一种Ce6衍生物、其纳米制剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种Ce6衍生物、其纳米制剂及其制备方法和应用 (Ce6 derivative, nano preparation thereof, and preparation method and application thereof ) 是由 栾玉霞 秦晓晗 于 2021-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种Ce6衍生物、其纳米制剂及其制备方法和应用。所述Ce6衍生物,其命名为TCe6,结构式如下式所示,本发明以TCe6与CHC共组装构建TCe6/CHC NPs,解决了PDT中氧气不足和效率低下的问题,实现了高效的光动力治疗。(The invention provides a Ce6 derivative, a nano preparation thereof, a preparation method and application thereof. The Ce6 derivative is named as TCe6, the structural formula is shown as the following formula, and TCe6 and CHC are jointly assembled to construct TCe6/CHC NPs, so that the problem of oxygen deficiency in PDT is solvedThe problem of low efficiency and the realization of high-efficiency photodynamic therapy.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种Ce6衍生物、其纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
光动力疗法(PDT)利用光敏剂和氧气产生单线态氧来杀伤肿瘤，通过激光实现时空控制治疗。与传统疗法(例如手术，化学疗法和放射疗法)相比，PDT作为一种微创疗法，可以选择性地作用于肿瘤部位并大大减少副作用。然而，肿瘤缺氧的微环境和传统光敏剂的水溶性差是损害PDT抗肿瘤治疗优势的两个主要问题。
二氢卟吩e6是光动力疗法(PDT)中针对肿瘤生长而广泛使用的光敏剂，但其疏水性特征和肿瘤微环境中的缺氧极大地损害了其治疗功效，因此，迫切需要解决此问题以实现更优异的治疗功效。目前的大量研究主要通过采用外部给氧或原位生成策略增加肿瘤中的氧气供应，以此克服缺氧的局限性。但是，由于氧气的过早泄漏和产氧效率不足会导致PDT的氧气调节不理想。
发明内容
为改善现有技术的不足，本发明提供了一种Ce6衍生物TCe6，该衍生物改善了Ce6的溶解性，使其具有出色的两亲性能。本发明进一步提供了一种Ce6/CHC NPs，由Ce6衍生物TCe6与α-氰基-4-羟基肉桂酸酯(CHC)共组装得到，Ce6/CHC NPs可制备成纳米制剂，实现了提高光敏剂的溶解性与改善肿瘤缺氧微环境相结合，能够有效解决PDT中氧气不足和效率低下的问题，从而实现高效的光动力治疗。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种Ce6衍生物，其命名为TCe6，结构式如下所示：
本发明的Ce6衍生物TCe6不仅可以提高Ce6的溶解度，而且能够增加ROS的产生，增强光动力疗法的疗效。
在本发明的第二方面，本发明提供了制备Ce6衍生物TCe6的方法，其包括：将二氢卟吩e6(Ce6)与维生素E琥珀酸酯聚乙二醇(TPGS)进行酯化反应。
维生素E琥珀酸酯聚乙二醇(D-α-tocopherol polyethylene glycolsuccinate，缩写为TPGS，CAS#：9002-96-4，分子式(C2H4O)nC33H54O5是由天然维生素E琥珀酸酯(VES)与聚乙二醇(PEG)酯化而成，其分子量取决于PEG的聚合度n。在本发明的实施方式中，所述TPGS为D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，即VES的羧基与PEG1000酯化得到，简称为TPGS1000，其相对分子量约为1513。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)滴加至Ce6溶液中，在惰性保护气氛下搅拌得到羧基活化的Ce6溶液(简称Ce6-COOH溶液)，将TPGS和4-二甲氨基吡啶(DMAP)引入Ce6-COOH溶液中，在惰性保护气氛下反应。
