一种培育花青苷含量提高的转基因植物的方法
阅读说明：本技术 一种培育花青苷含量提高的转基因植物的方法 (Method for cultivating transgenic plant with increased anthocyanin content ) 是由 翟红 刘庆昌 何绍贞 赵宁 张姗姗 于 2021-01-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种培育花青苷含量提高的转基因植物的方法。该方法包括如下步骤：提高受体植物中蛋白质IbDDE的表达量和/或活性,得到转基因植物；与受体植物相比,转基因植物的花青苷含量提高。蛋白质IbDDE的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。实验证明,过表达IbDDE基因能显著促进烟草的花青苷合成。因此,蛋白质IbDDE及其编码基因可以调控植物花青苷含量。本发明具有重要的应用价值。(The invention discloses a method for cultivating a transgenic plant with improved anthocyanin content. The method comprises the following steps: improving the expression quantity and/or activity of protein IbDDE in a receptor plant to obtain a transgenic plant; the transgenic plant has an increased anthocyanin content as compared to the recipient plant. The amino acid sequence of the protein IbDDE is shown as SEQ ID NO. 2. Experiments prove that the over-expression IbDDE gene can obviously promote the synthesis of anthocyanin in tobacco. Therefore, the protein IbDDE and the coding gene thereof can regulate and control the content of plant anthocyanin. The invention has important application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培育花青苷含量提高的转基因植物的方法。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的不断提高，紫薯(即紫肉甘薯)的营养价值和保健作用越来越受到人们的重视。紫薯不仅具有普通栽培甘薯的营养成分，而且富含硒、膳食纤维和花青苷。而且紫薯提取色素之后的残渣可酿造酒精、生产淀粉、做饲料等，具有较高的综合利用价值。
花青苷是植物体内重要的次级代谢产物，通过细胞质和内质网膜中的酶反应合成，由花青素与糖以糖苷的形式广泛存在于植物液泡中，包括蓝、紫、洋红、红、橙等颜色。花青苷的积累能避免叶片光合系统遭受紫外线、低温及短暂的强光伤害，提高植株抗旱和抗病虫的侵害，吸引昆虫授粉和种子传播。花青苷含有多酚结构，属于天然抗氧化活性物质，可以有效清除自由基，具有较强的抗氧化性，同时能避免人体生物酶系统遭受破坏，并兼具抗突变、抗癌防癌、降血压、软化血管等保健功能。花青苷作为一种天然色素，也被广泛地用作食品添加剂，因此花青苷在食品、保健、作物改良等各方面都有十分重要的应用价值。因此，获得花青苷合成基因以提高植物的花青苷含量是植物品质基因工程的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提高植物的花青苷含量。
本发明首先保护来源于甘薯的蛋白质IbDDE，可为如下1)或2)或3)或4)：
1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；
2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于甘薯且与花青苷含量相关的蛋白质；
4)与SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于甘薯且与花青苷含量相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:2由393个氨基酸残基组成。
为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签
残基
序列
Poly-Arg
5-6(通常为5个)
RRRRR
FLAG
8
DYKDDDDK
Strep-tag II
8
WSHPQFEK
c-myc
10
EQKLISEEDL
上述3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码所述蛋白质IbDDE的核酸分子。
所述编码蛋白质IbDDE的核酸分子可为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：
(a1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbDDE的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbDDE的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由1182个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质IbDDE的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质IbDDE的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质IbDDE，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质IbDDE的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒pCB-IbDDE。重组质粒pCB-IbDDE可为将重组质粒pCBGUS的限制性内切酶BglII和PmlI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为EHA105/pCB-IbDDE。所述EHA105/pCB-IbDDE可为将重组质粒pCB-IbDDE导入农杆菌EHA105，得到的重组农杆菌。
