具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人的制备方法，包括以下步骤：

a)将磁性镁合金纳米颗粒、抗肿瘤药物、液态硬脂酸、挥发性有机溶剂和水进行混合，得到混合液；

b)将所述混合液滴入液冷介质中，并搅拌挥去挥发性有机溶剂，得到混悬液；

c)对所述混悬液进行离心分离，弃上清液，得到具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。

在本发明提供的制备方法中，首先将磁性镁合金纳米颗粒、抗肿瘤药物、液态硬脂酸、挥发性有机溶剂和水进行混合。其中，所述磁性镁合金颗粒的化学成分优选包括Nd、Zr、Fe、SiO₂、Mn和Mg，Zr的加入可明显细化镁合金晶粒；所述Nd在磁性镁合金颗粒中的含量优选为3～5wt％，具体可为3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％或5wt％；所述Zr在磁性镁合金颗粒中的含量优选为15～20wt％，具体可为15wt％、15.5wt％、16wt％、16.5wt％、17wt％、17.5wt％、18wt％、18.5wt％、19wt％、19.5wt％或20wt％；所述Fe在磁性镁合金颗粒中的含量优选为3～5wt％，具体可为3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％或5wt％；所述SiO₂在磁性镁合金颗粒中的含量优选为10～20wt％，具体可为10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、15.5wt％、16wt％、16.5wt％、17wt％、17.5wt％、18wt％、18.5wt％、19wt％、19.5wt％或20wt％；所述Mn在磁性镁合金颗粒中的含量优选为3～5wt％，具体可为3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％或5wt％；所述Mg在磁性镁合金颗粒中的含量优选为50～66wt％，具体可为50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、54wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％或66wt％。在本发明中，所述磁性镁合金颗粒的粒径优选为80～100nm，具体可为80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm或100nm。在本发明中，所述磁性镁合金颗粒优选按照以下步骤制备获得：

i)将磁性镁合金进行固溶处理，得到磁性镁合金熔液；

ii)将所述磁性镁合金熔液滴加到冷浴中，得到磁性镁合金纳米颗粒。

在本发明提供的上述磁性镁合金颗粒制备步骤中，首先对磁性镁合金进行固溶处理。其中，所述固溶处理的温度优选为700～800℃，具体可为700℃、710℃、720℃、730℃、740℃、750℃、760℃、770℃、780℃、790℃或800℃；所述固溶处理的时间优选为7～8h，具体可为7h、7.1h、7.2h、7.3h、7.4h、7.5h、7.6h、7.7h、7.8h、7.9h或8h。磁性镁合金进行固溶处理后，得到磁性镁合金熔液。

在本发明提供的上述磁性镁合金颗粒制备步骤中，得到磁性镁合金熔液后，将所述磁性镁合金熔液滴加到冷浴中。其中，所述冷浴包括但不限于液氮浴、液氢浴、干冰丙酮浴、干冰乙腈浴或干冰乙醇浴，优选为液氮浴；所述滴加的速率优选为0.5～1mL/min，具体可为0.5mL/min、0.55mL/min、0.6mL/min、0.65mL/min、0.7mL/min、0.75mL/min、0.8mL/min、0.85mL/min、0.9mL/min、0.95mL/min或1mL/min；所述磁性镁合金熔液与冷浴的体积比优选为1：(50～80)，具体可为1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75或1:80。在本发明中，通过将磁性镁合金熔液滴加到冷浴中，可实现磁性镁合金熔液的急速冷却，在这个过程中磁性镁合金熔液中金属的内在结构会发生改变，能够使金属迅速从液态转换至固态，并且碎裂成呈粉末状态的磁性镁合金纳米颗粒。在本发明中，可通过控制磁性镁合金的Zr含量、磁性镁合金熔液的滴加速度以及液氮用量来调整金属颗粒的尺寸。

在本发明提供的上述磁性镁合金颗粒制备步骤中，滴加到冷浴中的磁性镁合金熔液形成磁性镁合金纳米颗粒后，让其在冷浴中静置一段时间，所述静置的时间优选为5～10min，接着将其从冷浴中分离出，得到干燥的磁性镁合金纳米颗粒。其中，所述分离的方式优选为直接对冷浴进行加热，使冷浴气化挥发。

