具体实施方式

图1A示出了液滴颗粒10的一个实施方式。如本文所使用的术语“液滴颗粒”是指包含在悬浮在不混溶相16(例如，油)中的不连续体积的分散(例如，水)相溶液或流体14中、含有或与之结合的固相颗粒或液滴-载体颗粒12。液滴-载体颗粒12(或者有时也称为颗粒12)是小型、亚毫米尺度(在它们的最长维度)的并且在一个优选的实施方式中，是从在一个优选实施方式中亲水的交联水凝胶材料形成的球形或椭球形颗粒。液滴-载体颗粒12的典型尺寸范围(直径或最长尺寸)在约10μm至约500μm之间，更优选地在20μm至200μm之间并且甚至更优选地在40至120μm之间。每个液滴-载体颗粒12具有在其中形成的空隙体积或空腔18。空隙或空腔18限定了保持至少一部分分散相溶液或流体14(例如，水相)的三维体积。保持在空隙或空腔18内的典型流体体积包括约100fL至约10nL范围内的体积。液滴-载体颗粒12内的空隙或空腔18的长度尺寸(例如，球形空隙的直径)为几微米，通常大于约5μm并且小于约250μm。在一些实施方式中，液滴-载体颗粒12包含在水相溶液或流体14的完整液滴内，其中所述溶液或流体14的一部分也位于空隙或空腔18中。这在图1A中得到显示。

在一个实施方式中，提供了使用与悬浮在不混溶流体中的固相液滴-载体颗粒12结合的分散体积的液滴-基乳液系统。在该系统中，根据一个实施方式，多个水性液滴颗粒10形成了包含在油16中的乳液。油16起到连续相(即乳液外相)的作用，而水基液滴颗粒10起到分散相(即乳液内相或要包封的相)的作用。油16围绕液滴颗粒10以产生单分散液滴颗粒10乳液。单分散是指液滴颗粒10在每个液滴颗粒10中保持基本相同体积流体的能力。

在另一个实施方式中，多个油基液滴颗粒10形成包含在水性流体16中的乳液。水性流体16起到连续相(即乳液外相)的作用，而油基液滴颗粒10起到分散相(即乳液内相或要包封的相)的作用。水性流体16围绕液滴颗粒10以产生单分散液滴颗粒10乳液。该实施方式是其中液滴-载体颗粒12是疏水性的而周围连续相为水基的在先实施方式的相反情况。

图1A示出了包含与液滴-载体颗粒12的外表面接合、与之连通或对其开放的空隙或空腔18的液滴-载体颗粒12的实施方式。如本文所解释的，可以作为采取球形形状的减去的空隙或空腔形成空隙或空腔18，从而产生如图1A中所示的具有新月形横截面的最终的液滴-载体颗粒12。内接的空隙或空腔18与球形或椭圆包封在其表面相交以产生用于流体填充的流径(以及细胞、珠及其它微小物体的通路)。在一个优选的方面，空隙或空腔18与球形或椭圆包封在窄开口(即液滴-载体颗粒12的球形或椭圆包封的真实表面区的下方部分)相交。在一些实施方式中，通过所述开口所限定的该部分区域是液滴-载体颗粒12的整个球形/椭圆包封或表面积的<33％，在其它情况下，<10％，并且在其它实施方式中，所述部分区域<5％。

可替换地，在一些实施方式中，所述减去的空隙或空腔18不与球形包封表面相交。例如，图1B示出了包括完全位于三维亲水液滴-载体颗粒12内部并且不与三维亲水液滴-载体颗粒12表面相交的空隙或空腔18的液滴-载体颗粒12的一个这种实施方式。在该实施方式中，可以使形成液滴-载体颗粒12的材料可渗透或半渗透，从而流体、试剂和/或样品可以扩散通过液滴-载体颗粒12并进入空隙或空腔18。同样地，在一些实施方式中，基于尺寸反应产物可以能够从液滴-载体颗粒12中扩散出来。可以通过调整形成液滴-载体颗粒12的潜在材料的孔隙度来调节扩散的具体截止尺寸。通常，较大的物质，如细胞、珠或其它微小物体将不能扩散通过液滴-载体颗粒12，而流体和小分子及其它物质能够扩散通过液滴-载体颗粒12。在相关实施方式中，空隙或空腔18保持或携带了允许样品分子和试剂从围绕流体分子扩散的多孔聚合物材料(例如，未交联的葡聚糖)。优选地，在该实施方式中，位于空隙或空腔18中的多孔聚合物材料比形成液滴-载体颗粒12的潜在材料更多孔。

在一些实施方式中，可以用一个或多个反应性或结合部分20修饰液滴-载体颗粒12表面，如图1A、图12、图13A、图13B、图16、图17A所示，以使得液滴颗粒10能够官能化并使得液滴颗粒10与多种标准测定相容。例如，可以在空隙或空腔18内的液滴-载体颗粒12表面上形成反应性或结合部分20。举例来说，结合或反应性部分20可以包括核酸、肽、细胞粘附肽、催化剂、酶、抗体、引物、抗原、适体、生物素或生物素/抗生蛋白链菌素复合物。本领域技术人员已知的正交反应性化学还可以用于反应性或结合部分20与液滴-载体颗粒12的缀合。

如本文所解释的，在利用亲水液滴-载体颗粒12的实施方式中，通过将液滴-载体颗粒12在水相中的悬浮液与油(和任选的表面活性剂)合并并混合(例如，通过涡旋、移液等)实现了液滴颗粒10的形成，如图2所示。搅拌和来自混合的流体动力学剪切产生了降低尺寸的乳液。在继续搅拌后，包含在液滴内的液滴-载体颗粒12起到了防止液滴进一步缩小的尺寸限制的作用。其中液滴-载体颗粒12含有空隙或空腔18的固体-模板化液滴还可以是热力学稳定的。随着温度或时间的增加，液滴颗粒10不以由于一旦聚结而使得系统界面能降低，水相中分散相的无支持液滴将聚结的相同方式聚结。移液和涡旋两者可以用于形成液滴颗粒10。使用通过移液和/或涡旋的混合，可以与不包含液滴-载体颗粒12的较小的卫星液滴一起实现液滴颗粒10的均一乳液。在均一颗粒-模板化乳液的一个实施方式中，基本所有含颗粒的液滴(例如，>95％、>99％或者>99.9％)分别与单个液滴-载体颗粒12结合。由于它们独特的尺寸范围，可以使用图像分析容易地识别液滴颗粒10或者使用标准过滤技术，从周围较小的卫星液滴(即液滴颗粒10形成期间所产生的背景液滴)过滤液滴颗粒10。卫星液滴也将不含附接至液滴-载体颗粒12的反应性部分20，并因此不继续进行在液滴颗粒10内发生的反应。当总样品的水性体积小于或等于可以通过与样品混合的每个液滴-载体颗粒12支持的体积之和时，可以显著降低或消除卫星液滴。

通常，据发现对于液滴颗粒10的形成，移液的表现优于用于形成单分散液滴颗粒10的涡流，其中大部分的水乳液仅含有单个液滴-载体颗粒12(参见，例如，图4B和图4E)。可以通过机械扰动/轻敲含有样品的试管，或者通过使用具有大直径开口的移液器(例如，1000μL移液器)，然后通过涡旋或使用较小直径(例如，100、200μL移液器)的移液破碎成较细小的乳液，首先打破液滴-载体颗粒12在油中的初始悬浮，从而改善液滴颗粒的形成。

存在于有机相中的表面活性剂的浓度也影响形成的液滴颗粒10的单分散性和含有单个液滴-载体颗粒12的体积部分。作为一般趋势，提高油相中表面活性剂的浓度导致产生了液滴-载体颗粒12向含有单个颗粒的液滴颗粒10的更好分散。Novec 7500中大于0.5％v/v的Pico-Surf浓度导致了高单分散性。在优选的实施方式中，将Novec 7500中的2％v/v的Pico-Surf用作连续相，从而导致产生了形成的液滴颗粒10几乎完全的单分散性。可以通过在水相(例如，Pluronic F-127、Triton X-100)内添加水性表面活性剂来获得对液滴颗粒单分散性的进一步改善。在一个实施方式中，在水相中包含了0.1％Pluronic F-127以减少颗粒聚集并降低表面张力，从而导致产生了更均一的液滴颗粒10。在另一个实施方式中，添加处于水分散相中的1％w/v PEG-5000降低了颗粒12的聚集，从而获得了更均一的液滴颗粒10。

还应注意如液滴-载体颗粒12的聚合物组成或者分散相的盐浓度等因素影响液滴-载体颗粒12在溶液中对彼此的亲合力。例如，优选从较高wt％的PEG形成的球形液滴-载体颗粒12。6wt％的PEG比3wt％更优选。12wt％的PEG液滴-载体颗粒12更优选。因此，聚合物骨架制剂可以影响液滴-载体颗粒12在溶液中正确分散以形成单分散液滴颗粒10所需的表面活性剂浓度。另外，使用低盐溶液，如DI水提高液滴颗粒的单分散性。

油相的选择也可以影响所得液滴颗粒10的功能。例如，在形成比替代油相(如具有RAN表面活性剂的Fluorinert^TM FC-40油)更均一的液滴颗粒10中，优选注入了Pico-Surf表面活性剂的Novec-7500，尽管该条件也能够形成液滴颗粒10。然而，当与具有Pico-Surf的Novec-7500相比时，具有RAN表面活性剂的Fluorinert^TM FC-40显示出改善的热稳定性。因此，某些应用可以受益于油相的更换。例如，对于高温应用，如用于DNA扩增的热循环，可以在Novec-7500中形成液滴颗粒10以获得单分散乳液，然后可以去除并用Fluorinert^TM FC-40替换Novec油。

图2示出了形成液滴颗粒10的一种方法。提供了在分散相中干燥或悬浮的第一液滴-载体颗粒12。这些可以包含在支架或容器22中(例如，示出了Eppendorf管，尽管也可以使用其它支架或容器)。如果不存在分散相，则将分散相(例如，水相)添加至支架或容器22。在另一个实施方式中，可以添加初始分散相或与另一种分散相交换，如图2中的操作100所示。图2示出了包含在分散相14中的液滴-载体颗粒12。然后，如操作110中所示，与任选的表面活性剂一起添加连续相26(例如，油相)。然后，对支架或容器22进行搅拌操作120，其可以包括涡旋、移液等。搅拌操作120产生了液滴颗粒10，并且在一些情况下产生了卫星液滴28。可以使用(例如)混合物的过滤去除卫星液滴28。可以通过控制液滴颗粒10形成期间所添加的分散相的体积来最小化卫星液滴28的形成。

图3示出了以使用5μM FITC葡聚糖(500kDa)溶液作为分散相14并且以所添加的具有0.5％Pico-Surf^TM表面活性剂的Novec^TM 7500氟化油作为连续相16的液滴颗粒10的形成。图3示出了在乳化前(左图)和其中形成液滴颗粒10的乳化后，包含在分散相14中的液滴-载体颗粒12。以下提供了乳化前(左图)和乳化后(右图)的相应图像。荧光图像示出了液滴颗粒10的空隙或空腔18内的明显信号(右图)。

图4A示出了形成的所得乳液的图像(使用球形颗粒12来模板化由具有0.5％Pico-Surf^TM表面活性剂的Novec^TM 7500氟化油组成的连续相中的水滴)。在明视野图像(左图)中示出了液滴颗粒10并且在荧光通道(右图)中示出了球形液滴-载体颗粒12。示出了尺寸高度可变的卫星液滴28以及荧光-染色的液滴-载体颗粒12覆盖的均一液滴颗粒10两者。图4B示出了显示作为每滴液滴的液滴-载体颗粒12的函数的液滴计数的图。在含有液滴-载体颗粒12的液滴中，几乎全部仅含单一液滴-载体颗粒12。图4C示出了显示液滴尺寸分布的图，液滴尺寸分布显示出一定范围的不均一卫星液滴28以及通过包封的液滴-载体颗粒12(即液滴颗粒10)形成的液滴的均一区。

图4D示出了显示液滴尺寸分布的图，液滴尺寸分布显示出一定范围的不均一卫星液滴28以及通过包封的新月形液滴-载体颗粒12形成的液滴的均一区(即液滴颗粒10)。将新月形液滴-载体颗粒12用于模板化由具有0.5％Pico-Surf^TM表面活性剂的Novec^TM 7500氟化油所组成的连续相中的水滴。图4E示出了显示作为每滴液滴的液滴-载体颗粒12(新月形)的函数的液滴计数的图。在含有液滴-载体颗粒12的液滴中，几乎全部仅含单一液滴-载体颗粒12。

图5示出了根据替代实施方式，液滴颗粒10与卫星液滴28的分离。在这些实施方式中，施加外力或外力组合(例如，磁力、重力、浮力、拖曳力、向心力等)，从而液滴颗粒10和卫星液滴28经历了不同的作用力(大小和/或方向)。例如，液滴-载体颗粒12可以含有磁性材料以及用于将液滴颗粒10与对所施加的磁场不起反应的卫星液滴28分离的外加磁场。

例如，图6A和图6B示出了在存在硫醇化磁性颗粒(1μm)的情况下胶凝并随后在氟化油中乳化，然后分离的PEG-乙烯砜微凝胶颗粒的图像。图6A显示初始乳化导致产生了处于大的空卫星液滴28背景中的包封磁性微凝胶颗粒的水液滴(AD)。图6B示出了在施加磁场后，乳化的磁性微凝胶颗粒可以与空卫星液滴28背景分离。

为了生产具有空隙或空腔18的液滴-载体颗粒12，提供了用于在油相中形成其中内部分散相包含水性两相系统的单分散乳液的微流体液滴产生器装置30。一部分水性两相系统是可交联的水凝胶前体，如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。另一部分水性两相系统是聚合物，如葡聚糖。然后，所述水性两相系统的两个相在形成的液滴内分成明显的区域。然后，两相系统的一个组分(即可交联组分)交联以形成液滴-载体颗粒12。图7A示意性示出了产生具有在其中形成的空隙或空腔18的液滴-载体颗粒12的方法。如图7A所示，将水性两相系统用于形成液滴-载体颗粒12。在该具体实施方式中，所述水性两相系统包括作为可交联组分(使用交联剂)的PEG或PEG-衍生物(例如，10kDa 4-臂PEG-降冰片烯)和不交联的葡聚糖(例如，40kDa)。将微流体液滴产生器装置30用于产生水性两相系统在油相内的乳化。在相分离操作中的液滴形成之后，含有两个水相组分(例如，PEG和葡聚糖)的液滴分离。相分离后，PEG或PEG-衍生物组分交联成凝胶。例如，然后在存在光引发剂(例如，2959、LAP等)的情况下，对PEG或PEG-衍生物组分内的交联剂，如二硫苏糖醇(DTT)进行光暴露(例如，UV激发)以引发交联。当然，也可以使用其它交联剂，如含半胱氨酸的肽或其它二巯基化物或多臂交联剂。在另一个实施方式中，实施通过UV光和光引发剂引发的多臂PEG-降冰片烯+二巯基化物交联剂之间的硫醇烯反应。在相关实施方式中，PEG和/或聚合物相中的任一个可以含有光引发剂和交联剂之一或两者的组合。交联后，可以清洗液滴-载体颗粒12以去除油相和葡聚糖相。