本发明还保护上述任一所述蛋白质IbDDE、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物花青苷含量中的应用。
本发明还保护上述任一所述蛋白质IbDDE、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育花青苷含量改变的转基因植物中的应用。
上述任一所述的应用中，所述调控植物花青苷含量可为提高植物花青苷含量。
上述任一所述的应用中，所述培育花青苷含量改变的转基因植物可为培育花青苷含量提高的转基因植物。
上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)薯蓣科植物；c4)甘薯；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥Col-0。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbDDE的表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的花青苷含量提高。
上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbDDE表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbDDE的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbDDE表达量和/或活性”具体可通过向受体植物中导入编码所述蛋白质IbDDE的核酸分子实现。
上述方法中，所述编码蛋白质IbDDE的核酸分子可为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：
(a1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbDDE的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbDDE的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由1182个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
所述向受体植物中导入编码所述蛋白质IbDDE的核酸分子具体可通过向受体植物导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pCB-IbDDE。重组质粒pCB-IbDDE可为将重组质粒pCBGUS的限制性内切酶BglII和PmlI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中上述任一所述蛋白质IbDDE的表达量和/或活性，从而提高植物的花青苷含量。
上述任一所述的方法中，所述植物可为如下c1)、c2)、c3)、c4)、c8)、c9)和c10)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)薯蓣科植物；c4)甘薯；c8)茄科植物；c9)烟草；c10)W38烟草。
向W38烟草中导入IbDDE基因，得到转IbDDE基因烟草。实验证明，与W38烟草相比，转IbDDE基因烟草的花青苷含量显著增加；即过表达IbDDE基因能显著促进烟草的花青苷合成。因此，蛋白质IbDDE及其编码基因可以调控植物花青苷含量。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为10个拟转IbDDE基因烟草的分子鉴定结果。
图2为实时定量PCR检测10个拟转IbDDE基因烟草IbDDE基因的表达量。
图3为5个转IbDDE基因烟草的花朵颜色比较。
图4为5个转IbDDE基因烟草的花青苷含量的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
甘薯品系京薯6-5记载于如下文献中：Zhao HY，Zhang SS，Wang FB，Zhao N，HeSZ，Liu QC，Zhai H.Comparative transcriptome analysis of purple-fleshed sweetpotato provides insights into the molecular mechanism of anthocyaninbiosynthesis.Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2018，doi.org/10.15302/J-FASE-2018219。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
W38烟草记载于如下文献中：Jiang T，Zhai H，Wang FB，Zhou HN，Si ZZ，He SZ，Liu QC.Cloning and haracterization of a Salt Tolerance-Associated GeneEncoding Trehalose-6-Phosphate Synthase in Sweetpotato，Journal of IntegrativeAgriculture 2014，13(8)：1651-1661。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