在本发明提供的制备方法中，所述抗肿瘤药物包括但不限于紫杉醇(PTX)、地塞米松(DXM)、水蛙素、阿霉素、多西他赛和多柔比星中的一种或多种；所述硬脂酸在60℃以上的制备温度时为液态，在体内可降解，生物相容性好，对人体无毒性，而且硬脂酸在降温凝固并粘附抗肿瘤药物后，可使药物具有缓释，控释和靶向作用；所述挥发性有机溶剂包括但不限于丙酮；所述混合液中优选还含有叶酸、氧化石墨烯和非离子表面活性剂；所述叶酸可特异性地与细胞表面的叶酸受体作用形成复合物，其两者结合力非常强，对肿瘤有高度选择性，可作为肿瘤靶向药物的修饰化合物；所述氧化石墨烯具有高的孔隙率、大的比表面，能够提高抗肿瘤药物和磁性镁合金纳米颗粒的分散性，所述氧化石墨烯的孔隙率优选为85～95％，具体可为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％，所述氧化石墨烯的比表面积优选为2300～3000m²/g，具体可为2300m²/g、2350m²/g、2400m²/g、2450m²/g、2500m²/g、2550m²/g、2600m²/g、2650m²/g、2700m²/g、2750m²/g、2800m²/g、2850m²/g、2900m²/g、2950m²/g或3000m²/g，所述氧化石墨烯的厚度优选为10～25nm，具体可为10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm或25nm；所述非离子表面活性剂主要对纳米机器人的表面起到修饰和包封作用，包括但不限于吐温80(TWEEN 80)、吐温20(TWEEN 20)和泊洛沙姆中的一种或多种，优选为吐温80。

在本发明提供的一个实施例中，所述混合液优选按照以下步骤进行制备：

I)将抗肿瘤药物和挥发性有机溶剂混合，得到有机溶剂混合体系，称作混合体系A；

将硬脂酸和水加热混合，得到液态硬脂酸与水的混合体系，称作混合体系B；

II)将所述混合体系A、混合体系B和磁性镁合金纳米颗粒混合，即可得到所述混合液。

在本发明上述实施例提供的混合液制备步骤中，制备混合体系A时，所述抗肿瘤药物在混合体系A中的含量优选为30～35wt％，具体可为30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％或35wt％；所述挥发性有机溶剂在混合体系A中的含量优选为45～60wt％，具体可为45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、54wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％或60wt％。在本发明中，若所述混合液中还含有氧化石墨烯，则在制备混合体系A时将其添加到混合体系中，所述氧化石墨烯在混合体系A中的含量优选为10～20wt％，具体可为10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％或20wt％。

在本发明上述实施例提供的混合液制备步骤中，制备混合体系A时，优选先将抗肿瘤药物和挥发性有机溶剂混合得到药物溶液，然后再将所述药物溶液与氧化石墨烯混合，得到混合体系A。其中，第二步混合优选在超声和搅拌条件下进行，所述搅拌的转速优选为200～300r/min，具体可为200r/min、250r/min或300r/min。

在本发明上述实施例提供的混合液制备步骤中，制备混合体系B时，所述硬脂酸和水的质量比优选为(2～6)：6，具体可为2:6、2.5:6、3:6、3.5:6、4:6、4.5:6、5:6、5.5:6或6:6；所述混合的温度优选控制在可使硬脂酸保持为液体状态的温度，具体可控制在60℃左右；所述混合的方式优选为搅拌混合，所述搅拌混合的搅拌速度优选为500～800r/min，具体可为500r/min、550r/min、600r/min、650r/min、700r/min、750r/min或800r/min，所述搅拌混合的时间优选为60～120min，具体可为60min、70min、80min、90min、100min、110min或120min。

