发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种合欢花总黄酮成分的提取纯化方法，实现工业化大规模提取和纯化合欢花总黄酮。

为解决上述技术问题，本发明合欢花总黄酮成分的提取纯化方法包括以下步骤：

(1)将合欢花在-5～-20℃的低温下冷冻后进行冷冻干燥；所述合欢花是在夏季7月份至8月份之间，天气晴朗的正午从合欢树上采集的新鲜合欢花或尚未盛开的花蕾，以保证原材料中总黄酮积累量达到最高水平。同时，采用冷冻干燥技术保障合欢花在干燥过程中黄酮类成分不发生变化。

(2)取干燥的合欢花进行粉碎，由于采集的合欢花通常有较多花梗，而花梗中总黄酮含量低，植物纤维较多，若不过筛处理则样品粉末中会有较多的花梗纤维，导致所用提取溶剂量增加而总黄酮提取率降低。因此，将粉碎后的合欢花过20目筛，可除去部分体积较大的花梗纤维，然后收集过筛的合欢花粉末备用；作为优选，所述合欢花采用超微破碎机粉碎。

(3)称取合欢花粉末，按照料液比(合欢花质量/乙醇溶液体积)1：50～80加入乙醇溶液，以保证合欢花粉末既能充分吸收乙醇溶液，同时又能有足够的乙醇溶液浸没合欢花粉末，有利于提取。若料液比低于1：50则合欢花粉末吸收乙醇溶液后剩余溶液太少，提取溶剂中总黄酮含量达到饱和，不利于合欢花总黄酮充分溶出，导致提取率较低；料液比高于1：80时，合欢花粉末中总黄酮已充分溶出，提取率不会进一步显著升高，不仅造成溶液浪费，也会增加后续浓缩耗时，降低提取效率。提取所用乙醇溶液浓度为30％～80％，以保证合欢花总黄酮充分溶解于乙醇提取液中，有利于提取。由于合欢花总黄酮成分大部分为中等极性化合物，若乙醇提取液浓度低于30％，提取溶剂极性大于合欢花总黄酮的极性，根据化合物极性相似相溶原理，使用相同体积大极性提取溶剂时合欢花总黄酮溶出少，而大极性杂质溶出增多，不仅降低了总黄酮的提取率，也不利于后续纯化；而当乙醇提取液浓度高于80％，提取溶剂极性小于合欢花总黄酮的极性，合欢花总黄酮溶出减少，而较小极性杂质溶出增多，同样会降低总黄酮提取率，且不利于后续总黄酮富集纯化。将合欢花粉末按照上述比例与乙醇溶液混合好后，在25～40℃之间进行超声波辅助提取。当超声温度低于25℃时，由于黄酮类化合物分子动能低，在提取溶剂中溶解度低，相同提取时间内黄酮类成分溶出少，导致合欢花总黄酮提取不充分，提取率下降；同时超声提取温度不应高于40℃，由于合欢花总黄酮中主要以黄酮糖苷类化合物为主，在含水条件下较高温度可引起糖苷类化合物的糖苷键水解，导致合欢花提取物分解，总黄酮提取率降低。超声10～30min，以保证合欢花总黄酮充分提取。当超声时间低于10min时，合欢花总黄酮无法充分溶出至提取溶剂中，导致合欢花总黄酮溶出少，提取率低；而当超声时间高于30min时，由于合欢花总黄酮已经充分溶出至提取溶剂中，提取率不会再有明显升高，同时长时间提取还会有更多杂质溶出，且超声时间长会导致提取样品温度升高，可能引起黄酮类成分分解，不利于后续总黄酮富集纯化。超声频率为40kHz。通过超声波辅助提取装置极大缩短了提取时间，同时降低了提取温度和提取溶剂的用量，不仅可解决传统热回流提取法引起的有效成分降解，还可以降低能耗和提取溶剂使用量等问题，更有利于节能环保。

(4)将提取后的物料进行过滤，收集合欢花提取物滤液，然后将合欢花粉饼与浓度为30％～80％的乙醇溶液按照料液比(合欢花质量/乙醇溶液体积)1：50～80混合，在25～40℃之间利用超声波辅助提取10～30min，超声频率40kHz。所述物料过滤采用板框压滤机，在药渣过滤时采用自动化的板框压滤装置，能够有效避免药材粉末引起的管路堵塞，同时较提取罐内直接过滤的传统方法减少了一半的过滤时间，缩短了整个提取周期，较极大地提高了合欢花总黄酮的提取效率。

(5)将合欢花提取物滤液放入储液器中，将储液器中的合欢花提取物滤液泵入单效外循环真空浓缩器中，在30～40℃条件下进行浓缩，浓缩时温度不应低于30℃，否则提取溶剂蒸发速度慢，合欢花提取液浓缩时间长，降低提取效率；同时，由于合欢花总黄酮中富含黄酮糖苷类化合，在含水条件下温度较高容易引起黄酮糖苷类化合物的糖苷键水解，因此浓缩时温度不应高于40℃，避免合欢花总黄酮提取物分解。由于溶剂沸点会随着气压降低而降低，在高真空度时溶剂可在较低温度下快速蒸发，因此在浓缩时真空浓缩器的真空度设为0.02～0.05MPa，以降低合欢花醇提液的沸点，便于在较低温度下回收提取溶剂，缩短提取时间，提高浓缩效率。将合欢花提取液浓缩至无乙醇味道，获得合欢花提取浓缩液。

(6)将所得合欢花提取浓缩液用HP2MGL或SP207大孔树脂柱吸附，根据相似相溶原理，蒸馏水和20％乙醇溶液属于大极性溶剂，有利于溶解洗脱大孔树脂吸附的大极性化合物，可先分别用3～6倍柱体积的蒸馏水和20％乙醇洗脱，以除去提取物中多糖、水溶性色素等大极性杂质，提高合欢花总黄酮的纯度。合欢花总黄酮属于中等极性化合物，40～60％的乙醇溶液为中等极性洗脱剂，因此再用4-8倍柱体积的40～60％的乙醇洗脱大孔树脂柱，收集乙醇洗脱液，得到经过富集纯化的合欢花总黄酮。

(7)将收集的乙醇洗脱液利用单效外循环真空浓缩器在30～40℃条件下进行浓缩，浓缩时温度不应低于30℃，否则提取溶剂蒸发速度慢，合欢花提取液浓缩时间长；同时，浓缩时温度不应高于40℃，避免合欢花提取物分解，影响合欢花总黄酮纯度。浓缩时真空浓缩器的真空度设为0.02～0.05MPa，高真空度可降低乙醇洗脱液的沸点，便于在较低温度下回收提取溶剂。待乙醇洗脱液浓缩至无乙醇味道时进行冷冻干燥，从而获得合欢花总黄酮提取物。

本发明方法填补现有技术领域的空白，缩短了提取、浓缩及过滤时间，降低了提取和浓缩温度，解决了传统热回流提取法引起的有效成分降解、提取周期长，提取效率低等问题。通过采用超声辅助提取装置极大缩短了提取时间、降低了提取温度，解决了传统热回流提取法提取时间长以及有效成分降解等问题，合欢花总黄酮提取率达到3.35％～3.5％(提取物质量/合欢花药材质量)。本发明中采用板框压滤装置对提取物进行过滤，有效避免药材粉末引起的提取罐过滤管路堵塞，同时较提取罐内直接过滤的传统方法减少一半的过滤时间，缩短了合欢花总黄酮的提取周期，提高了提取纯化效率。采用本发明方法富集合欢花总黄酮，所得合欢花总黄酮纯度可达到40％～41.6％。