载体pCAMBIA3301为优宝生物公司产品，产品编号为VT1386。载体pBI 121为优宝生物公司产品，产品编号为VT1388。植物总RNA提取试剂盒为Transzol Up植物总RNA提取试剂盒(全式金，目录号ET111)。pEASY-Blunt simple载体为北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号为CB111-01。QuantScript RT Kit Quant cDNA Kit为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为KR103。
实施例1、IbDDE基因的获得
IbDDE基因的获得的步骤如下：
1、用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯品系京薯6-5幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用QuantScript RT Kit Quant cDNA Kit反转录出第一链cDNA。
2、以步骤1获得的cDNA为模板，采用引物O-F：5′-ATGGCTCGTTTGGGTATAAGTAG-3′和引物O-R：5′-CTAACTATTCCATTGGTTGAACATT-3′组成的引物对进行PCR扩增，获得1182bp的PCR扩增产物并测序。
结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示的基因命名为IbDDE基因，其编码的蛋白命名为IbDDE蛋白或蛋白质IbDDE，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
实施例2、IbDDE蛋白在提高植物花青苷含量的应用
一、重组质粒的构建
1、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pCAMBIA3301，回收约11256bp的载体骨架1。
2、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pBI121，回收包含约3032bp的片段1。
3、将片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒pCBGUS。
4、用限制性内切酶BglII和PmlI双酶切重组质粒pCBGUS，回收约12388bp的载体骨架2。
5、人工合成SEQ ID NO.1所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以引物IbDDE-F1-BglII：5’-GAAGATCTATGGCTCGTTTGGGTATAAGTAG-3’(下划线为限制性内切酶BglII的识别序列)和引物IbDDE-R1-PmlI：5’-GCCACGTGCTACTATTCATTGGTTGACATTTGG-3’(下划线为限制性内切酶PmlI的识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，获得含有限制性内切酶识别序列的双链DNA分子。
6、将步骤5得到的含有限制性内切酶识别序列的双链DNA分子连接至pEASY-Bluntsimple载体，得到中间载体。
7、用限制性内切酶BglII和PmlI双酶切中间载体，回收约1200bp的片段2。
8、将片段2与载体骨架2连接，得到重组质粒pCB-IbDDE。
将重组质粒pCB-IbDDE进行测序。根据测序结果，对重组质粒pCB-IbDDE进行结构描述如下：将重组质粒pCBGUS的限制性内切酶BglII和PmlI识别序列间的小片段替换为SEQID NO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。重组质粒pCB-IbDDE表达SEQ ID NO.2所示的IbDDE蛋白。
二、转IbDDE基因烟草的获得
1、将重组质粒pCB-IbDDE转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCB-IbDDE。
2、采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCB-IbDDE转至W38烟草(参考如下文献：WangLJ，He SZ，Zhai H，Liu DG，Wang YN，Liu QC：Molecular cloning and functionalcharacterization of a salt tolerance-associated gene IbNFU1 fromsweetpotato.Journal of Integrative Agriculture，2013，12(1)：27-35)，获得拟转IbDDE基因烟草。具体步骤如下：
(1)将无菌培养基中生长4周左右的W38烟草叶片置于无菌培养皿，去除主脉和叶边缘，然后切成1cm×1cm的烟草叶盘。
(2)将烟草叶盘正面朝上置于预培养培养基(含1.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS固体培养基)，28℃暗培养2-3d，得到预培养的烟草叶盘。
(3)将预培养的烟草叶盘浸泡于OD600nm为0.4-0.6的农杆菌侵染液中5-10min，之后吸干烟草叶盘上多余的菌液，正面放置在共培养培养基(含1.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS固体培养基)上，28℃暗培养2-3d。
(4)完成步骤(3)后，将所述烟草叶盘依次用含600mg/L CS的MS液体培养基、含300mg/L CS的MS液体培养基和含150mg/L CS的MS液体培养基清洗，之后用高温高压灭菌的干净滤纸吸干烟草叶盘上多余的液体，置于再生培养基(含15mg/L潮霉素、400mg/L CS、1.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS固体培养基)上，28℃光照培养(光照强度为3000lux)30d，得到再生芽。
