具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种可注射钙离子响应型光热水凝胶，包括：带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料与海藻酸钠。

其中，所述带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料优选为UCNP-Au；所述海藻酸钠优选为食品级海藻酸钠和/或医用级海藻酸钠；所述海藻酸钠的G/M比优选为1/2～2/1；所述海藻酸钠的粘度优选为100～300cps，更优选为200cps；所述带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料与海藻酸钠的质量比优选为1：(5～20)，更优选为1：(5～15)，再优选为1：(8～12)，最优选为1：10。

本发明提供的可注射钙离子响应型光热水凝胶中带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料的浓度优选为0.1～0.5wt％，更优选为0.2～0.4wt％，再优选为0.2～0.3wt％，最优选为0.2wt％；所述可注射钙离子响应型光热水凝胶中海藻酸钠的浓度优选为1～5wt％，更优选为2～4wt％，再优选为2～3wt％，最优选为2wt％。

本发明提供的可注射钙离子响应型光热水凝胶其光热转换性能由稀土-金杂化纳米材料(UCNP-Au)提供；凝胶骨架由海藻酸盐提供。该水凝胶在使用前其可保持注射性，利用体内生理或病理条件下于注射部位所包含的钙离子，形成二次交联，从而获得稀土-海藻酸钙基光热水凝胶，其中二次交联点由钙离子与海藻多糖链配位形成。

本发明选用带负电的海藻酸钠与带正电的稀土上转换-金杂化纳米材料制备可注射的光热水凝胶，通过瘤旁注射的方式，将其均匀注射到瘤体的周围，利用体内细胞外液的钙离子，原位诱导形成稀土-海藻酸钙基光热水凝胶，不但提高了其生物相容性，还降低了光敏剂的降解速率，从而实现了高效、可重复的光热治疗，进而完全杀灭肿瘤；同时该水凝胶还可以有效的阻隔热量在其内部的传递，不但保证了热量在肿瘤位置的积聚，同时对周围的正常组织进行保护，从而减少不必要的热损伤；再者将该水凝胶注射到骨缺损部位，利用溶骨产生的高钙离子环境快速形成高韧性稀土-海藻酸钙基水凝胶，对骨缺损进行填充，对受损骨质提供支撑，从而避免了病理性骨折、假关节等并发症，同时由其提供的生长空间，为成骨细胞的增殖提供了完美的保护，实现了骨的自修复，从而加速了骨缺损的自愈合，相比传统的外科植入，本方法简单有效。

本发明还提供一种可注射钙离子响应型光热水凝胶的制备方法，包括：将海藻酸钠溶于水中，得到海藻酸钠水溶液；将海藻酸钠水溶液与带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料混合，得到可注射钙离子响应型光热水凝胶。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

在本发明中，所述带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料优选按照以下方法制备：制备UCNP纳米颗粒；将UCNP纳米颗粒表面油酸配体质子化，随即与聚乙烯亚胺(PEI)混合，而后洗涤得到[email protected]；将[email protected]和金前驱体溶液混合，在pH值为7的条件下，加热，得到UCNP-金杂化纳米颗粒。

参见图1，图1为本发明提供的带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料的制备流程示意图。

其中UCNP纳米颗粒优选为壳核型UCNP纳米颗粒；按照本领域技术人员熟知的方法制备即可，并无特殊的限制的限制，本发明中优选为：将钆前驱体、镱前驱体、铒前驱体、油酸与十八烯混合，在保护气氛中加热，得到第一混合液；将氟化铵与氢氧化钠溶于甲醇后，与第一混合液混合，加热搅拌，除去溶剂后，在保护气氛中高温加热，得到UCNP纳米颗粒内核；将钆前驱体、钕前驱体、镱前驱体、油酸与十八烯混合，在保护气氛中加热，得到第二混合液；将氟化铵与氢氧化钠溶于甲醇后，与第二混合物及UCNP纳米颗粒内核混合，加热搅拌，除去溶剂后，在保护气氛中高温加热，得到壳核型UCNP纳米颗粒。