在本发明上述实施例提供的混合液制备步骤中，步骤II)中，所述混合体系A和混合体系B的体积比优选为(4～8)：3，具体可为4:3、5:3、6:3、7:3或8:3；所述磁性镁合金纳米颗粒的用量优选为所述混合体系A和混合体系B总质量的25～35wt％，具体可为25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％或35wt％。在本发明中，优选先将混合体系A和混合体系B混合，然后再将其与磁性镁合金纳米颗粒混合，得到所述混合液。其中，所述混合体系A和混合体系B混合的温度优选控制在60～65℃，混合的方式优选为搅拌混合，搅拌混合的搅拌速度优选为400～500r/min，具体可为400r/min、450r/min或500r/min，搅拌混合的时间优选为20～30min，具体可为20min、25min或30min；所述与磁性镁合金纳米颗粒混合的温度优选控制在60～65℃，混合的方式优选为搅拌混合，搅拌混合的搅拌速度优选为400～500r/min，具体可为400r/min、450r/min或500r/min，搅拌混合的时间优选为10～15min，具体可为10min、12min或15min。在本发明中，若所述混合液中还含有叶酸和非离子表面活性剂，则在将混合体系A、混合体系B和磁性镁合金颗粒混合均匀后，向其中加入叶酸和非离子表面活性剂继续混合。其中，所述叶酸与所述混合体系B的质量体积比优选为(0.5～2)g：3mL，具体可为0.5g：3mL、1g：3mL、1.5g：3mL或2g：3mL；所述非离子表面活性剂与所述混合体系B的体积比优选为(0.5～2)：3，具体可为0.5:3、1:3、1.5:3或2:3；所述继续混合的方式优选为搅拌混合，搅拌混合的搅拌速度优选为100～200r/min，具体可为100r/min、150r/min或200r/min，搅拌混合的时间优选为15～45min，具体可为15min、30min或45min；所述继续混合的初始温度优选为55～59℃，终止温度优选为35～45℃。

在本发明提供的制备方法中，得到混合液后，将所述混合液滴入液冷介质中，并搅拌挥去挥发性有机溶剂，得到混悬液。其中，所述滴入的速度优选为5～20mL/min，具体可为5mL/min、6mL/min、7mL/min、8mL/min、9mL/min、10mL/min、11mL/min、12mL/min、13mL/min、14mL/min、15mL/min、16mL/min、17mL/min、18mL/min、19mL/min或20mL/min；所述液冷介质是指在低温下依然可以保持流动态的液体，所述液冷介质的温度优选为-10～0℃，具体可为-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃；所述搅拌过程中体系的温度优选控制在5～10℃，具体可为5℃、5.5℃、6℃、6.5℃、7℃、7.5℃、8℃、8.5℃、9℃、9.5℃或10℃；所述搅拌的速度优选为100～300r/min，具体可为100r/min、120r/min、150r/min、180r/min、200r/min、230r/min、250r/min、270r/min或300r/min；所述搅拌的时间优选为15～30min，具体可为15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min。

在本发明提供的制备方法中，得到混悬液后，对所述混悬液进行离心分离。其中，所述离心分离的转速优选为8000～10000r/min，具体可为8000r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min或10000r/min；所述离心分离的时间优选为15～30min，具体可为15min、18min、20min、23min、25min、27min或30min。离心分离结束后，弃上清液，得到具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。在本发明中，通过离心分离可以使制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人的表面更佳光滑，同时致密性更好。

本发明首先将磁性镁合金纳米颗粒、抗肿瘤药物、液态硬脂酸和溶剂混合制成混合液，之后对所述混合液进行急速降温，在急速降温的过程中硬脂酸由液态转化为固态并对混合液中的磁性镁合金纳米颗粒和抗肿瘤药物进行粘附，形成无数个由硬脂酸、磁性镁合金纳米颗粒和抗肿瘤药物粘连构成的微球，最后采用离心分离的方式将这些微球分离出来，即为本发明制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。本发明提供的制备方法通过在纳米机器人中添加磁性镁合金纳米颗粒，一方面可使纳米机器人表现出良好的磁性，从而使其可在外加磁场控制下准确到达肿瘤部位，实现对肿瘤的靶向治疗；另一方面由于磁性镁合金纳米颗粒可被完全降解，因此可使纳米机器人表现出良好的可降解性。采用本发明提供的方法制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人具有良好的尺寸均匀性、磁性和可降解性，可高效靶向杀死肿瘤细胞，同时可在杀死肿瘤细胞后被人体完全降解或吸收，无任何副作用。本发明提供的制备方法生产工艺稳定、可控，适于工业化，在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。

本发明还提供了一种采用上述技术方案所述方法制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。本发明提供的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人具有良好的尺寸均匀性、磁性和可降解性，可高效靶向杀死肿瘤细胞，同时可在杀死肿瘤细胞后被人体完全降解或吸收，无任何副作用，因此，本发明提供的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。