(5)完成步骤(4)后，切下1cm的再生芽，然后置于生根培养基(含1.0mg/L6-BA、0.1mg/L NAA、400mg/L头孢氨苄、15mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基)上，至长成完整植株，即获得拟转IbDDE基因烟草。
将获得的10个拟转IbDDE基因烟草依次命名为L1—L10。
3、分子鉴定
待测烟草为W38烟草、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9或L10。
(1)提取待测烟草叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物O-F和引物O-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以水作为模板，采用引物O-F和引物O-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，作为阴性对照；以重组质粒pCB-IbDDE作为模板，采用引物O-F和引物O-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，作为阳性对照。
(2)完成步骤(1)后，将各个PCR扩增产物进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果以某拟转IbDDE基因烟草的基因组DNA为模板得到的PCR扩增产物中含有1182bp的DNA片段(与阳性对照的片段相同)，则该拟转IbDDE基因烟草为阳性植株；否则不为阳性植株。
检测结果见图1(M为DNA Marker，W为阴性对照，P为阳性对照，WT为野生型拟南芥)。结果表明，L1—L10和阳性对照的PCR扩增产物中均含有1182bp的DNA片段，阴性对照和W38烟草的PCR扩增产物中均不含有约1182bp的DNA片段。由此可见，L1—L10均为阳性植株，即转IbDDE基因烟草。
4、实时定量PCR检测L1—L10中IbDDE基因的表达量
待测烟草为W38烟草、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9或L10。
(1)提取待测烟草幼苗的总RNA，用逆转录酶反转得到cDNA；实时定量PCR检测cDNA中IbDDE基因的相对表达量(以烟草肌动蛋白Actin基因为内参基因)。
检测IbDDE基因的引物为IbDDE-F：5’-CTACTATTCATTGGTTGACATTTGGTT-3'和IbDDE-R：5’-GCTCCACAATTTTATAAGACAAGTGAT-3'。
检测Actin基因的引物为NtActin-F：5’-GAGGAATGCAGATCTTCGTG-3’和NtActin-R：5’-TCCTTGTCCTGGATCTTAGC-3’。
部分检测结果见图2。结果表明，IbDDE基因为烟草外源基因，在W38烟草中几乎没有表达，但IbDDE基因在L1—L10中都有不同程度的表达。
随机选取IbDDE基因的表达量显著高于W38烟草的5个株系(即L1、L2、L3、L4和L5)进行后续试验。
三、转IbDDE基因烟草花青苷含量的测定
待测烟草为W38烟草、L1、L2、L3、L4或L5。
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
1、将生长状况良好、大小一致的烟草移栽至温室，开花后观察花朵颜色。
结果见图3。结果表明，与W38烟草相比，转IbDDE基因烟草(如L1、L2、L3、L4和L5)的颜色明显红一些。
2、完成步骤1后，取待测烟草的花朵，参照Li等的方法(Li S，Wang W，Gao J，etal.MYB75 phosphorylation by MPK4 is required for light-induced Anthocyaninaccumulation in Arabidopsis.Plant Cell,2016,28(11):2866-2883)检测花青苷含量。
检测结果见图4。结果表明，与W38烟草相比，转IbDDE基因烟草(如L1、L2、L3、L4和L5)的花青苷含量显著增加。
上述结果表明，过表达IbDDE基因能显著促进烟草的花青苷合成。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国农业大学
<120>一种培育花青苷含量提高的转基因植物的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> 甘薯Ipomoea batatas
<400> 1
atggctcgtt tgggtataag tagaactgct gaaagaagaa aaaggattgt ggctgctttg 60
actgtttttt tagagatgta tactgttgtt agtaccttag tacttttaat ggcatcagca 120
gcatctctca atagttatag gccaagcatt aggaactatt gtcttgatag ttattacaaa 180
agagagtaca ttcaacgaat tttgaataat aacgagtcat gcatttcact acttaggatg 240
aatttgcaag ctttttccaa actatgtgaa atgctagaga gtttaggagg attaaaacca 300
acaaggaaca tggctattga ggaacaagta gcaatcttct tacatattct tgcccatcat 360
gttaaaaatc gagtcattca atacaatttt agaaggtcag gtgagagtat cagtcggacg 420
tttcataaag tcttgaatgc cataatgcat ttgcaaggtc atttgtttaa aacacccgaa 480
cccgttccag caaattgtac tgacagtcga tggaagtggt ttaagaattg tttgggtgct 540
ttagatggaa cctttatcaa ggttaatgtg ccaagttctg ataagcctag atatcgaact 600