将钆前驱体、镱前驱体、铒前驱体、油酸与十八烯混合，在保护气氛中加热，得到第一混合液；所述钆前驱体优选为氯化钆；所述镱前驱体优选为氯化镱；所述铒前驱体优选为氯化铒；所述钆前驱体、镱前驱体与铒前驱体的质量比优选为(30～45)：(5～15):1，更优选为(35～40)：(8～12):1，再优选为37.6：10.2:1；所述油酸与十八烯的体积比优选为1：(2～5)，更优选为1：(2～4)，再优选为1：3；所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气；所述加热的温度优选为140℃～180℃，更优选为160℃；所述加热的温度优选为30～60min，更优选为40～50min，再优选为40min；加热后优选降至50℃，得到第一混合液。

将将氟化铵与氢氧化钠溶于甲醇后，与第一混合液混合，加热搅拌，除去溶剂后，在保护气氛中高温加热，得到UCNP纳米颗粒内核；所述氟化铵与氢氧化钠的质量比优选为(1～2)：1，更优选为(1.3～1.6)：1，再优选为(1.4～1.5)：1，最优选为1.49：1；所述氢氧化钠与甲醇的比例优选为(5～15)mg：1ml，更优选为(8～12)mg：1ml，再优选为10mg：1ml；所述钆前驱体与氟化铵的质量比优选为(1～1.5)：1，更优选为(1.2～1.4)：1，再优选为1.38：1；所述加热搅拌的温度优选为45℃～55℃，更优选为50℃；所述加热搅拌的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气；所述高温加热的温度优选为250℃～350℃，更优选为280℃～320℃，再优选为300℃；所述高温加热的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h；高温加热后优选降至室温，然后洗涤，得到UCNP纳米颗粒内核；所述洗涤优选采用乙醇与环己烷溶液交替进行。

将钆前驱体、钕前驱体、镱前驱体、油酸与十八烯混合，在保护气氛中加热，得到第二混合液；所述钆前驱体、钕前驱体与镱前驱体的质量比优选为(3～4)：1：(1～1.5)，更优选为(3～3.5)：1：(1～1.3)，再优选为3.16：1：1.115；所述钆前驱体、钕前驱体与镱前驱体优选为各自的氯化物；所述油酸与十八烯的体积比优选为1：(2～5)，更优选为1：(2～4)，再优选为1：3；所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气；所述加热的温度优选为140℃～180℃，更优选为160℃；所述加热的温度优选为30～60min，更优选为40～50min，再优选为40min；加热后优选降至50℃，得到第二混合液。

将氟化铵与氢氧化钠溶于甲醇后，与第二混合物及UCNP纳米颗粒内核混合，加热搅拌，除去溶剂后，在保护气氛中高温加热，得到壳核型UCNP纳米颗粒；所述氟化铵与氢氧化钠的质量比优选为(1～2)：1，更优选为(1.3～1.6)：1，再优选为(1.4～1.5)：1，最优选为1.49：1；所述氢氧化钠与甲醇的比例优选为(5～15)mg：1ml，更优选为(8～12)mg：1ml，再优选为10mg：1ml；所述钆前驱体与氟化铵的质量比优选为(1～1.5)：1，更优选为(1～1.3)：1，再优选为1.06：1；所述加热搅拌的温度优选为45℃～55℃，更优选为50℃；此步骤中钆前驱体与UCNP纳米颗粒内核制备时钆前驱体的质量比优选为1：(1～1.5)，更优选为1：(1.1～1.4)，再优选为1：(1.2～1.3)；所述加热搅拌的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气；所述高温加热的温度优选为250℃～350℃，更优选为280℃～320℃，再优选为300℃；所述高温加热的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h；高温加热后优选降至室温，然后洗涤，得到壳核型UCNP纳米颗粒；所述洗涤优选采用乙醇与环己烷溶液交替进行。

将UCNP纳米颗粒表面油酸配体质子化，随即与聚乙烯亚胺(PEI)混合，而后洗涤得到[email protected]；在本发明中，优选将UCNP纳米颗粒、盐酸与有机溶剂混合，超声振荡，从而将UCNP纳米颗粒表面油酸配体质子化；所述有机溶剂优选为乙醇与环己烷；所述乙醇与环己烷的体积比优选为(8～12)：1，更优选为10：1；所述超声振荡的时间优选为20～40min，更优选为30min；超声振荡后优选经水与乙醇洗涤后，分散再在水中，然后与聚乙烯亚胺(PEI)混合；所述聚乙烯亚胺的重均分子量优选为1000～3000，更优选为1500～2500，再优选为1500～2000，最优选为1800；所述混合的时间优选为6～12h；混合后优选经水与乙醇洗涤后，得到[email protected]。