在本发明的实施方式中，所述制备方法涉及的反应路线如下所示：
在本发明的一些实施方式中，所述方法中，活化Ce6的羧基时，搅拌温度为-10-10℃，优选为0℃，搅拌时间为18-30h，优选为24h。
在本发明的一些实施方式中，TPGS与Ce6反应的温度为室温(10-30℃)，反应时间为42-54h，优选为48h。
在本发明的一些实施方式中，NHS溶液、DCC溶液、DMAP溶液、Ce6溶液、TPGS溶液的溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
在本发明的一些实施方式中，Ce6和TPGS的摩尔比为1-3:1-2，优选为2：1。
在本发明的一些实施方式中，NHS、DCC、DMAP的用量会对反应的程度有影响，在本发明的一些实施方式中，Ce6、TPGS、NHS、DCC、DMAP的摩尔比为2:1:4:4:2时反应更为充分，产率相对更优。
为了获得更纯净的TCe6，该实施方式的一种或多种实施例中，还可以进行纯化精制的过程，比如将反应后的物料去除溶剂后获得粗产品，采用透析法将粗产品提纯，优选地提纯过程为分别采用DMF透析和水透析。透析完成后，将透析后的溶液进行冷冻干燥，可得到TCe6粉末。
在本发明的第三方面，本发明提供了Ce6衍生物TCe6在制备药物载体中的应用。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物载体或载药系统，其以Ce6衍生物TCe6为原料或包含Ce6衍生物TCe6。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种纳米制剂，其包含Ce6衍生物TCe6和至少一种药物。
在本发明的实施方式中，纳米制剂中，Ce6衍生物TCe6可作为药物载体，其所载药物为具有氧气节约性能的药物(降低细胞对内源氧消耗的药物)。在新陈代谢过程中，产生的乳酸通过单羧酸转运蛋白1(MCT1)从肿瘤微环境进入肿瘤细胞，并通过消耗氧气迅速氧化生成三磷酸腺苷。因此，MCT1受体抑制剂，可以抑制乳酸代谢，节约内源性氧气。因此，在本发明的一些实施方式中，所述药物为MCT1受体抑制剂，比如(E)-2-氰基-3-(4-羟基苯基)丙烯酸乙酯和/或α-氰基-4-羟基肉桂酸酯(CHC)等。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米制剂为静脉注射剂。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种TCe6/CHC NPs，其包含Ce6衍生物TCe6和CHC，其由TCe6和CHC在水溶液中共组装得到。所述共组装即TCe6和CHC自发形成有序结构或纳米聚集体(或也称纳米组装体)。
在本发明的一些实施方式中，TCe6/CHC NPs的制备方法包括：将TCe6溶液和CHC溶液混合搅拌后将混合溶液加入水中，搅拌，自发形成纳米聚集体。
在本发明的一些实施方式中，自发形成纳米聚集体后，借助透析袋(截留分子量：1000Da)在黑暗中用水透析所得溶液经膜过滤，可获得TCe6/CHC NPs。
在本发明的一些实施方式中，TCe6与CHC的质量比为1：1-10，尤其当TCe6与CHC的质量比为1:3时，效果更好。
在本发明的实施方式中，TCe6/CHC NPs形态均一，粒径良好且均小于200nm，可制备为静脉制剂。
在本发明的第七方面，本发明提供了上述第一方面中所述的Ce6衍生物TCe6或上述第五方面所述的纳米制剂或上述第六方面中所述的TCe6/CHC NPs在制备抗肿瘤药物或在制备光动力治疗药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗肿瘤药物为治疗结肠癌的药物
在本发明的一些实施方式中，TCe6/CHC NPs具有优异的光动力学性能，可以提高光疗效果，在本发明的实施方式中，TCe6/CHC NPs不仅可以通过Ce6介导的光动力学能力产生ROS，而且具有通过TPGS产生额外ROS的能力。
