的根尖。

部分检测结果见图4(WT为野生型拟南芥，seu为seu突变体，pCAMBIA1300-SEUSSseu为SEUS#1)。结果表明，seu突变体的根尖干细胞微环境紊乱，SEUS#1、SEUS#2、SEUS#3和野生型拟南芥的根尖干细胞微环境均正常。由此可见，向seu突变体中导入SEUSS基因，可以使根尖干细胞微环境由紊乱恢复正常。

上述结果表明，SEUSS蛋白可以促进植物根尖干细胞的微环境的建立和维持，进而促进根系生长发育，提高植物产量。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> SEUSS蛋白在调控植物根系生长发育中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3852

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

gattgtgatt acaaaaaaaa aacatttcta gggcatgtca ttgacttcct ttgaagaaga 60

agaagaagag agagagagac tgaaaaagaa aaagtaagaa agggaatgaa ataaatccga 120

tcgaatacaa ttttgacgtc cgcaaggaca ctattctctc tcttctcatc ttcttctttc 180

tctcttctct ctctctctct acagcgaaga acaggacaca aattactctg tgaagcttaa 240

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tttctacttc tttttgtttc tctttgtctt ctcgtctctt tatccccaaa cccatcaata 360

aaaaacccta aaagacttca aatttcttca agattttgtt catcggaagt tttcagattt 420

ttagttgtgt aaagtctctt cctttttgtt cgattctctt tgttttgagt cttatcagag 480

acttattctt caattccacc tctgggtggt gagagttgga aatggagtag atttgcttaa 540

tttagatctg taagtaatca acagacagtg ttgtttggtt ctagaatgtt cgatacggaa 600

tctcatcact cagattcatc tctttccgtg gtgtttacga ctctgaagct tatcattgct 660

cagaaagaat acgtctttgc tcctacacag agctgagttt tataaagtcg tcagttttgt 720

ttcttgcttt ctttgttgat tgtggagttg tgaattagta agagtatggt accatcagag 780

ccgcctaatc ctgttggggg tggtgaaaat gttccgcctt cgatattagg aggacaagga 840

ggagctcctc ttccttctca accagcattt ccttcacttg tctctccgcg tactcagttt 900

ggtaacaata tgagtatgag tatgcttggg aatgctccaa atatatcttc tcttctcaat 960

aatcagtctt ttgtaaatgg tatccctggt tctatgattt ctatggatac aagtggtgct 1020

gagtctgacc cgatgtctaa cgtcgggttt agtggtttgt cgtcttttaa tgcgtcgagt 1080

atggtgtctc cgcgctcatc aggtcaagtt cagggtcagc agttttcgaa tgtttcggct 1140

aaccagttgt tggctgagca acaacggaat aagaaaatgg agacgcagag ttttcaacat 1200

ggtcagcagc agtcaatgca gcagcagttt tcgacagtgc gtggtggtgg attagcaggt 1260

gtgggacctg ttaagatgga gcctggtcag gtttcgaatg atcagcagca tggtcaagta 1320

caacagcagc aacagaaaat gttgagaaac ctagggtcag ttaagttgga accgcagcaa 1380

attcaggcca tgagaaattt ggcccaagtg aaaatggaac ctcaacattc tgagcagtca 1440

ttgtttctcc aacaacagca gaggcaacaa cagcaacaac aacaacaaca atttcttcaa 1500

atgccggggc aatctccgca ggctcaaatg aacatatttc agcagcagag acttatgcaa 1560

cttcaacaac agcaactctt gaaatctatg cctcaacagc gtcctcaatt accacagcag 1620

ttccaacagc agaatttacc tctaaggcca cctctgaaac cagtgtatga acctggcatg 1680

ggtgctcagc gtcttacaca gtatatgtac agacaacaac ataggcctga agacaataat 1740

atcgagttct ggagaaaatt tgtagctgag tactttgctc ctaatgccaa aaagagatgg 1800