图7B示出了用于使用流动聚焦，产生具有空隙或空腔18的液滴-载体颗粒12的微流体液滴产生器装置30的设置图。微流体液滴产生器装置30包括汇聚/相交到其中产生乳液(液滴)的液滴产生区或区域38的一些微流体通道32、34、36。所产生的液滴沿可以通向其中液滴可以积累并暂时存储的室或区42的另一个微流体通道40移动。装置30中的出口44可以用于去除液滴/液滴-载体颗粒12。每个微流体通道32、34、36包括用于输入多种组分的各个入口46、48、50。在本实施例中，PEG(例如，4-臂10kDa PEG-降冰片烯)和葡聚糖(例如，40kDa)相在微流体装置30中同向流动以在油(例如，Novec^TM 7500+0.25％Pico-Surf^TM)中产生单分散乳液。在一个实施方式中，将通向微流体通道32的第一入口46用于递送油相以及表面活性剂。将通向微流体通道34的第二入口48用于递送葡聚糖。将通向微流体通道36的第三入口50用于递送PEG以及交联剂和光引发剂。在另一个实施方式中，将通向微流体通道32的第一入口46用于递送油相以及表面活性剂。将通向微流体通道34的第二入口48用于递送葡聚糖以及交联剂。将通向微流体通道36的第三入口50用于递送PEG以及光引发剂。在液滴产生前，当使用可以在样品注射器或通道入口内开始交联，从而停止流动的高反应性化学时，聚合物前体和交联剂的分离是特别有用的。在另一个实施方式中，交联剂不包括在PEG或葡聚糖相内，但是作为替代在其自身的其它入口和连接通道中注射。当交联剂不易于溶解在葡聚糖相中，例如，较大的硫醇化PEG交联剂时，这是有利的。

一旦形成液滴，PEG和葡聚糖相分离，并随后PEG相交联。如上所述，在一个实施方式中，将UV激发用于交联凝胶。更具体地，将光引发剂(2％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP))预分散在PEG相中，并且将交联剂(DTT)预分散在葡聚糖相中。在相分离后，将UV光用于产生在PEG-降冰片烯和DTT交联剂之间引发硫醇烯反应以产生形成液滴-载体颗粒12的凝胶基质的基团。在液滴通过微流体液滴产生器装置30的出口44离开后，交联可以发生在微流体液滴产生器装置30中或者“片外(off chip)”发生。交联后，清洗液滴-载体颗粒12以去除油和葡聚糖相。

在另一个实施方式中，将pH水平变化用于交联液滴-载体颗粒12。例如，在微流体液滴产生器装置30中的水滴形成之前，在较低的pH使用PEG-乙烯砜/马来酰亚胺+二巯基化物交联剂以防止胶凝。然后，通过在下游油相中添加有机碱(例如，三乙胺)来提高分散相中的pH，从而引发交联反应。在相关实施方式中，如de Rutte,J.M.,Koh,L,Di Carlo,D.,Scalable High-Throughput Production of Modular Microgels for In Situ Assemblyof Microporous Tissue Scaffolds.Adv.Fund.Mater.2019,29,1900071(该文献作为参考并入本文)中所述的，并行步骤乳化液滴产生器微流体装置30在对处于单一溶液中与葡聚糖相预混合的预聚物相操作以产生单分散液滴，然后相分离和聚合(例如，通过UV光或pH变化)。在所有上述实施方式中，在PEG交联后，可以去除葡聚糖相并且添加或替换所期望的水相以形成液滴颗粒10。注意在一些实施方式中，如当形成中空液滴-载体颗粒12时，如图1B举例说明的，内部葡聚糖相可以维持在空隙或空腔18内。

图8A示出了实施例PEG-葡聚糖水性两相系统的相图。通过调节PEG和葡聚糖两者的相对浓度，可以调节液滴-载体颗粒12内的空隙空间或空腔18的形态和/或体积。在本文中，使用了20kDa 8-臂PEG乙烯砜和40kDa葡聚糖溶液。使用图7B所示的微流体液滴产生器装置30形成了乳液。可以通过改变它们的相对浓度来调节PEG和葡聚糖区的形态。在稀释浓度下，葡聚糖和PEG相保持混合。在不太稀释的浓度下，PEG和葡聚糖经历相分离。由于在最终液滴中葡聚糖与PEG的浓度比升高，因此内部葡聚糖区的体积分数升高。随着PEG和葡聚糖的总浓度升高，两相之间的表面张力导致葡聚糖区凸起(右上方图)。所示的液滴直径为约100微米。对于高PEG和葡聚糖浓度的条件，发现相分离较快(<1秒)。在双结点附近的条件，发现相分离所需时间更长(>1秒)。

图8B示出了实施例PEG-葡聚糖水性两相系统的相图。在该实施方式中，使用了10kDa 4-臂PEG-降冰片烯和40kDa葡聚糖溶液。通过调整PEG和葡聚糖的浓度，可以调节液滴和所得的UV交联的液滴-载体颗粒12两者的形态。在稀释浓度下，PEG和葡聚糖相作为单相保持混合(双结点线以下)。在高浓度(双结点以上)下，PEG和葡聚糖相在液滴内分成明显的PEG-富集和葡聚糖-富集相。随着PEG和葡聚糖总浓度升高，两相之间的表面张力升高，从而导致葡聚糖相与较大部分的油界面接触(右上图)。在通过UV光交联后，所得的液滴-载体颗粒12(除了未经历相分离的一个实施例以外)维持类似的空腔体积(相对于液滴-载体颗粒12的总尺寸)，但是具有升高的空腔开口尺寸。随着葡聚糖与PEG浓度的相对比的升高(下图)，葡聚糖富集相的体积也升高。UV交联后，具有较大体积的葡聚糖富集相的液滴-载体颗粒12按比例具有较大的空腔或空隙18。另外，据发现对于双结点曲线附近的条件，特别是具有较高葡聚糖量的情况，在交联后，空腔维持完全封闭(空隙不接触外部颗粒12的包封)。

图9示出了使用微流体液滴产生器装置30，使用水性两相系统方法制造的一定范围的液滴-载体颗粒12。在交联和清洗步骤后，液滴-载体颗粒12膨胀至其原始直径的约130％。对于本文所示的条件，使用了20％w/v40kDa葡聚糖和15％w/v 4-臂PEG-降冰片烯(10kDa)。使用微流体通道高度为70微米并且接合点处的宽度为60微米的微流体液滴产生器装置30，以4微升/分钟的PEG流速、1微升/分钟的葡聚糖流速以及分别为10和20微升/分钟的油流速，制造了100微米和80微米直径的液滴-载体颗粒12。使用微流体通道高度为18微米并且接合点处的宽度为35微米的微流体液滴产生器装置30，以2微升/分钟的PEG流速、0.5微升/分钟的葡聚糖流速以及分别为5、10和20微升/分钟的油流速，制造了55、45和40微米直径的液滴-载体颗粒12。

图10A示出了未交联的乳液的图像以及作为在氟化油中形成的PEG-葡聚糖乳液的外部PEG包封和葡聚糖内部组分的直径的函数的液滴计数图。图像分析显示出对于PEG(CV＝0.75％)和葡聚糖相(CV＝1.45％)两者直径的高-均一性。CV是变异系数。图10B示出了在水中分散并且使用荧光显微术成象的交联的液滴-载体颗粒12的图像。液滴-载体颗粒12与TRITC-马来酰亚胺染料缀合以在荧光通道中显示它们-类似的荧光团缀合步骤可以用于液滴-载体颗粒12的荧光条型码化。图10B还示出了作为交联液滴-载体颗粒12的直径的函数的颗粒计数的图。颗粒尺寸分布是均一的(CV<5％)。

图10C和图10D示出了在水中分散并且使用荧光显微术成象的液滴-载体颗粒12。在通过液滴产生器装置30的出口区时，通过UV光使液滴-载体颗粒12交联。在制造过程期间，通过添加生物素-PEG-硫醇修饰液滴-载体颗粒12以具有生物素基团。然后，用AlexaFluor^TM 568抗生蛋白链菌素标记液滴-载体颗粒12，所述Alexa Fluor^TM 568抗生蛋白链菌素结合至液滴-载体颗粒12表面上的生物素以使它们荧光显象。荧光图像分析显示出高均一性(外径CV＝1.5％，开口直径CV＝2.1％)，如图10E所示。

图11A示出了液滴颗粒10体积变化的理论计算。在本文中，将通过球形液滴-载体颗粒12模板化的液滴颗粒10与新月形液滴-载体颗粒12(即含有空隙或空腔的颗粒)一起考虑并与通过微流体装置30形成且其中不含任何颗粒12的液滴相比较。该分析基于在乳化过程期间，可以很好地控制空腔18内的体积，同时较少控制液滴-载体颗粒12周围的流体外径的结果。液滴-载体颗粒12不限于固定尺寸，并且液滴外径相对于颗粒直径变化。通过使用具有空腔或空隙18的液滴-载体颗粒12，与总体积相比，分散相体积的变化随着直径升高而降低。更具体地，分散相体积变化随内部空腔18直径与外部颗粒直径的比的升高而降低，这有利于在液滴颗粒10中实施均一反应。随着新月形颗粒12的空隙率的增加，例如，对于D_in/D_out＝0.50和0.75，这种行为接近无内部颗粒的球形液滴的理想状况。

图11B和图11C示出了液滴颗粒10中的试剂包封效率的理论计算。在本文中，据考虑液滴颗粒10是通过球形液滴-载体颗粒12和新月形液滴-载体颗粒12(即含有空隙或空腔的颗粒)模板化的。据认为包封试剂或样品不会自由扩散到颗粒基质中。将包封效率定义为在液滴颗粒形成后，与液滴颗粒10结合的液滴-载体颗粒12的初始浓缩悬浮液中的样品体积部份。预期未包封的试剂将形成卫星液滴28。将初始颗粒悬浮液的空隙率定义为占据液滴-载体颗粒12包封以外区域的总体积(样品+颗粒)部份。为了新月形颗粒12和球形颗粒12之间的归一化计算，不认为内部空腔18体积是初始空隙率的一部分。图11B表明对于具有相对较大空腔的颗粒12以及对于具有较厚外部水层的液滴颗粒10，包封效率提高。在两种情况下，颗粒12占据了较小部分的最终液滴颗粒10体积，从而允许相对更大样品体积的包封。图11C表明在液滴颗粒10形成(从而降低空隙率)之前，提高液滴-载体颗粒12的浓度将提高包封效率。在其中空隙率升高的情况下，在所述系统中存在相对较多的试剂或样品，并且液滴颗粒10快速饱和，从而导致形成较大体积的卫星液滴28并因此降低包封效率。

图12显示如何可以使用多种不同反应性部分修饰液滴-载体颗粒12以使得颗粒能够官能化并使得液滴颗粒10与多种标准测定相容。例如，可以在空隙或空腔18内的液滴-载体颗粒12表面上形成反应性或结合部分20。举例来说，结合或反应性部分20可以包括核酸、肽、细胞粘附肽、催化剂、酶、抗体、引物、抗原、适体、生物素或生物素/抗生蛋白链菌素复合物。本领域技术人员已知的正交反应性化学还可以用于反应性或结合部分20与液滴-载体颗粒12的缀合。

在一个实施方式中，可以在葡聚糖相内与硫醇基交联剂一起添加含有游离半胱氨酸基团的肽或较大的蛋白。随着这些肽与水凝胶相的合并，它们可以共价连接至包括降冰片烯的聚合物骨架上的硫醇反应性位点。为了促进CHO细胞与液滴-载体颗粒12的粘附，这种方法已用于在液滴-载体颗粒12的生产期间包括细胞粘附肽。在葡聚糖相内使用至少4mg/mL浓度的整合素结合肽RGD，并且即使在存在强烈机械搅拌、离心和液滴-载体颗粒分选的情况下也显示出维持细胞与液滴-载体颗粒12结合的足够的粘附强度。在另一个实施方式中，可以在于葡聚糖相混合前后，将含有游离半胱氨酸基团的肽或较大的蛋白添加至PEG相并交联。

在第二示例性实施方式中，通过在液滴-载体颗粒12的生产期间，在PEG相内引入0.5mg/mL-5mg/mL之间的任何浓度的5kDa生物素-PEG-硫醇，直接通过生物素修饰液滴-载体颗粒12。一旦暴露于UV光并且在存在光引发剂的情况下，如在本文所公开的多种实施方式中所述的，这些分子上的额外的硫醇基团结合至水凝胶主链上的硫醇反应性部分，从而获得通过生物素基团均一修饰的液滴-载体颗粒12。通常也用抗生蛋白链菌素基团修饰生物素化位点以使得能够与第二生物素化分子缀合。可以基于每个颗粒所期望的结合位点数来调整所使用的抗生蛋白链菌素的量。通过实验确定在以从各个细胞捕获分泌物蛋白为中心的多个实施方式中，8-10μg/mL的抗生蛋白链菌素足以涂覆液滴-载体颗粒12的外部并在宽动态范围产生分泌物信号。然而，在其中通过生物素-抗生蛋白链菌素反应将细胞附着至颗粒12并且使用生物素化的捕获抗体在液滴-载体颗粒12表面上同时捕获分泌物的其它实施方式中，已使用了10μg/mL-250μg/mL范围内的更高浓度的抗生蛋白链菌素。特别注意，通常将抗生蛋白链菌素添加至PBS中的液滴-载体颗粒12，因为外源生物素是细胞培养基中的常规添加剂并且可能使多个可用的结合位点预先饱和。

图13A和图13B示出了如何可以在液滴颗粒10中进行数字测定，如PCR(图13A)和ELISA(图13B)。将核酸或抗体官能化的液滴-载体颗粒12在水溶液中与适当的测定试剂(例如，靶标DNA、分析物、报告染料、第二抗体、引物、DNTP、聚合酶)混合。所关心的分析物优先与液滴-载体颗粒12表面自结合，从而允许后续清洗以去除背景信号。然后，通过机械搅拌使液滴-载体颗粒12乳化以形成液滴颗粒10分离分析物并在液滴体积内或液滴-载体颗粒12本身上产生信号(例如，通过酶扩增)。在其中直接在液滴-载体颗粒12上捕获信号的实施方式中，可以使乳液破裂并且可以直接通过观察通过荧光显微术或流式细胞术(例如，使用流式细胞仪150)的液滴-载体颗粒12上的荧光或比色信号来进行读数。在其中信号在液滴颗粒10内积累但是不与液滴-载体颗粒12直接结合的实施方式中，可以直接通过观察通过荧光显微术或其它荧光成象方式或者适合于油连续相16的一些商品化的流式细胞术系统的荧光或比色信号变化来分析液滴颗粒10乳液。