在本发明的TCe6/CHC NPs可通过EPR效应蓄积于肿瘤部位，具有强大的抑瘤效果。在本发明的一些实施方式中，细胞实验中，TCe6/CHC NPs制剂对癌细胞表现出较强的细胞毒性，且该制剂生物相容性好，暗毒性低；在动物实验中，TCe6/CHC NPs表现出优异的抑瘤效果，抑瘤率高达95％。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明首次合成新型Ce6衍生物(TCe6)，并且首次与CHC共组装形成纳米粒TCe6/CHC NPs，不仅解决了Ce6疏水性强，药物体内递送困难的缺点，还能够增加ROS的产生增强和节约内源性氧气，改善了肿瘤缺氧微环境，增加光疗疗效。TCe6/CHC NPs可通过EPR效应蓄积于肿瘤部位，具有良好的ROS产生能力，在光作用下表现出较强的细胞毒性，并且生物相容性好，暗毒性低，具有优异的抑瘤效果，尤其适用于光动力疗法。
此外，TCe6/CHC NPs稳定性良好，形态均一，粒径良好且小于200nm，可通过EPR效应蓄积于肿瘤部位，有利于静脉注射，也易于运输和保存，为工业的贮存提供有利条件。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例2的TCe6的核磁图谱；
图2为本发明实施例3的TCe6/CHC NPs的紫外图谱；
图3为本发明实施例4的TCe6/CHC NPs体外细胞毒性实验结果图，左图为光作用下的细胞毒性结果，右图为无光(暗)环境下的细胞毒性结果；
图4为本发明实施例5的TCe6/CHC NPs体外ROS实验结果图；
图5为本发明实施例6的TCe6/CHC NPs的体内抗肿瘤实验结果图；左图为瘤体积的变化曲线图，右图为肿瘤重量和肿瘤抑制率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1TCe6分子合成
分析天平精密称取一定量的Ce6，溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，置于50mL圆底烧瓶中。称取一定量的NHS、DCC，溶于无水的DMF中，加入正在搅拌的Ce6溶液中，在氮气保护、0℃条件下反应24h。将活化后的Ce6-COOH过膜除去杂质并置于50mL圆底烧瓶中，称取一定量的DMAP和TPGS溶于无水DMF中，加入正在搅拌的Ce6-COOH中，在氮气保护、常温条件下反应48h。其中Ce6、TPGS、NHS、DCC、DMAP的摩尔比为2:1:4:4:2。反应结束得到粗产物，分别用DMF透析和水透析(透析袋截留分子量:1500Da)提纯，并将最后TCe6溶液冷冻干燥得到TCe6，TCe6纯品为深绿色固体，产率为51.92％。
实施例2核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定TCe6化学结构。
称取TCe6约为5mg，氘代二甲亚砜(DMSO-d6)溶解并置于核磁管内，采用400MHz核磁共振氢谱仪测定其核磁共振氢谱，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1所示，核磁结果可以证实，新合成的分子中出现了原料分子Ce6和TPGS的峰，证实TCe6的成功合成；同样，图2左图紫外结果辅助证实TCe6的成功合成。
实施例3TCe6/CHC NPs的制备。
精密称取TCe6约5mg，溶于50μLDMF中；精密称取15mg CHC溶于150μLDMF中，将TCe6溶液和CHC溶液充分混匀，搅拌15min，得到的混合溶液滴加入搅拌的4mL水中，纳米聚集体自发形成，将得到的制剂用透析法(透析袋截留分子量：1000Da)除去有机溶剂，并过0.8nm滤膜除去杂质，得到最终制剂。紫外结果如图2右图所示，显示制备的TCe6/CHC NPs中同时出现TCe6和CHC的特征峰，证实制剂的成功制备。
制备得到的TCe6/CHC NPs应用于下述实施例4-6中。
实施例4TCe6/CHC NPs体外细胞毒性实验
1、细胞的培养
选取结肠癌系CT26细胞作为研究对象。CT26细胞在37℃、5％CO2的潮湿环境，含有10％胎牛血清(FBS)，1％链霉素/青霉素的RPMI 1640培养基中培养。待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。在后面的测试中，将CT26细胞与不含葡萄糖的RPMI 1640(含有10×10-3M乳酸)在37℃下孵育，该培养基称为乳酸1640培养基。