tgcgtctcta tgtatggcag tggcaggcaa acaacaggcg ttttccctca ggatgtgtgg 1860

cactgtgaga tatgtaaccg aaagcctgga cgtggttttg aggcaaccgc cgaagtcctt 1920

ccgcggctgt ttaagattaa gtatgagagt gggacgttag aagaactgtt atatgtagat 1980

atgccaaggg agtcccagaa ttcatctggc caaattgtcc tggagtatgc aaaagcaaca 2040

caagagagtg tctttgagca tcttcgggtt gttcgtgatg gccaacttcg aatagtcttc 2100

tcgccagatc ttaagatatt ctcctgggaa ttttgtgctc ggcggcatga agagcttatt 2160

ccacgaagac ttttgatacc gcaggttagt cagcttggat cggcagctca gaaatatcaa 2220

caagctgctc aaaatgcaac aacagattct gctcttccgg agctacaaaa taattgcaat 2280

atgtttgttg catctgctag acaattggca aaggccctgg aagtaccact tgtgaatgat 2340

ttgggataca caaagagata tgttcggtgt ttgcagatct cagaggtggt aaatagtatg 2400

aaggacctga tagattatag cagagaaaca cgaacaggac caatcgagag tttagccaag 2460

tttcctcgga gaacaggccc ttcatctgca ctgcctggtc cttctcctca gcaagccagc 2520

gaccagctta ggcagcagca gcaacaacaa cagcagcagc agcaacagca acaacaacaa 2580

caacaacaac agcagcagca gcaaacagtt tcccagaata caaacagtga tcaaagtagt 2640

aggcaagttg cactaatgca gggtaatcca agcaatggtg taaattatgc ctttaatgca 2700

gcctctgcat ccacttccac cagcagcatc gcagggctca tccaccagaa ttcaatgaag 2760

ggaagacatc agaatgctgc ttacaatcct ccaaacagcc cctatggagg aaactctgtt 2820

cagatgcaat cacctagttc ctcgggtacc atggtgccat catcatcgca gcaacaacac 2880

aacctgccaa catttcagtc tccaacatcc tcatctaata acaataatcc ctctcaaaac 2940

gggataccat ctgttaatca catgggttcc acaaactcac cagcaatgca acaggcaggt 3000

gaggttgatg gaaacgagtc tagctcggtg cagaagatac tgaatgaaat cctgatgaac 3060

aaccaagctc ataataatag ctcaggagga agcatggttg ggcatgggtc tttcgggaat 3120

gatgggaagg gtcaagctaa tgtaaatagt tctggtgttt tactgatgaa tggccaagtg 3180

aacaacaaca acaacacaaa tattggaggt gctggtgggt ttggtggtgg gattggtcaa 3240

tccatggcag caaacggaat caataatata aacggtaaca atagtctcat gaacggaaga 3300

gttgggatga tggtgcggga tccaaacggt caacaggatt taggaaacca acttttagga 3360

gcagtgaatg gtttcaacaa ttttgattgg aacgcgtgaa atgaagaaga ggaagaagag 3420

acactgaaag ggtaatgttc tgcttgcgca gcatcacaca tcttcaaact caggataagg 3480

ataggccaat aagccgtgat attgtgctta agaaaggaag agtcaaatct ttgtatcaat 3540

aactggtttc taggtcacct ccacaatcac caataccatc tcttgagtta ctgtttcttt 3600

ttttactttg gggagttttt cttatgcttt atagtttata atgtacatct ttctatcggt 3660

gtgtgttcct tagggcacat catcagggag gcaatgaatc aagctctatc cttcatttat 3720

ctctctggtc tcttccatgt gttaaccaaa cttccctaaa ttctgaccac aacgttaaat 3780

atgtgcaatg ctcttgaacg atgctgatcg gtcatgattt tttgttgtta gtgcaatgaa 3840

ataccacaag cc 3852

<210> 2

<211> 5062

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2