图14A-图14C显示液滴颗粒乳化不影响细胞存活力。将用hoescht和钙黄绿素染色的Jurkat细胞与液滴-载体颗粒12一起悬浮在水溶液中。通过机械搅拌使液滴-载体颗粒12在氟化油中乳化以形成含有细胞的液滴颗粒10。通过荧光显微术在几个通道中使液滴颗粒10成象，其包括显示细胞形态的明视野(图14A)、显示hoescht-染色的核的DAPI(图14B)和显示钙黄绿素-标记的活细胞的FITC(图14C)。

图15A-图15D示出了引入液滴-载体颗粒12中的条型码的代表性实施方式的总览。图15A示出了如何维持内部空隙或空腔18的尺寸，同时改变液滴-载体颗粒12的外部尺度。通过尺寸范围识别了具有独特化学或性质的液滴颗粒10。在图15B中，用具有不同强度的一种或多种染料修饰液滴-载体颗粒12(在该实施方式中，示出了具有不同强度的两种染料)。通过强度或多个染料强度的比(例如，染料1：染料2或者染料2：染料1)定义独特的液滴-载体颗粒类型。在图15C中，将具有不同数目或磁含量的磁性颗粒52包埋/交联在液滴-载体颗粒12上/中，从而允许通过相对磁力分离。在图15D中，将不同数目和大小的光散射颗粒54包埋/交联到液滴-载体颗粒12上或中，从而使得能够基于相对光散射量/强度或者散射角分离或单独分析独特的液滴-载体颗粒类型12。

液滴颗粒系统的优势

使用液滴颗粒10的系统的明显优势在于在短期(约1min)内产生大量均一液滴的能力。例如，考虑了对于单个细胞分析，将包封1000万个细胞样品的情况。加载到微流体-产生的液滴中的单个泊松分布需要产生10⁸个液滴(假设包封效率为10％)。典型的微流体液滴产生器装置30以1000Hz的速率产生液滴，从而需要28个小时来包封整个细胞群体。在某些情况下，次级珠/颗粒的包封是必需的(例如，液滴测序)。在这种情况下，双泊松加载将需要产生10⁹滴以确保单个珠和单个细胞的包封(1％的珠+细胞的包封效率)。在这种情况下，包封时间将为约11.7天。然而，可以大量且提前较短的时间间隔产生液滴-载体颗粒12、存储并运送至用户。然后，用户可以实施乳化步骤以大规模形成液滴颗粒10，同时在整个溶液中使用简单混合步骤以用于包封大量细胞。

表面活性剂混合物油剂的使用

可以调节连续相中的表面活性剂的量以调整不混溶相之间的表面张力以优化液滴破碎和液滴颗粒10的形成。还可以在分散相中加入表面活性剂(非离子型，例如Pluronic，或者离子型)以进一步调整表面张力以及降低液滴-载体颗粒12在分散相中的聚集。可以基于预期使用调整用于液滴颗粒10形成的油剂。例如，氟化油剂(Novec^TM 7500 3M，FC-40 3M等)可以与相当的表面活性剂(Pico-Surf^TM、RAN表面活性剂等)一起使用以用于液滴颗粒形成。由于它们高度的生物相容性，这些油剂特别适合于生物分析物的分析。在其它实施方式中，不同的油剂(例如，硅酮油剂、矿物油、植物-来源的油剂、动物-来源的油剂，长链烃、有机溶剂)可以是所期望的以允许液滴颗粒10之间的试剂输送，液滴颗粒10内的pH变化等。在其它实施方式中，从疏水材料(例如，聚(丙二醇)二丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、己二醇二丙烯酸酯、己二醇二丙烯酸酯+丙烯酸月桂脂、1H,1H,6H,6H-全氟-1,6-己二醇二丙烯酸酯或者甲基丙烯氧基丙基封端的聚二甲硅氧烷)制造液滴-载体颗粒12并将其分散在油相中，然后将其与水相混合以产生水包油液滴颗粒10乳液。

液滴-载体颗粒与分散体积比

可以优化液滴-载体颗粒12在分散相14中的相对数以实现有效且一致的液滴颗粒10形成并防止卫星液滴28的过量形成。对于更高的分散体积比，存在较低部分的与液滴颗粒结合的分散体积，从而导致了更高的卫星液滴形成。在较低的体积比，试剂和颗粒(来自与液滴颗粒10结合的样品的微尺度物体部分)向液滴颗粒10的捕获效率升高。注意不同于其中根据体积所分析的分析物部份取决于包封体积部份的微流体液滴包封，固相在液滴颗粒10中的存在使得固相表面上(或基质内)的分析物浓度与根据可以分析的分析物部份所分析的体积分离。

液滴颗粒回到分散相的输送

在某些情况下，期望使液滴-载体颗粒12返回到大体积的分散相14(例如，水相)中以实施额外的清洗步骤、第二缀合、使液滴-载体颗粒12通过流式细胞仪150(图13A、图13B、图16和图18)以用于分析/分选等。对于使用水凝胶-基液滴-载体颗粒12的系统，可以将水和氟化油，第二表面活性剂(全氟辛醇)加入至油相16以使乳液不稳定并收集水相14中的液滴-载体颗粒12。更具体地，通过移液从乳液悬浮液去除过量的油和表面活性剂而不去除液滴颗粒10。然后，将Novec^TM 7500氟化油(3M)中的20％的全氟辛醇溶液以与剩余悬浮液体积近似相等的体积添加至悬浮液。加入其它水相14以稀释样品以更容易处理悬浮液和/或防止液滴-载体颗粒12之间的干扰(crosstalk)。轻轻混合悬浮液并且在几分钟后液滴聚结。可以直接从所出现的不混溶相的顶部去除颗粒悬浮液。如果需要，可以用与氟化油可混溶的低密度有机相进行另外的清洗步骤。己烷的添加使得氟化油能够在水相上方分离并且可以通过移液去除。已使用其它方法，如离心和通过电场的去稳定来使乳液聚结并且这些方法可以是潜在的替代方法。

清洗用于生物测定的液滴-载体颗粒

生物样品的有效标记或检测需要在存在试剂，如抗体或荧光小分子的情况下培育。此外，需要后续添加试剂的测定，如夹心ELISA依赖于中间清洗步骤以从之前的步骤去除残余试剂。在本文中，描述了多种方法以清洗/分离液滴颗粒10以及在油相和水相两者中的分选。

在液滴-载体颗粒12回到水相中的输送之后，可以实施清洗步骤以去除溶液中的游离分析物并防止干扰。在一个实施方式中，在水相中稀释颗粒悬浮液并且离心以在容器22底部浓缩液滴-载体颗粒12(对于具有比水高的密度的颗粒)。在一个实施方式中，将液滴-载体颗粒12以2000g离心1min。在另一个实施方式中，将液滴-载体颗粒12以300g离心3-5min。当使用敏感细胞时，低离心速度是有利的。去除上清液并更换新的溶液，并且将液滴-载体颗粒12混合回到该新的溶液中。可以多次重复该离心和去除过程以提高清洗水平。新的溶液可以包括清洗溶液和新的试剂溶液。在另一个实施方式中，用磁性颗粒(例如，包埋在液滴-载体颗粒12的凝胶基质内)来修饰液滴-载体颗粒12以赋予磁性并且使得液滴-载体颗粒12在容器22中的位置中进行磁性操纵/积累以允许清洗和溶液交换程序。在另一个实施方式中，可以用微泡或中空玻璃颗粒修饰液滴-载体颗粒12以降低它们的密度并且使用通过(例如)缀合的微泡控制的浮力进行清洗/分离(BACS)。

液滴颗粒与卫星液滴的分离

为了降低卫星液滴28的背景信号，可以使用如本文所述的多种方法来将液滴颗粒10与卫星液滴28分离。在一个实施方式中，施加磁场以将具有磁性修饰的液滴-载体颗粒12的液滴颗粒10与无磁性的卫星液滴28分离(参见，例如，图5)。可以通过在微流体制造期间将它们加载到溶液中来将磁性颗粒包埋在液滴-载体颗粒12的基质中。外磁场可以用于将磁性-标记的液滴-载体颗粒12吸引至容器22中的位置或者与卫星液滴28滑动分离，其中可以以高纯度收集它们，使其成像或另外分析。在另一个实施方式中，本领域中已知的基于熟知的尺寸/可变形性的过滤方案可以用于将较大的液滴颗粒10与较小的背景卫星液滴28分离。这可以包括允许基于尺寸的颗粒和液滴的分离的熟知的微流体颗粒分离技术的使用。实施例方法包括：惯性微流体分离装置、确定性横向位移装置、切向流过滤装置和利用颗粒尺寸差和/或密度差的基于声学或沉降的分离设备。也可以将浮力差用于分离。例如，由于浮力与拖曳力的比值升高，液滴颗粒10趋向于在Eppendorf管顶部积累，而卫星液滴28在下方积累并且可以通过移液管部分去除。

制造液滴-载体颗粒的水性两相系统方法

可以使用与液滴微流体合并的水性两相系统(ATPS)制造含有空腔的微凝胶液滴-载体颗粒12(图7A和图7B)。这些微凝胶液滴-载体颗粒12具有内部空隙或空腔18。通常，ATPS一相应包括可交联组分，而另一相不应含有可交联组分。在一个实施方式中，可交联PEG相和葡聚糖相在微流体液滴产生器装置30中与含有表面活性剂的第三油相一起同向流动以产生混合的水乳液，其中PEG相和葡聚糖相的均一部分存在于在油相中悬浮的每个液滴中。在PEG和葡聚糖的某些浓度方案中，将两相在具有不同形态的液滴内分成不同的空间位置(图8)。一个空间位置含有包含PEG组分的富集相，而另一个空间位置含有水性两相系统的第二组分(例如，聚合物，如葡聚糖)。然后，在含有PEG组分的富集相中引发交联，并且清洗形成的液滴-载体颗粒12以去除油和葡聚糖，从而产生具有在PEG液滴-载体颗粒12内内接的空隙或空腔18的球形或椭圆形PEG颗粒。空隙或空腔18的形状对应于先前每个液滴的葡聚糖-富集区的形状。

可以使用一定范围的技术实现PEG相的交联。在示例性方法中，已证明了UV和pH-引发的PEG相的交联。例如，通过由UV光和光引发剂(2959(1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮)、LAP(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂)等)触发的链增长自由基聚合使PEGDA交联。在另一个实施方式中，实施通过UV光和光引发剂引发的多臂PEG-降冰片烯+二巯基化物或多臂硫醇交联剂之间的硫醇烯反应。在相关实施方式中，在液滴形成之前，在较低的pH使用PEG-乙烯砜/马来酰亚胺+二巯基化物或多臂硫醇交联剂以防止胶凝。通过在下游油相中添加有机碱(例如，三乙胺)来提高分散相中的pH，从而引发交联反应。

在一个示例性实施方式中，使用以下条件制造液滴-载体颗粒12：在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中包含20％w/v 40kDa葡聚糖和～1.3％DTT交联剂的葡聚糖相，pH 7，以2.67μL/min注入至，在PBS中包含17.5％w/v4-臂PEG-降冰片烯、2％w/v LAP(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂)和0.5mg/ml生物素-PEG-硫醇的PEG相，以8μL/min注入至，和由Novec7500油中的0.25％v/v Pico-Surf^TM组成的油相，以44μL/min注入至通道高度70微米且连接宽度60微米的微流体液滴产生器装置30中。在微流体装置的出口区(高度130微米)附近，在1-3秒的近似持续时间内，使用通过DAPI滤光器组的聚焦UV光和4X物镜，以50-200mW/cm²电源，使液滴-载体颗粒12交联。使用这种方法，以约1000每秒的速率制造具有高度几何均一性的液滴-载体颗粒12。为了表征颗粒12的均一性，用8微克/ml Alexa Fluor^TM修饰的抗生蛋白链菌素溶液标记颗粒上的生物素基团。然后，如图10C和图10D所示，使液滴-载体颗粒12在TRITC通道中荧光成象。图像分析显示液滴-载体颗粒12的外径具有82.5微米的平均值和1.5％的CV，而开口直径具有51.0微米的平均值和2.1％的CV。

作为油和表面活性剂的连续相内的乳液片外收集液滴-载体颗粒12。在其中纯化的液滴-载体颗粒12在水相中是所期望的实施方式中或者在其中纯化的液滴-载体颗粒12在水相中用作测定起点的实施方式中，液滴-载体颗粒12必须经历几次清洗步骤以从液滴-载体颗粒12去除过量的表面活性剂、未反应的生物分子和结合的有机相。在一个实施方式中，通过Novec-7500油、己烷、乙醇和具有0.1％Pluronic F-127的PBS的连续清洗步骤分离了纯化的液滴-载体颗粒12。更具体地，片外收集颗粒乳液和结合的油相并且去除大部分油相。对于1mL液滴-载体颗粒12的集合，将3至5毫升PBS和1毫升20％全氟辛醇在Novec-7500中的溶液加入至颗粒乳液。将溶液轻轻搅拌几分钟以破乳并再次去除过量的油。然后，再次添加3mL Novec-7500油并将溶液搅拌并以2000G离心2min，然后去除过量的Novec油。将该过程重复总计3次清洗。然后，将3mL己烷加入至颗粒悬浮液，以相同方式搅拌、离心并去除。将该过程重复总计3次另外的清洗。然后，将3mL乙醇加入至颗粒悬浮液，以相同方式搅拌，离心并去除。将该过程重复总计3次另外的清洗。最终，将3mL具有0.1％Pluronic F-127的PBS加入至颗粒悬浮液，以相同方式搅拌，离心并去除。将该过程重复总计3次另外的清洗。在这些清洗的最后一次之后，液滴-载体颗粒12应不含剩余的有机溶剂、表面活性剂和未反应组分并且可以用于测定。对于包括细胞的应用，液滴-载体颗粒12应在乙醇溶液中储存延长的一段时间，至少8-10小时以用于灭菌，并且可以进行另外次数的清洗以在细胞接种前回到水相。

改变尺寸与形状

可以在尺寸和形状方面改变液滴-载体颗粒12的尺寸和空隙或空腔18的体积。使用微流体液滴产生器装置30，可以通过调整油相与水相的相对流速和/或改变通道的几何形状来调节外部颗粒直径。已使用不同通道高度/流速制造了具有大于100微米直径和<40微米直径的液滴-载体颗粒12。例如，使用具有70微米通道高度的装置，并且使用以下流量：油＝10微升/分钟(在一个实施方式中)、PEG＝4μL/min，葡聚糖＝1μL/min，产生了100微米直径的液滴-载体颗粒12。使用具有18微米通道高度的装置，并且使用以下流速：油＝20μL/min、PEG＝2μL/min，葡聚糖＝0.5μL/min，产生了40微米直径的液滴-载体颗粒12(图9)。