为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

1)磁性镁合金纳米颗粒的制备：

1.1)磁性镁合金在750℃下进行7.5h的固溶处理，得到磁性镁合金熔液。其中，所述磁性镁合金的化学成分为：Nd 4wt％，Zr 17wt％，Fe 4wt％，SiO₂12wt％，Mn 4wt％、余量的Mg。

1.2)将1mL磁性镁合金熔液滴加到70mL液氮中，滴加速率控制在0.7mL/min；滴加完毕后，静置5～10min，然后将体系温度加热至30℃，液氮在加热过程中气化挥发，得到干燥的磁性镁合金纳米颗粒，颗粒直径为80～100nm。

2)具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人的制备：

2.1)将紫杉醇溶于丙酮中，搅拌10～15min至完全溶解，然后再加入氧化石墨烯，边搅拌边超声，搅拌速度200r/min，得到混合体系A。其中，氧化石墨的孔隙率为90％、比表面积为2800m²/g、厚度为15nm，混合体系A中，紫杉醇含量30wt％、丙酮含量60wt％、氧化石墨烯含量10wt％。

2.2)准备一定量的纯净水，加温至60～70℃，然后向其中加入硬脂酸(纯净水和硬脂酸的质量比为6:4)，进行搅拌，搅拌时间60min，搅拌速度500r/min，搅拌过程中温度维持在58～61℃，得到混合体系B。

2.3)将混合体系A缓缓倒入混合体系B中，继续以400r/min的速度搅拌，搅拌温度控制在60～65℃，搅拌时间20min，然后加入步骤1)制备的磁性镁合金纳米颗粒，继续以400r/min的速度搅拌15min，接着将混合体系的温度降至55～59℃，加入叶酸和吐温80，继续以150r/min的速度搅拌30min，搅拌结束后，混合体系的温度降至35～45℃。其中，混合体系A、混合体系B、叶酸和吐温80的用量比为5(mL)：3(mL)：1(g)：1(mL)，磁性镁合金纳米颗粒的用量为混合体系A和混合体系B总质量的30wt％。

2.4)将步骤2.3)制备的混合液快速滴入液冷介质(掺加有防冻剂的冰水，温度为-10℃)中，滴入速度为13mL/min，然后继续搅拌挥去有机溶剂，即得混悬液。其中，搅拌速率为200r/min，搅拌时间30min，搅拌过程中体系温度控制在5℃左右。

2.5)将步骤2.4)制备的混悬液置于离心管中，9000r/min，离心15min，得到具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。

采用透射电子显微镜(JEM-100SX透射电镜，日本JEOL公司)对制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人进行观察，结果显示：本实施例制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人大部分呈现圆整、均匀的球形微粒，无粘连，直径为150～200nm。

实施例2

1)磁性镁合金纳米颗粒的制备：

1.1)磁性镁合金在750℃下进行7.5h的固溶处理，得到磁性镁合金熔液。其中，所述磁性镁合金的化学成分为：Nd 3wt％，Zr 15wt％，Fe 3wt％，SiO₂10wt％，Mn 3wt％、余量的Mg。

1.2)将1mL磁性镁合金熔液滴加到70mL液氮中，滴加速率控制在0.5mL/min；滴加完毕后，静置5～10min，然后将体系温度加热至30℃，液氮在加热过程中气化挥发，得到干燥的磁性镁合金纳米颗粒，颗粒直径为80～100nm。

2)具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人的制备：

2.1)将紫杉醇溶于丙酮中，搅拌10～15min至完全溶解，然后再加入氧化石墨烯，边搅拌边超声，搅拌速度200r/min，得到混合体系A。其中，氧化石墨的孔隙率为85％、比表面积为2500m²/g、厚度为10nm，混合体系A中，紫杉醇含量30wt％、丙酮含量60wt％、氧化石墨烯含量10wt％。

2.2)准备一定量的纯净水，加温至60～70℃，然后向其中加入硬脂酸(纯净水和硬脂酸的质量比为6:4)，进行搅拌，搅拌时间60min，搅拌速度500r/min，搅拌过程中温度维持在58～61℃，得到混合体系B。