2、细胞毒性的实验
收集对数生长期的CT26细胞，用乳酸1640培养基将细胞稀释为3×104个/mL。用培养基将待测目标化合物Ce6、CHC、TCe6、TCe6/CHC NPs制剂各稀释至(Ce6的浓度为1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μg/mL；CHC的浓度为0.7，1.4，2.8，4.2，5.6，7.0μg/mL)。细胞以6×103个/孔(200μL)的浓度加入96孔板中细胞过夜贴壁后，弃去培养基，加入不同浓度的目标化合物溶液200μL，每个浓度设置3个复孔，设不加药物的孔为阴性对照组，不加细胞的组为空白对照组，所有组37℃孵育6h。然后弃去含药培养基，换成新鲜乳酸1640培养基，Ce6组、TCe6组和TCe6/CHC NPs组均用660nm激光器照射(功率均为100mW/cm2，照射时间为2min)。为考察Ce6、TCe6和TCe6/CHC NPs本身的暗毒性，同时设立暗毒性孔，除不经激光照射外，所有处理均一致。继续孵育20h，各孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，孵育4h后弃去孔内液体，每孔加100μL的DMSO溶解，用酶标仪测定490nm处吸光度，按以下公式计算抑制率：
其中，A阴性表示未经药物处理的细胞的孔的吸光度，A样品表示各种样品处理过的细胞的孔的吸光度，A空白表示没有接种细胞且没有药物处理的孔的吸光度。
不同样品在不同浓度下对CT26细胞抑制率实验结果如图3，在光照射下，TCe6/CHCNPs表现出优异的细胞毒性，在无光状态下，暗毒性较低，具有良好的生物相容性。
实施例5TCe6/CHC NPs体外ROS产生实验
1、细胞的培养
选取结肠癌系CT26细胞作为研究对象。CT26细胞在在37℃、5％CO2的潮湿环境，含有10％胎牛血清(FBS)，1％链霉素/青霉素的RPMI 1640培养基,中培养。待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。在后面的测试中，将CT26细胞与不含葡萄糖的RPMI 1640(含有10×10-3M乳酸)在37℃下孵育，该培养基称为乳酸1640培养基。
2、体外ROS的实验
使用ROS探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)评估Ce6介导的PDT中的ROS产生。ROS氧化的荧光DCF可以通过流式细胞仪测量。将CT26细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔板中，孵育24小时后，将细胞在含有等量Ce6(3μg/mL)、TPGS(10.9μg/mL)、TCe6/CHC NPs的新鲜培养基中培养。孵育6小时后，将细胞洗涤，与20μg/mL DCFH-DA在无RPMI葡萄糖的1640培养基(无FBS)中孵育20分钟，然后用660nm激光以100mW/cm2的功率强度照射2分钟。同时设立暗组孵孔，除不经激光照射外，所有处理均一致。
从图4可以看出，通过将TPGS与Ce6结合而证实了TCe6/CHC NPs的优异的光动力学性能，其不仅可以通过Ce6介导的光动力学能力产生ROS，而且具有通过TPGS产生额外ROS的能力。
实施例6TCe6/CHC NPs体内抗肿瘤实验
Balb/c小鼠腋下荷瘤(每只80万个4T1细胞)，等瘤长至80mm3左右，随机分成4组，每组5只，分别静脉注射生理盐水(NS)、Ce6、TCe6、TCe6/CHC NPs，注射后6h用660nm激发光照射(100mW/cm2)10min。在治疗过程中记录瘤体积的变化。6次治疗过后，处死小鼠，取出肿瘤，称重并计算抑瘤率。
其中，wNS是生理盐水组小鼠的平均瘤重，w样品是其他各组小鼠的平均瘤重。
图5可以看出，由于TPGS放大了Ce6产生的ROS，TCe6组小鼠瘤体积生长较Ce6组缓慢，并且CHC为光敏剂节约氧气和纳米制剂的EPR效应使肿瘤部位药物蓄积多，所以TCe6/CHC NPs制剂抑瘤效果明显优于TCe6组，抑瘤率高达95％。表明该制剂极大地提高了抗肿瘤效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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