可以通过调整浓度并因此调整PEG和葡聚糖区的尺寸来调节相对空腔体积和形态(图8A和图8B)。在双结点曲线定义的临界浓度下，PEG和葡聚糖将分成两个相。基于PEG和葡聚糖浓度、PEG、葡聚糖和油相之间的接触角的变化，两个相之间的表面张力改变。例如，PEG和葡聚糖浓度的升高提高了两相之间的表面张力，从而导致了更突出的几何形状。通过调整PEG和葡聚糖的相对比，可以操纵双个区的相对体积，同时保持形态一致。

生产的均一性

使用微流体(微流体液滴产生器装置30)的单分散液滴的产生使得含有空隙区的形成的液滴-载体颗粒12能够具有高均一性。具体地，在如上所述的实施方式中，未交联的PEG-葡聚糖乳液对外径维持了CV<1％，并且对内部葡聚糖相的当量直径维持了CV<2％(图10A)。具有通过葡聚糖相-分隔区所限定的空隙或空腔18的形成的液滴-载体颗粒12维持了CV<5％的高均一性(图10B)。

新月形颗粒对于液滴-载体颗粒的优势

描述的几何形状相对于球形模板的明显优势在于产生具有更均一的用于液滴-载体颗粒12的材料空间的外部试剂体积的能力。这在不可以自由扩散到颗粒材料基质中的大分子的包封/定量中是特别重要的。通过球形颗粒模板化的液滴含有颗粒外部的小体积部份。该体积部分对乳液分散相和液滴-载体颗粒12之间的相对直径高度敏感。然而，产生具有内部空腔或空隙18的液滴-载体颗粒12通过具有含有大包封流体体积部分的预定几何形状显著改善了液滴-载体颗粒12外部体积的均一性。在某些实施方式中，与固体球形颗粒相比，使用含有空腔或空隙18的液滴-载体颗粒12实现了形成液滴的3-倍体积变化减小(参见图11A)。提高体积均一性导致液滴颗粒10内实施的反应的均一性提高。空腔或空隙18的另一个优势在于提供空间以包封细胞、珠和其它所关心的微尺度物体。此外，空隙或空腔18形态和尺寸的操纵可以允许选择性捕获具有特定尺寸、形状、硬度等的物体。

在一个实施例中，可以调节空隙或空腔18的尺寸，从而仅对于要配合的单个细胞、珠或其它微尺度物体存在空间。以这种方式，当与其中可以在较高浓度包封多个靶标的标准泊松加载相比时，可以实现更高部份的具有单个细胞(或者其它所关心的微尺度物体)的液滴颗粒10。在另一个实施例中，如果存在具有不同尺寸特征的多种细胞类型(例如，平均直径30微米的细胞类型A和平均直径15微米的细胞类型B)，则可以使用具有调节至细胞尺寸的空隙或空腔18尺寸的液滴-载体颗粒12选择不同的细胞类型。例如，可以首先通过具有20微米空腔尺寸开口的液滴-载体颗粒12选择性捕获细胞类型B，然后与细胞群体的剩余部分分离。任选地，可以在第二步骤中使用具有40微米空隙或空腔18尺寸开口的液滴-载体颗粒12以捕获和包封细胞类型A。

制造液滴-载体颗粒的其它方法

可以通过其它牺牲性包封材料的使用来制造适合于起液滴-载体颗粒12的作用的含有空腔的颗粒。在一个实施方式中，在含有可交联材料的液滴中包封单个牺牲性颗粒(小于液滴的尺寸)。然后，使用本领域中已知的多种方法(例如，先前所述的那些以及本领域技术人员已知的其它交联方法)使液滴的可交联材料交联，并且清洗和/或降解掉包埋的牺牲性颗粒。可替换地，在一些实施方式中，将多种牺牲性颗粒/材料包封到可交联乳液中以产生包括处于每个所产生的液滴-载体颗粒12内的空隙体积的微米/纳米多孔空腔网络。例如，可以在液滴包封前，通过使用微流体惯性排序(inertial ordering)，将单个牺牲性颗粒包封在微流体-产生的乳液的每个液滴中。实施例牺牲性颗粒材料包括：海藻酸盐、明胶、MMP可切割的PEG、聚苯乙烯微珠等。对于调节纳米孔隙度，在由多孔液滴-载体颗粒12组成的一个实施方式中，在交联之前将不可交联的PEG加入至可交联的PEG相中。交联后，清洗凝胶以去除未交联的PEG并显示出空隙空间。

其它实施方式使用三相系统以在可聚合流体中产生空隙。例如，不混溶的三相乳液：例如，水、氟化油、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)可以用于在ETPTA聚合的颗粒内产生空隙。其它实施方式使用掩模+光引发的前体溶液交联来产生具有所包括的空隙空间的可聚合材料中的2D/3D突出(例如，瞬变液体成型、停止流动光刻、连续流动光刻)。

液滴-载体颗粒的储存

在一个实施方式中，在分散相14中悬浮的同时储存液滴-载体颗粒12。任选地，甘油或其它冷冻保护剂可以用于在低温(-20或-80℃)储存液滴-载体颗粒12而无颗粒损伤。在其它实施方式中，可以将液滴-载体颗粒14干燥或冻干，然后在使用前再分散到分散相14或包含分散相14的样品流体中。这可以使得能够控制给定分散相体积中的液滴-载体颗粒12密度并且允许液滴-载体颗粒12以高分散相/样品流体的包封效率在油连续相中分散。冷冻干燥是使得液滴-载体颗粒12能够长期储存的一种方法。不损害水凝胶颗粒结构的水凝胶颗粒的冷冻干燥方法可见于Sheikhi等人,Microengineered emulsion-to-powder(MEtoP)technology for the high-fidelity preservation of molecular,colloidal,and bulk properties of hydrogel suspensions,ACS Appl.Polym.Mater.,1,8,1935-1941(2019)，该文献作为参考并入本文。

液滴颗粒的化学修饰

在一些实施方式中，从广泛可得并且在多种生物技术应用中使用的聚合物前体制造了本文所述的液滴-载体颗粒12。照此，存在多种可以在乳化前应用于液滴-载体颗粒12以使它们与多种生物测定相容或对其有用的定义明确的化学修饰方法。实施例包括：硫醇-烯/硫醇-炔点击化学、迈克尔加成、NHS酯反应、叠氮化物-炔化学、生物素-抗生蛋白链菌素结合、抗原-抗体相互作用等(图12)。以下提供了描述这些修饰和它们的应用的几种实施方式。

颗粒的生物素化

生物素是由于对蛋白质抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素强烈且特异性结合而在生物技术行业中具有巨大应用的小分子。另外，生物素易于缀合至较大的生物分子而不影响它们的功能，从而使它们能够快速且有效地向抗生蛋白链菌素涂覆的基底或其它所关心的生物分子缀合。对于与聚合物的缀合，存在多种与含有与众多水凝胶前体易于交联的反应基团的短聚合物链连接的多种可商购的生物素。液滴-载体颗粒12生物素化的一种优选方法是通过在微流体液滴产生装置30中的PEG溶液内掺入生物素PEG-硫醇。更具体地，已通过使15wt％、10kDa PEG-降冰片烯的PBS溶液和具有含1.3％DTT的20wt％的葡聚糖的5mg/mL生物素PEG-硫醇在PBS中的溶液同向流动来实现具有空隙结构的生物素官能化的水凝胶液滴-载体颗粒12。在去除表面活性剂并使液滴-载体颗粒12在水相中复原后，通过将凝胶剂与抗生蛋白链菌素-FITC一起培育并后续观察荧光信号来验证缀合。液滴-载体颗粒12的生物素化使得多种常规试剂，如抗体、蛋白、核酸、细胞、纳米颗粒和引物能够缀合，并且使得它们能够在广泛的测定中使用，包括ELISA、PCR、其它核酸扩增测定和流式细胞术。

细胞粘附肽

细胞粘附肽也可在颗粒生产期间或之后结合至液滴-载体颗粒12。在一个实施方式中，可以将RGD肽(Ac-RGDSPGERCG-NH2)[SEQ ID NO：1]或另一种整合素结合肽或衍生肽引入前体溶液并通过与所述肽内存在的半胱氨酸基团的反应共价交联至聚合物骨架。整合素结合肽促进细胞与下方基底的粘附并且对于维持贴壁细胞群体中的存活力是重要的。目前，由于在标准油包水乳液中不存在其上可以粘附细胞的固体表面，因此需要长期培育或细胞培养的液滴测定受限于悬浮液细胞。通过提供用于单细胞信号(内部空隙或空腔18的空间)连接和定量的均一尺寸的口袋，同时不限制作为液体对细胞可用的媒介物的总体积(总微滴体积)，这种平台扩展了液滴测定的功用，并且小分子可以容易地扩散通过固体凝胶支持物。此外，液滴颗粒10的独特能力是控制内部空隙或空腔18的尺度的能力，两者均用作限制包封细胞(例如，从大细胞背景中捕获白细胞、红细胞或细菌)尺寸的筛，用于控制可以包封的细胞的体积和数目或者用于同时包封和维持粘附和悬浮液细胞两者。这类共培养证明了使用当前技术，如一对细胞群体之间的探针相互作用的困难。例如，使得能够对针对患者-来源的肿瘤细胞的抗原特异性T细胞进行检测和后续扩增。

通过FSL修饰的细胞附着

在与生物素化的颗粒12混合前，通过用10-250μg/mL抗生蛋白链菌素预处理颗粒，同时用缀合至游离脂质或胆固醇的生物素(作为FSL-生物素、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG-生物素(DSPE-PEG-生物素)、胆固醇-PEG-生物素、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG-生物素(DMPE-PEG-生物素)等可商购)修饰细胞或者通过用生物素化的脂质和抗生蛋白链菌素修饰细胞，生物素化的液滴-载体颗粒12也可以用于结合至非贴壁细胞类型。在优选的实施方式中，将10-100μg/ml的生物素化的脂质加入至1百万细胞在PBS中的悬浮液中并在37℃培育60-90分钟。来自水溶液的非贴壁细胞的亲合力和结合使得在液滴颗粒10中包封的细胞浓度升高，而不是卫星液滴28中的，这对高稀释样品的分析是至关重要的。另外，在水相中更容易实现使用标准技术，如流式细胞术(使用流式细胞仪150)的细胞群体的高性能成员的成功分选并因此所述分选高度依赖于在使油包水乳化液破裂后将细胞保留在液滴-载体颗粒12内的能力和分选后细胞从液滴-载体颗粒12中的后续释放两者。因为，FSL-生物素并非永久结合至细胞膜，它将随时间降解并最终从其基底释放细胞。还可以在液滴-载体颗粒12形成期间将可降解肽引入PEG化主链，并且在测定完成时通过暴露于适当的蛋白酶进行切割。例如，由于在其末端存在两个半胱氨酸基团，可以在液滴-载体颗粒12制造期间作为交联剂使用肽Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2[SEQ ID NO：2]并且由于作为基质金属蛋白酶底物的肽序列而赋予其可降解性。

通过选择性粘附的细胞分离

还通过在水溶液中的共培养容易地实现了修饰抗体与液滴-载体颗粒12表面的缀合或共价结合。表面缀合的抗体使得能够基于其表面上特定蛋白的表达而选择性结合细胞群体亚型。这使得能够直接通过与群体中所有细胞间保守的表面抗原或者与富集混合群体中外来细胞的大背景内的细胞亚型的稀有表面抗原的抗体相互作用来捕获和富集所关心的单细胞。这种富集是对多种生物流体样品的测定中的重要特征，其中来自所关心的小亚群的数据经常受来源于脱靶细胞的测量的噪音的干扰。在其中期望通过保守蛋白标志物的所有细胞的捕获的实施方式中，生物素化的抗体通常与细胞预结合以修饰所有可用的表面部分，同时节省试剂。在1mL体积中用10μg/mL生物素-抗-CD3抗体修饰了多至1000万个T细胞，并且所述T细胞粘附至液滴-载体颗粒12上的游离抗生蛋白链菌素位点。在其中需要细胞的所选组的捕获的其它实施方式中，液滴-载体颗粒12必须用抗体直接修饰以消除不含有所关心的表面标志物的细胞的粘附。由于液滴-载体颗粒12的较大的总表面积，基于对于靶标抗原的抗体亲合力，这需要更高浓度的抗体，例如，每个样品10-250μg/mL。

在一个实施方式中，通过含有与抗体缀合的液滴-载体颗粒12的水溶液与混合细胞溶液的培育和主动混合实现了细胞的选择性结合和累积。靶向细胞表面抗原的抗体(例如，CD8、CD4)导致了所关心的细胞类型(例如，T细胞亚群)的选择性富集。在混合期间，靶细胞进入液滴-载体颗粒12的空隙或空腔18并且结合至抗体并且在空隙或空腔区18内保持附接。非靶细胞可以进入空隙区，但是不选择性粘附，并因此通过溶液的后续混合而被去除。靶细胞也可以结合至液滴-载体颗粒12的外表面，然而溶液混合期间的剪切力还可以去除未维持在空隙或空腔区18内的这些细胞。在一个实施方式中，以5个细胞/颗粒的比值，将如上所述用10μg/mL生物素-抗-CD3修饰的T-淋巴细胞的浓缩悬浮液(至少1000万个细胞/mL)加入至浓缩的抗生蛋白链菌素修饰的液滴-载体颗粒小粒中，并使用100μL、200μL或者1000μL移液器尖头，以每秒2-4次重复的速率移液2分钟。然后，使用Fisherbrand 40μm细胞滤网过滤液滴-载体颗粒12并回收，从而导致液滴-载体颗粒12群体高度浓缩，其中细胞附着在中央腔18内。通过调整接种期间原始细胞与液滴-载体颗粒12的比值，液滴-载体口袋12的“口袋”18中结合的平均细胞数的调整是可能的。注意，可以调整空腔或空隙区18的尺寸(约10-20微米)，从而仅使得平均单个细胞、两个细胞或目标数目的细胞能够进入和维持。然后，如本文所述粘附细胞可以包封在油相中并在随后的阶段中进行单细胞测定。粘附细胞可以包括哺乳动物细胞，但是作为另外一种选择可以包括细菌、藻、真菌或者其它细胞或细胞碎片，如微泡或外来体。

通过可交联分散相的微米/纳米物体(细胞/珠/蛋白/等)的捕集

在单独的实施方式中，可以将可交联材料作为液滴颗粒10中的分散相14添加至要包封的样品。可以在液滴-载体颗粒12回到水相中的输送之前触发分散相的胶凝以在它们各个的液滴-载体颗粒12中结合或固定化细胞、珠或其它样品以用于下游分析/分选。在一个实施例中，在向水相转移(例如，通过冷却至4℃)之前，热敏凝胶(琼脂糖、明胶等)的使用可以用于细胞在凝胶基质中的胶凝和包封。然后，包封的细胞可以通过下游分析和分选仪器(例如，流式细胞术)。在一些实施方式中，使用可逆凝胶材料，从而细胞可以通过温度变化以熔化琼脂糖(或其它凝胶材料)或者通过酶的使用，例如，琼脂水解酶或它们的组合从液滴-载体颗粒12和胶凝区中释放。