2.3)将混合体系A缓缓倒入混合体系B中，继续以400r/min的速度搅拌，搅拌温度控制在60～65℃，搅拌时间20min，然后加入步骤1)制备的磁性镁合金纳米颗粒，继续以400r/min的速度搅拌15min，接着将混合体系的温度降至55～59℃，加入叶酸和吐温80，继续以150r/min的速度搅拌30min，搅拌结束后，混合体系的温度降至35～45℃。其中，混合体系A、混合体系B、叶酸和吐温80的用量比为5(mL)：3(mL)：1(g)：1(mL)，磁性镁合金纳米颗粒的用量为混合体系A和混合体系B总质量的25wt％。

2.4)将步骤2.3)制备的混合液快速滴入液冷介质(掺加有防冻剂的冰水，温度为-10℃)中，滴入速度为10mL/min，然后继续搅拌挥去有机溶剂，即得混悬液。其中，搅拌速率为200r/min，搅拌时间30min，搅拌过程中体系温度控制在5℃左右。

2.5)将步骤2.4)制备的混悬液置于离心管中，9000r/min，离心15min，得到具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。

采用透射电子显微镜(JEM-100SX透射电镜，日本JEOL公司)对制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人进行观察，结果显示：本实施例制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人大部分呈现圆整、均匀的球形微粒，无粘连，直径为150～200nm。

实施例3

1)磁性镁合金纳米颗粒的制备：

1.1)磁性镁合金在750℃下进行7.5h的固溶处理，得到磁性镁合金熔液。其中，所述磁性镁合金的化学成分为：Nd 5wt％，Zr 20wt％，Fe 5wt％，SiO₂15wt％，Mn 5wt％、余量的Mg。

1.2)将1mL磁性镁合金熔液滴加到70mL液氮中，滴加速率控制在1mL/min；滴加完毕后，静置5～10min，然后将体系温度加热至30℃，液氮在加热过程中气化挥发，得到干燥的磁性镁合金纳米颗粒，颗粒直径为80～100nm。

2)具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人的制备：

2.1)将紫杉醇溶于丙酮中，搅拌10～15min至完全溶解，然后再加入氧化石墨烯，边搅拌边超声，搅拌速度200r/min，得到混合体系A。其中，氧化石墨的孔隙率为95％、比表面积为3000m²/g、厚度为25nm，混合体系A中，紫杉醇含量30wt％、丙酮含量60wt％、氧化石墨烯含量10wt％。

2.2)准备一定量的纯净水，加温至60～70℃，然后向其中加入硬脂酸(纯净水和硬脂酸的质量比为6:4)，进行搅拌，搅拌时间60min，搅拌速度500r/min，搅拌过程中温度维持在58～61℃，得到混合体系B。

2.3)将混合体系A缓缓倒入混合体系B中，继续以400r/min的速度搅拌，搅拌温度控制在60～65℃，搅拌时间20min，然后加入步骤1)制备的磁性镁合金纳米颗粒，继续以400r/min的速度搅拌15min，接着将混合体系的温度降至55～59℃，加入叶酸和吐温80，继续以150r/min的速度搅拌30min，搅拌结束后，混合体系的温度降至35～45℃。其中，混合体系A、混合体系B、叶酸和吐温80的用量比为5(mL)：3(mL)：1(g)：1(mL)，磁性镁合金纳米颗粒的用量为混合体系A和混合体系B总质量的35wt％。

2.4)将步骤2.3)制备的混合液快速滴入液冷介质(掺加有防冻剂的冰水，温度为-10℃)中，滴入速度为15mL/min，然后继续搅拌挥去有机溶剂，即得混悬液。其中，搅拌速率为200r/min，搅拌时间30min，搅拌过程中体系温度控制在5℃左右。

2.5)将步骤2.4)制备的混悬液置于离心管中，9000r/min，离心15min，得到具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人。

采用透射电子显微镜(JEM-100SX透射电镜，日本JEOL公司)对制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人进行观察，结果显示：本实施例制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人大部分呈现圆整、均匀的球形微粒，无粘连，直径为150～200nm。

效果评价

将1mg上述实施例制备的具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人稀到盐水中，然后注射到患者肿瘤区域，通过叶酸对肿瘤具有的高度选择性或外部磁控系统将具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人完全覆盖肿瘤区域(纳米机器人范围超肿瘤范围5mm以上定义为完全覆盖)，最后通CT等影像识别具有抗肿瘤功能的载药纳米机器人在体内生物相溶性和降解情况，结果如表1所示：

表1不同测试样品的生物相溶性与降解情况

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。