cgtaagggag acattgcaac aaatgtttta ggtgtgtgca ctcctgatat gcaatttgtt 660
tatgttctaa gtggttggga aggatcagtg gctgatagtc gagttcttcg tgatgcaatt 720
agtaggacac atgcattgga agtgccacat ggttgctatt acctagttga tgctggttat 780
acaaattgtg agggatttct agcacctttt aggggacaaa ggtatcattt gaatgaatgg 840
cgtcaaggtt atcaacctac aagcccgcaa gaatttttta atatgaaaca tgctgctgcc 900
cgtaatgtga ttgagaggtg ttttgggtta ttaaaaatta gatggggtat tcttaggagc 960
ccatcttatt accctataaa gacgcacaat cgcattatta tagcatgttg tttgctccac 1020
aattttataa gacaagtgat gcaagtcgat cctatggaaa gtgaacttga tgcgtttgat 1080
catgttgaag gtgaaacaaa ttcaataaat acagttgatc catccgatgc ttggaccaat 1140
tggagaatgg aattagcaaa ccaaatgtca accaatgaat ag 1182
<210> 2
<211> 393
<212> PRT
<213> 甘薯Ipomoea batatas
<400> 2
Met Ala Arg Leu Gly Ile Ser Arg Thr Ala Glu Arg Arg Lys Arg Ile
1 5 10 15
Val Ala Ala Leu Thr Val Phe Leu Glu Met Tyr Thr Val Val Ser Thr
20 25 30
Leu Val Leu Leu Met Ala Ser Ala Ala Ser Leu Asn Ser Tyr Arg Pro
35 40 45
Ser Ile Arg Asn Tyr Cys Leu Asp Ser Tyr Tyr Lys Arg Glu Tyr Ile
50 55 60
Gln Arg Ile Leu Asn Asn Asn Glu Ser Cys Ile Ser Leu Leu Arg Met
65 70 75 80
Asn Leu Gln Ala Phe Ser Lys Leu Cys Glu Met Leu Glu Ser Leu Gly
85 90 95
Gly Leu Lys Pro Thr Arg Asn Met Ala Ile Glu Glu Gln Val Ala Ile
100 105 110
Phe Leu His Ile Leu Ala His His Val Lys Asn Arg Val Ile Gln Tyr
115 120 125
Asn Phe Arg Arg Ser Gly Glu Ser Ile Ser Arg Thr Phe His Lys Val
130 135 140
Leu Asn Ala Ile Met His Leu Gln Gly His Leu Phe Lys Thr Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Pro Ala Asn Cys Thr Asp Ser Arg Trp Lys Trp Phe Lys Asn
165 170 175
Cys Leu Gly Ala Leu Asp Gly Thr Phe Ile Lys Val Asn Val Pro Ser
180 185 190
Ser Asp Lys Pro Arg Tyr Arg Thr Arg Lys Gly Asp Ile Ala Thr Asn
195 200 205
Val Leu Gly Val Cys Thr Pro Asp Met Gln Phe Val Tyr Val Leu Ser
210 215 220
Gly Trp Glu Gly Ser Val Ala Asp Ser Arg Val Leu Arg Asp Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Thr His Ala Leu Glu Val Pro His Gly Cys Tyr Tyr Leu Val
245 250 255
Asp Ala Gly Tyr Thr Asn Cys Glu Gly Phe Leu Ala Pro Phe Arg Gly
260 265 270
Gln Arg Tyr His Leu Asn Glu Trp Arg Gln Gly Tyr Gln Pro Thr Ser
275 280 285
Pro Gln Glu Phe Phe Asn Met Lys His Ala Ala Ala Arg Asn Val Ile
290 295 300
Glu Arg Cys Phe Gly Leu Leu Lys Ile Arg Trp Gly Ile Leu Arg Ser
305 310 315 320
Pro Ser Tyr Tyr Pro Ile Lys Thr His Asn Arg Ile Ile Ile Ala Cys
325 330 335
Cys Leu Leu His Asn Phe Ile Arg Gln Val Met Gln Val Asp Pro Met
340 345 350
Glu Ser Glu Leu Asp Ala Phe Asp His Val Glu Gly Glu Thr Asn Ser
355 360 365
Ile Asn Thr Val Asp Pro Ser Asp Ala Trp Thr Asn Trp Arg Met Glu
370 375 380
Leu Ala Asn Gln Met Ser Thr Asn Glu
385 390