在其它实施方式中，将UV或pH可触发的交联机制用于引发胶凝和捕集(自由基聚合、硫醇烯、迈克尔加成等)。如有必要，可以使用可逆交联剂进行可逆交联。在一些实施方式中，可以使用还原剂，使用酶可切割的交联剂(例如，通过特异性肽序列)或者通过添加碱使用对水解敏感的交联化学(例如，与含有砜键、丙烯酰胺、酯、硫酯等的交联剂缀合的分子)破坏具有二硫键的交联剂。

对于液滴反应性的变化改变孔隙度

还可以通过引入致孔剂，前体链长度的变化或者通过添加根据需要使得能够部分降解的第二化学性质，在交联期间操纵每个液滴-载体颗粒12的孔隙度。这种控制提供了额外的多用途层，其中可以基于对特定测定的要求来特异性设计液滴-载体颗粒12。具有较小的孔的液滴-载体颗粒12可以对蛋白及其它大生物分子不透，从而使得能够更灵敏地检测这些物质，因为这些测定的表观体积将是颗粒空隙空间，而不是整个颗粒体积。相反，较大的孔空间将使得较大的生物分子能够扩散并在信号饱和之前为附接提供更多位点，从而加宽可计量的范围。

液滴颗粒在测定中的使用

液滴颗粒10可以使得与依赖于区划体积的多种广泛使用的液滴或其它数字测定相容。通过材料化学和颗粒设计的谨慎选择，可以直接将液滴颗粒10应用于多种测定工作流程，并且可以通过所期望的细胞群体的富集或者通过对于分析物检测提供较小的表观体积来提高所收集的数据。

数字核酸扩增测定

核酸扩增在生物学中广泛用于鉴别和表征核酸序列以监测基因表达，识别遗传疾病和验证遗传修饰工作流程中的适当转染。这些扩增方案中最熟知的聚合酶链反应(PCR)已适用于液滴中的使用，并且甚至已由Bio-Rad商品化用作数字测定。微滴式数字PCR(ddPCR)使用微流体液滴产生器来将含有核酸、引物、dNTP、荧光插入染料和DNA合成酶的水性体积划分成纳升体积液滴。随着样品热循环，靶标DNA扩增，从而导致含有易于和其中由于缺少靶标序列而未进行扩增的液滴中的背景荧光相区分的靶标序列的液滴内的荧光信号(例如，由于插入荧光染料)升高。该技术具有提供生物样品内靶标序列浓度的绝对定量的附加优势。

数字核酸扩增方法(如数字PCR、数字环介导等温扩增(LAMP)或其它等温扩增方法)易于转化为液滴颗粒10系统，因为水凝胶颗粒可以简单地在水性PCR或与含有靶标核酸序列的样品混合的其它扩增混合物中复原(图13A)。通过涡旋或移液的后续样品乳化使得靶标序列和鸡尾酒混合物(cocktail mix)能够与标准ddPCR方法类似地分布。然后，当对于绝对定量存在要分析的靶标时，液滴颗粒10内的均一体积可以热循环或加热以产生荧光信号。重要地，支持液滴颗粒10的液滴-载体颗粒12的存在可以提高乳液的热稳定性和降低聚结。通过这种方法的乳化还可以产生一些卫星液滴28。然而，可以基于所使用的表面活性剂、初始微凝胶样品的干燥程度(空隙部分)以及与和样品混合的液滴-载体颗粒内的可用体积相比的样品体积来调节这些卫星液滴28与装填颗粒的那些的相对比。因此，可以限制空卫星液滴28中包封的样品的总体积或者计算分配到液滴颗粒10中的总水性体积部分，并且应用校正系数来定量存在于总体积中的靶标核酸序列数目。例如，可以对于液滴-载体颗粒12的给定初始浓度、液滴-载体颗粒几何形状(外部颗粒直径和内部空腔体积)和液滴颗粒10形成后围绕液滴-载体颗粒12的水层的预期厚度来近似估计靶标的包封效率(参见图11A-图11C和有关包封效率理论相关教科书)。

在相关实施方式中，在乳化前可以用对靶标序列特异的引物和/或捕获核酸序列预涂覆液滴-载体颗粒12以促进靶标核酸在水相中与液滴-载体颗粒12的结合。这将使得分析物能够在液滴-载体颗粒12上局部浓缩并在热循环期间消除卫星液滴28的扩增。通过对预期样品靶标序列使用大量过量数目的液滴-载体颗粒12，这些系统将以数字计数方式运行，尽管在更高的浓度，每个液滴中的类似荧光信号还可以提供有关核酸浓度的信息。绝对荧光值(不仅是开关阈值)可以用于反算每个液滴颗粒10的结合序列的平均数目并且获得样品中靶标序列总数的绝对值。在液滴-载体颗粒12上浓缩靶标序列并然后实施下游扩增和读出的能力是液滴颗粒系统的独有优势。另外，从样品捕获核酸序列的能力允许用不同的溶液(例如，核酸扩增混合溶液，参见以上清洗部分)清洗和置换，使得具有从可能干扰扩增反应的样品溶液去除背景污染物的能力。最后，液滴颗粒方法具有使数字测定成为完全无装置的附加优势，从而为无微流体知识的用户提供对另外可能不能获得或者需要大型设备和/或专门技术的这些测定的方便使用。

液滴颗粒10的进一步修饰使得它们能够实施即使最复杂的数字PCR测定实施方式，如BEAMing(珠、乳液、扩增、磁力)数字PCR。在BEAMing中，生物流体样品与引物官能化的珠一起再次分配到液滴中。当靶标核酸存在于具有珠的液滴中时，通过PCR扩增核酸，从而导致扩增子与包封的珠上的引物附接。珠-附接的扩增子可以含有有关靶标序列中的突变的信息。注意，在上述BEAMing的实施中并非所有液滴含有两种靶标和一个珠，因为珠的乳化是随机的，这是技术缺陷。扩增完成时，乳液破裂并且磁性回收每个珠并将其与一种或多种类型的与含有不同突变的序列互补的荧光标记的核酸报告探针一起培育。扩增和附接至珠的所关心的具体突变将提供所述珠上独特的荧光信号的升高。然后，这些荧光标记的珠可以通过流式细胞仪150以鉴别存在于样品中的靶标序列中的突变的发生率。

然而，可以使用液滴颗粒10以额外的优势进行类似于BEAMing的测定。在一个实施方式中，对于BEAMing，液滴颗粒系统起作用以产生更单分散的乳液，并且液滴-载体颗粒12中空腔或空隙区18的开口尺寸或体积的尺度仅允许单个珠进入每个液滴颗粒10。在另一个优选的实施方式中，液滴-载体颗粒12本身与引物缀合并且在BEAMing工作流程中作为固相珠起作用。这在每个液滴将具有单一附接固相(即液滴-载体颗粒12)的情况下具有明显优势。然后，液滴-载体颗粒12可以在水相14中再悬浮以用于荧光探针结合和流式细胞仪150中的分析。还可以将每个液滴-载体颗粒12以多种方式条型码化，从而为液滴-载体颗粒12提供独特的指示。例如，在一个实施方式中，液滴-载体颗粒可以含有与靶向不同序列以使得核酸检测测定能够倍增的每个条型码结合的单独的引物/核酸捕获序列。靶标序列一侧或两侧上的引物可以固定化在液滴-载体颗粒12上以产生附接的靶标核酸序列。

如本文所提及的，还可以通过将磁性纳米颗粒连接或包埋在液滴-载体颗粒12内来将液滴颗粒10与卫星液滴28背景磁性分离。在存在外加磁场的情况下，液滴-载体颗粒12可以积累或移动和清洗。通过产生小于标准流式细胞术的临界截止尺寸(<50微米)的磁性液滴-载体颗粒12，可以直接从与每个液滴-载体颗粒12结合的高于阈值的荧光信号定量样品中的突变不均一性。

在相关实施方式中，通过在水相中包含预胶凝溶液并且在扩增后使水分散相胶凝来防止扩增子在液滴-载体颗粒12回到水相时丢失，扩增的核酸序列还可以截留在液滴-载体颗粒12上以用于分析。这种方法对于长扩增子的情况是更优选的(例如，使用LAMP反应产生的那些)。

在另一个实施方式中，使用了具有完全-包围的空腔18的液滴-载体颗粒12。可以调节颗粒基质的孔隙度，从而使得DNA靶标和反应混合物可以扩散通过所述基质。在液滴颗粒10形成和扩增之后，可以保留过大而无法扩散通过颗粒基质的扩增产物。这是有益的，其中可以将液滴-载体颗粒12输送回到水相中以用于下游分析和定量(例如，流式细胞仪)而不会损失完全-包围的空腔内保留的扩增信号。

液滴-载体颗粒12的条型码可以用于同时捕获和分析混合样品中不同的靶标核酸序列。可以将不同类型的具有不同核酸捕获试剂的条型码化液滴-载体颗粒12的混合物引入样品中以收集单独的靶标。特定液滴-载体颗粒12的信号可以连接至液滴-载体颗粒12的条型码以识别靶标类型，并且当分析多种液滴-载体颗粒12时，可以实施多重测定。在本文中进一步描述了使液滴-载体颗粒12条型码化的方法。

数字ELISA

数字ELISA是与使用夹心免疫-识别反应，用于定量小体积水性部分内的低浓度蛋白或其它分析物的ddPCR在概念上类似的技术。为了在液滴颗粒10中进行数字ELISA，首先将对靶标蛋白或其它分析物特异的捕获抗体缀合至液滴-载体颗粒12表面(参见图13B)。然后，将抗体涂覆的液滴-载体颗粒12设置在含有靶标分析物的溶液中，从而液滴-载体颗粒12的数目对于分析物数目大大过量，并培育以使得完成结合。结合后，清洗样品溶液并用清洗溶液替换。该初始结合反应和清洗步骤完成后，将对靶标分析物的第二区具有亲合力并且含有信号放大组分的第二抗体加入溶液并允许其结合至与液滴-载体颗粒12结合的分析物。使用本文所述的技术，再次从液滴-载体颗粒12上清洗过量的第二抗体，并且用含有与抗体的扩增组分反应的底物的信号显示溶液替换所述溶液以产生信号(荧光、比色、pH变化)。信号放大组分的实施例包括酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、b-半乳糖苷酶、酯酶等。底物的实施例包括荧光素二-D-吡喃半乳糖苷(FDG)或b-半乳糖苷酶的其它荧光底物以及HRP的荧光底物，如Amplex Red、QuantaRed、QuantaBlu等。在添加信号显示溶液后立即将液滴-载体颗粒12在油相16中乳化以形成液滴颗粒10，并且将整个样品与液滴颗粒10一起培育以积累荧光或其它信号。信号显示后，可以将液滴颗粒10放置在大储罐中，在此可以同时使用显微镜或广视野低成本成象仪使所有液滴颗粒10成象，并且对其定量以确定相对于液滴颗粒10总数具有大信号的液滴颗粒10部份。如之前所指明的，这使得能够计算样品中分析物的预期浓度。此外，在分析物结合至液滴-载体颗粒12(其在ELISA过程中清洗并再悬浮，并且使样品乳化)后，所有卫星液滴28将不含信号产生元件并且可以弃去而不会产生问题。在另一个实施方式中，酪胺可以作为HRP酶催化周转产物用于连接液滴-载体颗粒12本身的表面，从而允许扩增在液滴-载体颗粒12上捕获的局部信号。在液滴颗粒10乳液破裂后，使用下游技术，如流式细胞术(使用流式细胞仪150)，这些信号，如荧光信号可以提供分析物是否在每个液滴-载体颗粒12上结合的直接测量。在一个实施方式中，将Alexa Fluor^TM 488-酪胺用作底物，其通过对第二抗体起扩增组分作用的HRP激活，并且激活的荧光酪胺缀合物共价结合至液滴-载体颗粒12上或中所引入的附近的蛋白、肽或其它苯酚基团。在相关实施方式中，将生物素-酪胺用作底物，其导致通过多个生物素分子与液滴-载体颗粒12的共价连接产生信号放大。然后，可以使用抗生蛋白链菌素缀合的荧光团，以多种方式荧光标记生物素。

就核酸分析来说，液滴-载体颗粒12的条型码可以用于同时捕获和分析混合样品中的不同靶标分析物。可以将不同类型的具有不同抗体捕获试剂的条型码化的液滴-载体颗粒12的混合物引入样品中以收集单独的靶标。特定液滴-载体颗粒12的信号可以与液滴-载体颗粒12的条型码有关，因为它们是共定位的。这使得能够分析多种液滴-载体颗粒12的靶标类型，从而对一些蛋白/分析物实施多重测定。在本文中进一步描述了使液滴-载体颗粒12条型码化的方法。

单细胞测序

对于细胞基因表达测量的高分辨率以及上述测序方法的低成本的急切需要培育了液滴介导的RNA和DNA单细胞测序的兴趣。在单细胞RNA测序方法中，用能够通过还含有独特的细胞条型码和分子识别标签的所结合的多聚-T捕获核酸捕获mRNA的条型码化的珠共包封各个细胞。这些条型码化的捕获核酸还起到反转录引物的作用。使细胞在液滴中溶胞，使mRNA释放并结合至条型码化的珠上的多聚-T捕获核酸。然后，使乳液破裂并将每个珠上的捕获的RNA反转录。混合的cDNA含有来自每个各个细胞的条型码以获得对应于群体细胞成员的独特的基因表达读序。当在每个液滴中存在单一条型码化的珠和细胞时，则该方法将独特的分子标签(molecular signature)归因于来自每个各个细胞的读序，并且所述方法允许混合和整体基因测序及其它标签分析，同时维持样品差异化。这些方法的几种商用和开源的流行变化形式包括Drop-Seq、InDrop和CytoSeq。

使用具有无装置的明显优势的液滴颗粒系统，改造单细胞核酸测序，从而使得能够再次从独特的细胞定量基因表达而对于最终用户无需复杂的微流体装置或仪器。在一个实施方式中，对于单细胞RNA测序使用液滴颗粒10，调节液滴-载体颗粒12的空腔或空隙区18的尺度以保持单细胞并防止大于一个细胞进入。将液滴-载体颗粒12进一步官能化以在它们的表面上包含mRNA捕获部分，其是如本文所述独特条型码化的。如本文所述，还可以任选地官能化液滴-载体颗粒12以包含细胞的粘附配体或抗体，从而使得能够在单细胞RNA-测序之前选择性分离细胞。还可以在细胞包封和液滴颗粒10乳液形成之前将溶胞试剂引入液滴-载体颗粒12的基质。可以将溶胞试剂缓慢释放以使捕获的细胞溶胞或可以通过触发以释放或激活，如以下进一步所讨论的。可替换地，可以通过液滴颗粒10与含有与液滴颗粒10相互作用但不去除粘附细胞的溶胞试剂的其它液滴混合来添加溶胞试剂。在存在细胞的情况下，液滴颗粒10的整体乳化可以在数分钟的时间范围内包封数百万个单细胞，而不是单个微流体装置所需的数小时或数天。在另一个实施方式中，可以使用在油16和水相14两者中可混溶的溶胞试剂。对于这种情况，在液滴颗粒10形成后，可以将溶胞试剂添加至油16，并且一些部份将分配至液滴颗粒10以引起细胞溶胞。在另一个实施方式中，可以将无活性的溶胞试剂加入至分散相，然后在液滴颗粒形成后或者正好在液滴颗粒形成前，可以通过外界刺激激活。例如，离子型表面活性剂，如肌氨酰在某些pH范围是活性的。在该实施例中，可以降低溶液pH以保持肌氨酰无活性，然后在液滴颗粒形成后，可以通过然后分配到液滴颗粒10水相中的溶于油相的质子受体(例如，三乙胺)来提高pH，从而使其激活。

此外，现有方法中使微颗粒上的核酸捕获序列条型码化的标准方法是通过裂分和合并合成(split and pool synthesis)，其中将微颗粒裂分成分别含有一个核苷酸的4个不同的溶液，收集并再次随即划分总计n次以形成长度n的随机寡聚物。这种类型的添加可以直接在用于制备液滴颗粒10的液滴-载体颗粒12上完成，从而避免了对第二固相的需要并且将DNA扩增仅限于含有官能化颗粒的液滴。也就是说，通过克服浪费珠和细胞两者的珠和细胞加载的随机过程，使用液滴颗粒10可以提供显著的优势。具有单细胞但不具有珠的液滴导致不产生信号，而具有珠但无细胞的液滴也导致不产生信号。液滴颗粒10含有单个珠(液滴-载体颗粒12)，并且可以调节空隙区的尺寸以分离单细胞。

分子/试剂从液滴-载体基质的控制释放

在一些实施方式中，截留在液滴-载体颗粒12基质内的试剂随时间释放。例如，溶胞试剂(即，表面活性剂、去污剂和/或酶)可以保存在干燥的液滴-载体颗粒12中。通过水合，溶胞试剂缓慢释放至液滴颗粒10中包封的溶胞细胞中。在另一个实施方式中，将溶胞试剂在液滴-载体基质材料中培育直至接近饱和，将分散相更换为含有要包封的细胞的非溶胞流体，并且形成液滴颗粒10。通过扩散缓慢释放液滴-载体基质中保存的溶胞试剂以使包封的细胞溶胞。如本文所述，可以调整液滴-载体颗粒12的水凝胶基质孔隙度以调节试剂释放的时间过程，随着孔隙度的升高，导致释放速度更快，而降低孔隙度导致延长释放。

在其它实施方式中，液滴-载体颗粒12的基质由一旦环境条件(例如，pH、温度、光等)变化而膨胀的材料组成，从而能够触发保存在基质中的包封试剂的释放。例如，在液滴-载体颗粒12基质中含有o-硝基苯的主链聚合物的光触发的降解可以导致降低的交联密度、液滴-载体基质的膨胀和试剂释放。在另一个实施方式中，液滴-载体颗粒12基质带电，而带相反电荷的试剂通过电荷-电荷相互作用结合。可以通过改变试剂、液滴-载体颗粒12或两者的电荷的pH变化引起带电试剂释放。在一个实施方式中，可以通过在油相(例如，乙酸、三乙胺)中添加有机酸/碱来外部调节pH。在其它实施方式中，上述方法可以用于在一定范围的时间段内释放药物/分子以研究细胞反应。

包封期间的细胞存活力

一些测定需要甚至在单细胞测量后维持细胞的存活力。例如，为了分选出生产有价值的生物产品的高性能细胞或者用于选择具有治疗某些疾病的最优表型的细胞。还可以通过使用已知为高细胞相容性的油剂和表面活性剂在液滴颗粒10乳化系统中实施这些测定。在优选的实施方式中，使用了含有非离子型细胞相容的表面活性剂的碳氟化合物连续相。为了证明这种情况，将用Hoechst和钙黄绿素两者染色的Jurkat细胞与如本文所述生产的干燥的PEG微凝胶液滴-载体颗粒12混合并通过在具有0.5％Pico-Surf^TM的Novec^TM 7500中移液乳化。一旦乳化，将液滴颗粒10设置在显微镜载玻片上并通过荧光显微镜在明视野、DAPI和FITC通道中成象以确定存活力(参见图14A-图14C)。在乳化前后，液滴颗粒10中乳化的绝大多数细胞对于钙黄绿素阳性染色，这表明了与所提议的包封方法的相容性。

在另一个实施例中，在作用油相的具有Novec^TM 7500和2％v/v Pico-Surf^TM的媒介物中，在液滴颗粒10中包封中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。使用20％v/v PFO在Novec^TM中的溶液在多个时间点回收细胞并使用作为活细胞染色剂的钙黄绿素AM和作为死细胞染色剂的碘化丙啶染色。据发现通过该方法，细胞维持高存活力并且维持了24小时以上(>80％的存活力)。

单细胞分泌物分离

事实上，通常认为均一的细胞群体可以显示出仅受多种常规测定中有限分辨率所掩盖的巨大表型不均一性。为了收集细胞群体动态的有用的度量，必须在单细胞水平进行这些测定。例如，通过白细胞之间信号转导分子的分泌物，产生了体内对局部微环境扰动的大规模免疫学应答。如果在这种情况下仅研究整体中的体液来确定蛋白质组成，则将获得总样品浓度，然而，对于分泌性亚群，无法收集信息，从而限制了可以理解这些同等(coordinated)反应的程度。

通过液滴颗粒10，基于分泌物的蛋白信号，可以应用多种方案来捕获、定量和分选细胞。图16示出了使用液滴颗粒10，用于实施分泌物捕获和分析的说明性工作流程的一个实施例。如上所述，基于包封的细胞群体所期望的组成，使用生物素化的脂质、RGD和/或表面标志物特异性抗体，细胞可以结合至液滴-载体颗粒12表面。为了捕获分泌物，如以上所讨论的用于ELISA系统的捕获试剂(例如，靶向分泌物分子的抗体)可以固定化在液滴-载体颗粒12的基质上和/或中。一旦包封，培育细胞，同时分泌物蛋白在结合至捕获试剂的颗粒表面上积累。还存在于乳化溶液中或者一旦破乳可以引入的具有(例如)所附接的荧光团的次级报告抗体将结合捕获的蛋白。信号在液滴-载体颗粒12本身上的定位可以使得能够在破乳且使液滴-载体颗粒12在水相中复原后通过标准流式细胞术/FACS系统150分选。此外，细胞与颗粒表面(例如，通过生物素化的脂质修饰)的可逆结合使得细胞能够与液滴-载体颗粒12一起分选，从而不仅导致在单细胞水平上进行定量分泌物分析，而且还分选出具有所期望表型的特定细胞。

一般工作流程

(1)将细胞加载到水溶液中的液滴-载体颗粒12上

在一个实施例实施方式中，首先通过(例如)移液将液滴-载体颗粒12加载到具有平底表面的孔板、孔、烧瓶或其它容器中(参见图16-颗粒接种和细胞加载)。在一些实施方式中，由于液滴-载体颗粒12形状的不对称性，液滴-载体颗粒12以其空腔处于竖直取向沉降(例如，空腔18朝向重力加速度方向相反的表面打开(开放，开口，open))。这是有利的，其中开放的空腔18可以接种细胞。可以通过假设球体紧密装填，对于给定颗粒直径和孔表面积近似计算要接种的液滴-载体颗粒12的量。例如，对于直径85微米的颗粒12和12孔板(表面积2cm²/孔)，发现30微升的浓缩颗粒12覆盖了大部分的孔底部表面。

在液滴-载体颗粒12沉降后(通常5-10min)，然后可以将细胞小心地接种到孔中(例如，使用移液器)并使其沉降，其中一部分细胞在液滴-载体颗粒12的空腔18中沉降。相对于空腔18外部，可以通过提高空腔开口宽度与液滴-载体颗粒直径的比值来提高落入空腔18内的细胞部分。通常，可以根据泊松统计计算并且可以通过调整接种阶段的细胞密度来控制含有给定数目细胞(即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个细胞)的液滴-载体颗粒12部份。在一个实施例实验中，将15微升浓缩液滴-载体颗粒12(85微米外径、50微米内径)接种到二十四孔板的每个孔中。将多种量的细胞加入至不同孔中，并使其沉降到液滴-载体颗粒12中。将细胞和颗粒12成象以确定每个颗粒12的细胞数目。10,000个细胞每孔的添加导致了约0.09个细胞/颗粒12的泊松加载量。更具体地，93.1％的颗粒12是空的，6.65％含有一(1)个细胞并且0.25％含有两(2)个或以上的细胞。在具有细胞的颗粒12中，96％的颗粒仅含一个细胞。30,000个细胞每孔的添加导致了约0.2个细胞/颗粒12的泊松加载量。更具体地，82.2％的颗粒12是空的，15.9％含有一(1)个细胞并且1.9％含有两(2)个或以上的细胞。在具有细胞的颗粒12中，89％的颗粒仅含一个细胞。100,000个细胞每孔的添加导致了约0.8个细胞/颗粒12的泊松加载量。更具体地，42.6％的颗粒12是空的，32.6％含有一(1)个细胞并且24.8％含有两(2)个或以上的细胞。在具有细胞的颗粒12中，56.8％的颗粒仅含一个细胞。

不同的细胞接种量对于不同的应用是理想的。对于其中对于测定有效性，捕获不超过一个细胞/颗粒12至关重要的实施方式，较低的接种密度是理想的(例如，10,000个细胞/二十四孔板的孔(2cm²的表面积))。相反，对于其中期望多个细胞/颗粒12的实施方式，如对于细胞-细胞相互作用的评价，高接种密度是优选的(例如，100,000个细胞/二十四孔板的孔(2cm²的表面积)，其中将15μl的浓缩液滴-载体颗粒12接种到每个孔中)。在其它实施方式中，当细胞损失是不利的并且应受限时，可以排列液滴-载体颗粒12的多个层，从而使不沉降到液滴-载体颗粒12的第一层的空腔18中的细胞可以沉降到液滴-载体颗粒12的第二或后续层中的空腔18中。

将细胞与液滴-载体颗粒12结合的第二方法利用了掩蔽的液滴-载体颗粒空腔18内所结合的细胞相对于结合在液滴-载体颗粒12外表面上的那些细胞所经历的剪切力差异。简要地，可以将对液滴-载体颗粒12表面具有亲合力(例如，通过粘附配体)的细胞浓缩悬浮液混合到液滴-载体颗粒12的浓缩悬浮液中并使用100μL、200μL或1mL移液器，以每秒2-4次移液重复50-100x来剧烈搅拌。细胞将在整个悬浮液中分布并快速粘附至液滴-载体颗粒12表面。将快速剪切掉结合至液滴-载体颗粒12外部的那些细胞并使其返回悬浮液，然而截留在空隙或空腔18内的细胞更能够避开大部分外部流体剪切力，从而使它们粘附在由液滴-载体颗粒12的空隙或空腔18形成的口袋表面。一旦充分搅动颗粒悬浮液，则可以如下所述过滤它们。这提供了快速富集液滴-载体颗粒空腔18内存在的细胞部份的方法。

液滴-载体颗粒12表面的修饰使得所接种的细胞能够在液滴-载体颗粒空腔18内粘附和后续培养。例如，引入液滴-载体颗粒12表面的常用的整合素结合肽，如RGD使得细胞能够粘附，例如，基于整合素的存在，从而甚至在存在来自移液、离心和流式分选程序的剧烈机械搅拌的情况下维持细胞与液滴-载体颗粒12的附接。在优选的实施方式中，在液滴-载体颗粒12生产期间，以至少4mg/mL的浓度在葡聚糖相中添加RGD。在这种方法中，在PEG相中从光引发剂产生的基团在肽半胱氨酸基团上的游离硫醇和液滴-载体颗粒12前体的聚合物骨架上的未结合的降冰片烯之间引起了共价键合。在这种RGD-修饰的液滴-载体颗粒12上接种的CHO细胞在液滴-载体颗粒12表面上保持结合和扩散数日。

通常未粘附的细胞系还可以与液滴-载体颗粒12的表面结合。在一个实施方式中，将生物素-抗生蛋白链菌素相互作用用于将细胞连接至液滴-载体颗粒12。更具体地，用抗生蛋白链菌素预修饰生物素化的液滴-载体颗粒12并且用生物素化的脂质/胆固醇或者在液滴-载体颗粒12和细胞群体或细胞群体亚型之间产生亲合力的生物素化的抗体预修饰靶细胞。在一个优选的工作流程中，可以通过首先用10μg/mL的抗生蛋白链菌素在PBS中的溶液预修饰生物素化的液滴-载体颗粒12来使原代T细胞结合至生物素化的液滴-载体颗粒12。同时，通过将10μg/mL的生物素-抗-CD3抗体与小于1000万个细胞混合并在37℃培育20分钟来修饰T细胞。用PBS清洗液滴-载体颗粒12和细胞两者几次以确保去除未结合的材料。然后，将液滴-载体颗粒12以2000G离心沉降5分钟以形成对其添加了浓缩的抗-CD3修饰的细胞悬浮液的致密小粒。然后，通过手动移液至少2分钟，连续搅拌细胞和液滴-载体颗粒12的悬浮液。然后，如下所述，使用细胞滤网过滤样品以仅收集液滴-载体颗粒12和结合至它们表面的任何细胞。以大致相同的方式进行使用生物素化的脂质的替代实施方式，其中一定要注意可以使用这种方法修饰任何细胞，而不考虑表面蛋白质组成。在本文中，将细胞在37℃与10-100μg/mL的生物素化的脂质一起培育总计60-90分钟的一段时间，然后通过移液清洗并附接至液滴-载体颗粒12。

(2)清洗掉未结合的细胞和/或背景分泌物并且添加亲合试剂以结合至捕获所关心的特异性细胞分泌物的液滴-载体颗粒12。

在某些应用中，与液滴-载体颗粒12保持未结合的细胞是不期望的并且甚至可以是噪声源。为了降低背景，可以在液滴颗粒10形成之前清洗液滴-载体颗粒12，从而在进行测定前从溶液中消除未结合的细胞。在一种方法中，将液滴-载体颗粒12、具有附接的细胞的液滴-载体颗粒12和未结合的细胞的悬浮液加入至筛孔尺寸大于细胞直径但是小于液滴-载体颗粒12直径的细胞滤网。这使得具有附接的细胞的液滴-载体颗粒12能够通过筛网保留，同时使未结合的细胞通过。尽管保留了液滴-载体颗粒12，但是可以通过连续添加缓冲液来继续清洗它们，从而消除任何未紧密粘附至液滴-载体颗粒12表面的细胞。随后，通过细胞滤网的简单倒转，从筛网下方添加缓冲液并收集含有缓冲液和洗脱的具有附着细胞的液滴-载体颗粒12的所得溶液来分离液滴-载体颗粒12和它们的结合细胞。对于这种应用的一种优选的细胞滤网是来自Fisher Scientific的Fisherbrand40μm无菌细胞滤网。

在具有稀有细胞的应用中，可以期望回收不与液滴-载体颗粒空腔18结合的任何细胞。在这种情况下，可以使用上述策略，其中收集未与液滴-载体颗粒12结合的细胞用于随后向新的液滴-载体颗粒12样品的接种。

在一些应用中，期望在液滴-载体颗粒12上捕获分泌物。在这些实施方式中，有益的是用起到分泌物的分子捕获位点作用的亲合试剂，如抗体或免疫球蛋白结合蛋白修饰液滴-载体颗粒12表面(图16-分泌物的捕获和分选)。在其中分泌速率缓慢且细胞与液滴-载体颗粒12的结合快速的示例性实施方式中，如在生物素-抗生蛋白链菌素的反应中，可以用液滴-载体颗粒12内部或表面上的分子捕获位点预修饰液滴-载体颗粒12，并将其快速分配到液滴颗粒10中而不污染归因于结合细胞的信号。在其它实施方式中，当分泌速率快速且细胞可能需要数小时来强烈粘附至液滴-载体颗粒12表面时，如在其中贴壁细胞(例如，CHO细胞)粘附至RGD结合肽的情况下，首先使细胞粘附至液滴-载体颗粒12的表面，优选地粘附2-12小时。一旦细胞附着至液滴-载体颗粒12，则可以通过离心和溶液交换清洗样品以去除背景分泌物和未结合的细胞。然后，可以用结合至所关心的分泌物以形成与液滴-载体颗粒12附接的分子捕获位点的亲合试剂，如生物素化的蛋白A或生物素化的抗体修饰液滴-载体颗粒12，然后使其快速乳化成液滴颗粒10。本文公开了详细的规程。在一个优选的实施方式中，如对于图12的详细说明中所述，在生产期间通过在液滴-载体颗粒前体的葡聚糖相中引入4mg/mL RGD并且在液滴-载体颗粒前体的PEG相中引入0.5-5mg/mL生物素-PEG-硫醇，用RGD肽和生物素基团两者官能化液滴-载体颗粒12。在这些肽和生物素修饰的液滴-载体颗粒12上接种细胞。附接后，用0.02mg/mL结合至液滴-载体颗粒12表面上的生物素基团的抗生蛋白链菌素在PBS中的溶液处理每个液滴-载体颗粒12样品(30μL液滴-载体颗粒12，在12孔板中)。将样品培育10分钟，用具有0.5％BSA的PBS清洗几次。然后，用10μL 0.5mg/mL的生物素化的-蛋白A储液修饰每个浓缩的液滴-载体颗粒12样品并将其培育10分钟，如上所述。在适当修饰后，可以将液滴-载体颗粒12直接应用于分泌物测量应用并且可以如下所述进行乳化。

(3)使具有附着细胞的液滴-载体颗粒12和结合亲合试剂在油连续相中乳化以形成液滴颗粒10。

液滴颗粒10的最优形成和维持取决于几种因素，其包括所使用的表面活性剂的类型和浓度以及搅拌方法。在一个示例性实施方式中，作为连续相使用处于Novec^TM 7500工程流体中的2％Pico-Surf^TM(Sphere Fluidics)，其中与作为分散相的在PBS中的液滴-载体颗粒12或细胞培养基分别处于2：1的体积比。在这些情况下，发现通过手动移液的剧烈搅动(使用100μL、200μL或1mL移液器，每秒2-4次移液重复50-100X)可靠且可重复地形成了大部分仅含单个液滴-载体颗粒12的单分散液滴颗粒10。

(4)将液滴颗粒10培育一段时间以积累与亲合试剂结合的分泌物为了在培育期间保持细胞存活力，使用细胞培养基(RPMI-1640/DMEM等)和富含2％FBS的PBS两者形成了液滴颗粒10。由于最小分子可以容易地扩散通过水凝胶液滴-载体颗粒12的孔，因此将整个液滴颗粒10的体积用作营养物的储罐。另外，可以将液滴颗粒12在约37℃保持在标准细胞培育箱内。发现在液滴颗粒10层上方添加轻或重矿物油层通过降低蒸发和聚结而改善了稳定性。

通过包封在液滴颗粒10内的单细胞所产生的所有分析物保留在它们结合的水相体积或区室内。相对少量的这些液滴颗粒10导致分泌物信号的局部积累，其帮助液滴-载体颗粒12表面上的可检测的量的分泌物快速结合。基于预期分泌水平，可以基于所关心的细胞类型和分泌物靶标调整培育时间。例如，如果预期低分泌水平，则可以使用更长的培育时间(>12小时)；就高分泌速率来说，可以使用较短的培育时间(约2-3小时)。

基于预期分泌水平，可以调整分泌物结合位点数和/或结合位点的空间位置。在一个实施例中，可以通过制造基质孔隙度的孔径尺寸允许分泌物自由扩散通过凝胶基质的液滴-载体颗粒12来提高可用的结合位点。在该实施方式中，液滴-载体颗粒12的完整3D几何形状可以用于捕获分泌物的分子，从而提高结合位点总数，这对于高分泌水平是有益的，因为结合位点不容易饱和，从而使得具有更好的动态检测范围。在一些情况下，例如，低分泌水平，空间定位结合位点以产生更集中的信号是有利的。例如，通过使用固体液滴-载体颗粒12或者孔隙度使得分泌物不可以自由扩散通过液滴-载体颗粒12基质的颗粒，将可接近的结合位点定位至液滴-载体颗粒12表面。在其它实施方式中，结合位点可以定位至内部空腔或空隙18的表面以进一步定位分泌物捕获和所产生的信号。在本文所述的分泌物抗-IL8抗体的CHO细胞的详细实施例描述中，液滴-载体颗粒孔径足够小以防止靶标分泌物抗-IL-8自由扩散。这导致分泌物的抗-IL-8结合至液滴-载体颗粒12外部(即空腔18内以及外缘周边上)并且加强了积累的荧光信号的可见性。

(5)使液滴颗粒10乳液破裂以使具有附着细胞的液滴-载体颗粒12回到水溶液中。

一旦液滴颗粒10已培育足够长时间以用于充分分泌以积累并结合在液滴-载体颗粒12上用于显像，则使乳液不稳定以回收液滴-载体颗粒12和它们的结合细胞。这是通过添加第二表面活性剂，如全氟辛醇(PFO)或者Pico-Break^TM完成的。在一个实施方式中，从液滴颗粒10乳液去除所有过量的油并且用相等体积的处于Novec^TM-7500油中的20％的PFO替换。由于液滴不稳定，通过轻敲试管表面使溶液轻微搅动，在约2分钟后，在水相和有机相之间可见清楚的边界。可以通过以低速(约100g)快速离心约5秒，从水相去除任何剩余的小有机卫星液滴28。然后，在下游分析之前，从解离的油相(例如，通过移液)容易地去除水溶液和液滴-载体颗粒12。

(6)使用对分泌物特异的第二亲合试剂，对具有附着细胞的液滴-载体颗粒12的捕获的分泌物染色。

几种不同的报告方案可以用于分析结合至液滴-载体颗粒12的分泌物的分子。在一个优选实施方式中，可以添加缀合至对分泌物分子上的第二表位特异的荧光团的第二抗体以形成荧光夹心免疫复合物，从而报告所结合的分泌物分子的存在。该方法使得能够通过多种常用分析工具，如流式细胞仪150(图13A、图13B、图16和图18中所示)、酶标仪和荧光显微镜进行定量。

对于以特别低的浓度存在的分泌物分子，如本文所述，其中报告抗体缀合至酶，如辣根过氧化物酶并且切割结合至颗粒上的游离位点的荧光染料的扩增方案可以放大信号，如通过使用酪胺化学。在相关实施方式中，磁性纳米颗粒或磁性微颗粒可以用于标记捕获的所关心的分泌物分子。可以以多种方式使用磁性的添加。例如，使用磁力富集所关心的液滴-载体颗粒12或者分选所关心的样品。应理解染色不局限于这两种方式(例如，荧光和磁性)并且可以包括多个方式的组合。其它方式可以包括本领域中已知的比色、磷光、光散射颗粒、等离子纳米颗粒等。

(7)分析(例如，通过流式细胞仪150)具有附着细胞的染色的液滴-载体颗粒12并且任选地基于强度阈值(所述强度阈值基于对应于分泌物量/亲和性的染色)分选附接至液滴-载体颗粒12的所关心的细胞。

一旦染色，可以使用可商购的流式分选仪150(图13A、图13B、图16和图18中所示)以高通量分析并且另外分选液滴-载体颗粒12和它们的结合细胞。在优选的实施方式中，使液滴-载体颗粒12在营养物富集的PBS，如PBS+2％FBS中悬浮，从而在分选过程中保持细胞存活力。液滴-载体颗粒12的相对尺寸使得能够在分选期间，将溶液中的颗粒与污染尘屑、细胞碎片或小直径油滴清楚地区分，从而允许使用正向散射和侧向散射信号容易地鉴别。还容易地检测液滴-载体颗粒12上用胞质追踪染料、核染色剂、存活染色剂或报告抗体染色的粘附细胞，从而使得能够直接分析含有细胞的液滴-载体颗粒12。最后，一旦破乳，将报告抗体添加至液滴-载体颗粒12的表面以使得能够根据液滴-载体颗粒12表面的相对荧光强度，从颗粒空腔18内的各个细胞克隆直接定量相对蛋白产生。容易地分离了所关心的分选细胞，例如，分泌高水平的所期望的蛋白的克隆，并且其对于后续扩增保持存活，从而使得能够富集有益的细胞表型。

在其它实施例中，可以在多个循环中实施基于总分泌物的单细胞筛选以改善所期望的亚群的选择。图19示出了这种一般工作流程。按照先前提及的方法，可以将单细胞分离到液滴-载体颗粒12中，乳化到其中分泌物无干扰地积累且捕获在液滴-载体颗粒12上的液滴颗粒10中。然后，液滴-载体颗粒12可以输送回到水中，染色以指示分泌物的量，并且与附着细胞一起分析/分选。然后，可以将分选的细胞亚群扩增以实施重复选择步骤。在一个实施方式中，可以将附接至液滴-载体颗粒12的分选细胞接种到孔板或烧瓶中并直接从液滴-载体颗粒12扩增。例如，在培养几天后，发现CHO细胞在整个液滴-载体颗粒12表面扩增，从而最终在它们所接种的孔板表面上扩增。这具有减少处理步骤和限制细胞胰酶消化的优势。如果需要，可以使用标准胰酶消化和传代步骤从液滴-载体颗粒12去除贴壁细胞。在细胞扩增后，可以通过将回收的细胞在液滴-载体颗粒12上再次接种并重复先前所列步骤来再次进行单细胞分泌和分选循环。在相关实施方式中，在乳化前可以使在液滴-载体颗粒12中接种的单细胞生长以产生附接至液滴-载体颗粒12的克隆集落。这使得能够基于克隆的生长和分泌来进行组合分析/分选。例如，可以将细胞以使得大部分液滴-载体颗粒12仅含单细胞的浓度接种到液滴-载体颗粒12中。如果需要，可以筛选原始群体以去除具有多个细胞的液滴-载体颗粒12(例如，使用流式分选仪150)。接种后，细胞可以直接在液滴-载体颗粒12上扩增，从而形成单细胞集落。基于应用，这可以在多个时间内完成(例如，<24小时，24小时-1周，>1周)。在集落形成后，可以冲掉背景信号并且可以用分泌物结合位点修饰液滴-载体颗粒12。然后，如先前对于单细胞所列，实施分泌物筛选。由于细胞可以在包封前在液滴-载体颗粒12上生长，因此液滴颗粒10系统唯一地适合于该工作流程，从而提供了机会以去除在细胞生长期间积累的任何不希望的背景信号。在其中立即包封单细胞并使其扩增的其它方法中，在整个生长期内积累信号，这可能是不期望的或者导致信号饱和。

实施例工作流程

以下详细描述了选出高分泌性CHO细胞的实施例工作流程。所使用的实施例细胞系是CHO-DP12克隆#1934(ATCC)。如ATCC所指明的，制备细胞培养基。CHO-DP12细胞系产生了作为本实施例实验的靶标分泌物的人抗-IL-8抗体。

(1)加载细胞以在水溶液中附接至液滴-载体颗粒12

在本实施例中，使用了外径82.5微米，内径50微米的液滴-载体颗粒12。用0.5mg/ml生物素-PEG-硫醇(5000MW，nanocs)和4mg/ml的RGD(如前文描述的，在制造时添加至葡聚糖相)来修饰液滴-载体颗粒12。用1mL细胞培养基稀释30μL浓缩的液滴-载体颗粒12并将其添加至12孔板的一个孔中。然后，使液滴-载体颗粒12沉降10min。将CHO DP-12细胞浓缩至400万个细胞/ml。对于约0.3个细胞/颗粒的靶向包封，采取18μL浓缩细胞储液并用培养基稀释至50μL，然后小心地将其转移至预先接种了液滴-载体颗粒12的孔中。对于约0.1个细胞/颗粒的靶向包封，采取6μL浓缩细胞储液并稀释至50μL，然后小心地将其转移至预先接种了液滴-载体颗粒12的孔中。在将孔板移至培育箱中之前，使细胞接种10min。发现细胞强烈附接至液滴-载体颗粒12需要4-12小时的范围。

(2)清洗掉未结合的细胞和/或背景分泌物并且添加亲合试剂以结合至捕获所关心的特异性细胞分泌物的液滴-载体颗粒12。

在细胞培育足够时间量以附接至液滴-载体颗粒12之后，将液滴-载体颗粒12从孔板转移至15mL圆锥管。这是通过使孔板以约30°角倾斜并从上到下移取过量培养基以剪切掉附着在表面上的液滴-载体颗粒12，并将去除的液滴-载体颗粒12和结合的细胞移取至15ml圆锥管完成的。为了限制液滴-载体颗粒12与圆锥管壁的粘附，用具有0.1％PluronicF-127的PBS溶液、具有0.5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液或者具有2％FBS(胎牛血清)的PBS溶液对管预处理。然后，用补充有0.5％BSA的PBS(具有钙和镁离子)清洗液滴-载体颗粒12和结合细胞2-3次。这种清洗去除了可能存在于培养基中的任何生物素和来自于可能存在于背景培养基中的细胞的任何蛋白。注意对于所有清洗步骤，将样品以300g离心3min。然后，用0.02mg/ml结合至液滴-载体颗粒12上可用的生物素基团的抗生蛋白链菌素溶液修饰液滴-载体颗粒12。培育10min后，用PBS+0.5％BSA清洗液滴-载体颗粒12和结合细胞2-3次。然后，用生物素化的蛋白A修饰液滴-载体颗粒12，所述生物素化的蛋白A用作分泌物的抗-IL-8蛋白的实施例捕获位点。在本实施例中，将10μL 0.5mg/ml的生物素化的蛋白A(ThermoFisher Scientific)储液加入至每个样品，然后培育10min。可替换地，可以使用生物素化的IgG1，FC小鼠抗-人。最终，用PBS+0.5％BSA清洗样品2-3次。通过最终清洗，用细胞培养基替换PBS。

(3)使具有附着细胞的液滴-载体颗粒12和结合亲合试剂在油连续相中乳化以形成液滴颗粒10。

通过使样品离心沉降(300g，2min)浓缩液滴-载体颗粒12和结合细胞。然后，去除上清液直至保留约50μL样品。然后，将100μL Novec^TM油+2％w/v Pico-Surf^TM添加至样品。然后，将Eppendorf管轻弹2-5x以帮助使样品破裂成大液滴。然后，使用100μL或200μL移液器，将样品以2-4次移液每秒的速率上下移液50-100x以产生单分散液滴颗粒10。在液滴颗粒10形成后，随后将矿物油加入样品上方(约100-150μL)，从而在样品培育的同时防止样品蒸发和减少聚结。

(4)将液滴颗粒10培育一段时间以积累与亲合试剂结合的分泌物

使样品在细胞培育箱(37℃，5％CO₂)中培育2-24小时。在该步骤期间，使分泌物的抗-IL-8蛋白附接至液滴-载体颗粒12上的蛋白A结合位点(参见图17A)。

(5)使液滴颗粒10乳液破裂以使具有附着细胞的液滴-载体颗粒12回到水溶液中。

为了将液滴-载体颗粒12和细胞输送回到水相中，在样品上方添加约4-6mL PBS+2％FBS。然后，通过移液去除所添加的矿物油。然后，将50μL处于Novec^TM油中的20％v/v PFO添加至样品以帮助液滴聚结。通过轻敲Eppendorf管来帮助聚结。2-5min后，可以通过将样品以100g离心5-10秒来使任何剩余的液滴聚结。一旦相转移完成，将液滴-载体颗粒12和结合细胞转移到新的15ml圆锥管中(用2％FBS在PBS中的溶液或0.5％BSA或0.1％PluronicF-127预处理)。

(6)使用对分泌物特异的第二亲合试剂，对具有附着细胞的液滴-载体颗粒12的捕获的分泌物染色。

用PBS+2％FBS清洗水相14中的液滴-载体颗粒12样品2-3次。在最后一次清洗时，将样品离心沉降并吸出上清液直至剩余约100μL。将预吸附的10μL 0.5mg/ml的山羊抗-人IgG H&L(Cy5)(Abeam,ab97l72)加入至样品中以染色液滴-载体颗粒12上捕获的抗-IL-8蛋白(图17A)。在37℃培育30min后，用PBS+2％FBS清洗样品2-3x以去除任何未缀合的染色剂。然后，在向流式细胞仪150转移期间，将样品设置在冰上。

任选地，在该染色过程期间，可以用钙黄绿素AM对与液滴-载体颗粒12结合的细胞染色。图17B示出了对用钙黄绿素AM染色的具有结合的细胞的液滴-载体颗粒12所采集的实施例显微镜图像。荧光成像清楚地示出了在所存在的具有钙黄绿素AM-染色的活细胞的液滴-载体颗粒12上在Cy5通道(分泌物染色通道)中的强信号。在不具有结合细胞的其它液滴-载体颗粒12上显示出极少的背景信号。这表明了在培育步骤期间，成功的分泌物捕获和标记以及液滴颗粒10之间的有限干扰。

(7)分析(例如，通过流式细胞仪150)具有附着细胞的染色的液滴-载体颗粒12并且任选地基于强度阈值(所述强度阈值基于对应于分泌物量/亲和性的染色)分选附接至液滴-载体颗粒12的所关心的细胞。

使用来自On-Chip Biotechnologies Co.,Ltd.,Tokyo,Japan的On-Chip Sort流式细胞仪150高通量分析样品。用PBS+2％FBS将样品稀释至200μL并添加至样品入口。在本文中，使用来自On-Chip biotechnologies的150μm流式芯片。PBS+2％FBS也用作鞘流体。将对正向散射高度(FSC(H))和侧向散射高度(SSC(H))的设门用于从其它背景事件/噪音中选出液滴-载体颗粒12。其它事件可能与仍存在于溶液中的少量Novec^TM 7500油滴，从液滴-载体颗粒12解离的细胞或细胞碎片有关。图18示出了实施例设门图。在该第一设门后，从相对远红外荧光信号选择分选事件。例如，在图18中，作为分选门选择前10％的远红外信号。然后，分选并收集含有具有附着细胞的液滴-载体颗粒12的样品。使用On-Chip Sorter流式细胞仪150，样品的事件率通常为约50-300个事件。用钙黄绿素AM对所收集的样品染色，并在荧光显微镜下显像，如图18所示。在分选后，如通过钙黄绿素AM活细胞染色信号所示，大部分细胞维持存活。此外，Cy5通道图像(捕获的分泌物染色通道)显示在分选后，液滴-载体颗粒12和结合细胞以高捕获分泌物水平显著积累。这证明了使用液滴颗粒10系统基于相对分泌水平分选细胞的能力。

液滴颗粒的条型码化

多种方案可以用于以唯一识别标签使液滴-载体颗粒12分批条型码化，从而可以在相同实验程序中探查多个靶标(例如，核酸、蛋白、细胞或其它分析物)。这些包括通过如上所述用于产生DNA寡聚物的裂分和合并合成，或者通过具有不同比值的多个荧光团的荧光强度(图15B)，通过改变预包封的磁性纳米颗粒52的浓度的磁性亲合力(图15C)，来自具有不同尺寸和量的纳米颗粒54的独特流式细胞计数侧向散射特征(图15D)或者允许液滴-载体颗粒12的直径或其它尺度用作唯一识别标签同时维持均一尺寸的空腔或空隙的颗粒形态的变化(图15A)。还可以将不同的条型码化方法组合以进一步提高不同类型的液滴-载体颗粒12的数目。

少量不同颜色的荧光团的共价附接简单地通过每个分子相对浓度的变化提供了巨大的区分潜力。例如，仅三种不同的荧光团在8个不同浓度下的附接或另外包埋获得了超过500个可以唯一检测并且归因于特定液滴-载体颗粒的不同的条型码。通过缀合至抗体的荧光团、反应基团或者通常可以结合至液滴-载体颗粒12表面或者包埋在液滴-载体颗粒12基质内或与所述基质共价连接的任何其它部分的附接容易地实现了液滴-载体颗粒12的荧光条型码化。例如，可以在制造期间或之后，通过将马来酰亚胺修饰的荧光染料(例如，Alexa Fluor^TM 488马来酰亚胺、Alexa Fluor^TM 568马来酰亚胺等)缀合至硫醇化交联剂来标记使用PEG-Norb或PEG-VS制造的液滴-载体颗粒12。可以将不同比例的这些荧光团混合以产生唯一的条型码。在另一个实施方式中，在液滴-载体颗粒12交联之前或之后，生物素-PEG-硫醇(Nanocs)可以缀合至PEG-Norb、PEG-VS或任何其它硫醇反应性PEG基聚合物。然后，可以用具有多种颜色、浓度和比值的荧光抗生蛋白链菌素分子(例如，Alexa Fluor^TM488、568、647抗生蛋白链菌素等)来修饰生物素基团。在颗粒制造后，用荧光抗生蛋白链菌素修饰使得能够有效地进行条型码化过程。例如，可以将不同的标记的抗生蛋白链菌素分子的预混合物以不同浓度/比值预混合并随后可以添加所制造的液滴-载体颗粒12以有效产生多种不同的条型码。在另一个实施例中，在生产期间，在一个实施方式中，具有不同浓度和比值的荧光纳米颗粒可以与水凝胶前体混合并包埋在液滴-载体颗粒12的水凝胶基质中。可以使用标准显微镜术、流式细胞术150、酶标仪或多种其它实验室设备标准件实施水相中或液滴颗粒10内的条型码化的液滴-载体颗粒12的荧光读数。

磁力可以用于通过所施加的磁场内磁吸引力的变化来使液滴-载体颗粒12和所得的液滴颗粒10条型码化。可以用不同的磁含量水平生产液滴-载体颗粒12，从而获得不同的磁性条型码。可以通过在聚合前在液滴-载体颗粒前体溶液内引入水溶性磁性纳米颗粒或微颗粒52来实现不同的磁含量水平。其中使用磁性条型码的一个实施方式包括在存在振荡磁场的情况下，将液滴颗粒10或液滴-载体颗粒12设置在磁柱阵列上的表面上。这种振荡导致了在整个柱平面上的净单向移动，其沿移动平面的间隔越来越远。然后，液滴颗粒10或液滴-载体颗粒12在水相中所覆盖的总距离与磁官能化程度成正比，因为具有低磁含量的液滴-载体颗粒12最终将停止，不能穿过到达下一个柱序列的距离，然而具有较大磁化程度的那些将由于更强的吸引力而继续移动，如美国专利No.10,144,911中所公开的，该专利作为参考并入本文。液滴-载体颗粒12的磁性官能化也使得乳液能够在整个连续相中快速移动。在存在所施加的磁场的情况下，包封在乳化微颗粒内的磁性颗粒42提供了足够的作用力以将含有液滴-载体颗粒12的液滴与大的卫星液滴28背景相分离(参见图5)。因此，这种条型码方案的应用不仅可以通过所施加的作用力的变化来空间分离亚群，而且还可以将液滴-载体颗粒12与不希望的卫星液滴28分离以改善多种测定中的信号。

粒度是流式细胞术中常用的将不同细胞亚型彼此分开的度量。可以通过添加具有不同尺寸和/或浓度的光散射纳米颗粒54(其将光散射至不同角度和/或具有不同强度)来使液滴-载体颗粒12条型码。在一个实施方式中，在聚合以产生具有包埋的散射条型码的液滴-载体颗粒12之前，可以将纳米颗粒54(例如，聚苯乙烯纳米颗粒)加载到前体水凝胶溶液中。例如，通过分析侧向散射信号而无需要求补偿和可以干扰荧光标记且附接至液滴-载体颗粒12的分析物的分析的额外荧光信号，这种替代方法允许在流式细胞仪150中分析液滴-载体颗粒12的类型。

使液滴-载体颗粒条型码化的另一种方法包括通过液滴-载体颗粒12本身的尺寸。这如图15A所示。不同尺寸的液滴-载体颗粒12将在流式细胞仪150中导致产生不同的正向散射信号。颗粒直径的差异还使得在颗粒分类之间产生目视差异并且可以容易地通过广视野成象和显微镜学分类。另外，通过施加在流场内每个液滴-载体颗粒12上的累积作用力的变化，微流体技术，如惯性聚焦或确定性横向位移可以用于将具有不同尺寸的液滴-载体颗粒12彼此分选。如通过其它非荧光条型码所讨论的，这种基于尺寸的条型码使得跨过多个波长的荧光信号能够用于分析物检测而无条型码干扰。另外，对于流式细胞仪150成像，可以对液滴-载体颗粒12和空隙或空腔区18的形状/尺寸成像，从而也提供了条形码化的方法。

液滴颗粒/液滴-载体颗粒的读取和分选方法

为了将液滴颗粒测定中所产生的信号转化为可定量的测量，必须使读取测定输出的明确定义的方法与液滴颗粒系统相适合。此外，开发处理信号并将液滴颗粒10的亚型分选成不同群体的方法对于来自单细胞研究的高性能液滴颗粒的分离是至关重要的。值得注意地，液滴-载体颗粒12和形成的液滴颗粒10与多种常用的实验室系统相适合，这使得使用适当设备的读取和分选相对直接。

在某些实施方式中，对应于包封在液滴颗粒10内的体积中所实施的反应的信号附接至液滴-载体颗粒12表面或者在液滴-载体颗粒12内和周围的水相14中积累。这使得能够在定制微流体装置(其可以与油连续相中的液滴颗粒10相适合)和商品化流式细胞仪150和FACS系统(其与返回水相的液滴-载体颗粒12相适合)两者中通过信号检测器(例如，光电倍增管(PMT))检测荧光或比色信号变化。一些商品化的流式细胞仪150也与油连续相相适合，如来自On-Chip Biotechnologies Co.,Ltd.,Tokyo,Japan的On-Chip Flow和On-ChipSort。应将液滴-载体颗粒12的直径调节至用于在标准商品化流式细胞仪150中使用的<约50微米，然而，多至约500微米的更大的尺寸可以用于其它商品化细胞计数系统(例如，来自On-Chip Biotechnologies或者来自Union Biometrica的Biosorter)。如本文所讨论的，还可以同时使用荧光和/或散射信号来读取条型码特征。然后，当将阈值或门用于识别特定亚群时，可以从流式细胞术的散布图对每个条型码的正信号液滴-载体颗粒12数计数，这导致了通过对特定条型码门内且相对于低测定信号具有高测定信号的液滴-载体颗粒12部份计数的多路测定。还可以实施基于这些测定信号的分选以分离高vs.低液滴-载体颗粒12以用于进一步细胞分析和生长或者核酸分析和下游测序。在其它实施方式中，还可以将含有捕获的分析物(例如，使用抗体)的液滴颗粒10暴露于也结合至所捕获的分析物的磁性颗粒/微泡颗粒以形成夹心。然后，分别通过磁场或浮力分离正信号颗粒。

标准荧光显微镜术也是探查测定结果的有效方法。在本文中，可以应用广视野成像规程以测量样品批次中的所以液滴颗粒10并对各个测定测量的差异度建立更好的理解。在一些实施方式中，便携式成像系统可以用于进行原位/原点谨慎分析(例如，移动装置上的广视野荧光成像)，如美国专利申请公开No.2013-0157351或者美国专利No.9,007,433中所公开的，这些专利作为参考并入本文。另外，液滴-载体颗粒12几何形状的不均一性表明可以在成像期间或者在流式分析期间使用磁场以相同取向排列磁性液滴颗粒10群体，从而从颗粒空隙或空腔18获得均一信号。

可以利用新月形液滴-载体颗粒12的不对称性，基于浮力排列液滴-载体颗粒12。例如，发现比水相密度更大的新月形液滴-载体颗粒12趋向于沉降并以它们的空腔18竖直暴露取向。这通常在5-10min的时间尺度上发生。可以使用这种优选的排列以使其更易于将微尺度物体加载到暴露的空腔18中(例如，加载细胞)。在受限通道中流动期间，还可以利用液滴-载体颗粒12的形状来产生优先取向。例如，可以调节液滴-载体颗粒12的形状，从而在优选方向上定位颗粒，从而散射特征更均一。

尽管已显示和描述了本发明的实施方式，但是在不背离本发明的范围的情况下可以做出多种修改。因此，除了以下权利要求及其等价形式外，不应限制本发明。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 具有单分散流体体积的含颗粒液滴系统

<130> 2019-035-2

<140> PCT/US19/46835

<141> 2019-08-16

<150> 62/719,476

<151> 2018-08-17

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 1

Arg Gly Asp Ser Pro Gly Glu Arg Cys Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 交联的肽

<400> 2

Gly Cys Arg Asp Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Asp Arg Cys Gly

1 5 10 15