将[email protected]和金前驱体溶液混合，在pH值为7的条件下，加热，得到UCNP-金纳米颗粒；此步骤中通过氧化还原在其表面原位生长超小纳米尺寸的贵金属纳米颗粒，从而得到UCNP-金纳米颗粒；所述金前驱体优选为氯金酸；所述加热的温度优选为60℃～80℃，更优选为70℃；所述加热的时间优选为3～8min，更优选为4～5min。

本发明通过表面活性剂PEI作为UCNP与Au的连接桥梁，相比较于常用的二氧化硅，缩短了UCNP与Au的距离，增强了光传播效率，进一步提升了光热转化能力。

将海藻酸钠溶于水中，得到海藻酸钠水溶液；所述海藻酸钠同上所述，在此不再赘述；所述水优选为去离子水；所述海藻酸钠水溶液的浓度优选为3～5wt％，更优选为3～4wt％。

将海藻酸钠水溶液与带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料混合，得到可注射钙离子响应型光热水凝胶；所述带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料优选以其水溶液的形式与海藻酸钠水溶液混合；所述带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料水溶液的浓度优选为0.5～1wt％，更优选为0.6～0.8wt％。海藻酸钠带负电荷，其与带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料可在水溶液中通过二者间静电作用实现初步交联，从而得到可注射钙离子响应型光热水凝胶。

本发明利用天然的生物大分子构建具备光热性能的水凝胶材料，相比较于传统的无机、有机光热材料，生物大分子作为纳米材料的支架，通过增加单位体积光热纳米粒子的浓度及材料整体的生物相容性，可提升光热水凝胶的肿瘤治疗效果。

本发明利用生物体内细胞外液的钙离子环境或溶骨产生的高钙离子环境，实现原位钙离子诱导的高韧性海藻酸钙基水凝胶，并且还可通过调整海藻酸钠的G/M比、粘度、质量分数可以实现多机械性能的凝胶材料。

本发明还提供了一种上述可注射钙离子响应型光热水凝胶在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

在本发明中，所述肿瘤优选为伴有溶骨性破坏的原发性或转移性骨肿瘤。将可注射钙离子响应型光热水凝胶注射到骨转移瘤部位，利用溶骨产生的高钙离子环境，进一步交联，形成具有一定力学强度的水凝胶。

所述药物优选为光敏剂；所述光优选为808nm；所述药物的剂型优选为注射剂。

即为本发明的上述可注射钙离子响应型光热水凝胶利用808nm激光照射产生的热(在低功率激光照射下三分钟内温度高达70～90℃，比普通无机、有机光热材料温度提高20～40度)。将凝胶注入生物体内与钙离子形成二次交联后，获得的水凝胶拥有稳定的光热转换效率；并且在注射一周后，仍能通过808nm激光照射3分钟达到55℃，从而有效溶解细胞膜并使蛋白变性，致使肿瘤细胞直接死亡或凋亡。

本发明通过将所述可注射钙离子响应型光热水凝胶经瘤旁原位注射，结合近红外光可实现光热诱导肿瘤杀伤，以及对溶骨的修复、支撑与保护。

本发明提供的光热水凝胶由于具备可注射性，可通过操作更简便的肿瘤原位治疗手段。相比较于常规药物治疗，不但确保了有效的药物浓度，还减少了治疗过程中药物对正常组织的毒副作用。

本发明通过海藻酸钠分子与带有正电荷的稀土上转换-金杂化纳米材料在物理静电力作用下，形成了具备可注射性、高效光热治疗效果及生物相容性的水凝胶材料。相比较于传统的无机光热材料，光热效率可达到36.7％。并且通过瘤旁注射的方式将其均匀分散在肿瘤的周围，利用生物体内的钙离子环境(生理条件下存在的钙离子或溶骨产生的高钙离子)，进一步形成稀土-海藻酸钙基水凝胶。经过这一改变，不但可以提高凝胶的生物相容性还可以减缓纳米粒子在体内的降解，从而实现单次给药后多次照射，从而有效的杀灭肿瘤，减少肿瘤复发。再者，本发明还通过选择高G/M比的海藻酸钠，提高凝胶的机械强度，于骨破损部位原位形成高韧性水凝胶，从而对受损的骨组织提供足够的力学支持，从而避免了骨破损在应力作用下出现的病理性骨折以及假关节等并发症；同时还可利用凝胶提供的稳定空间，成骨细胞大量增殖，实现骨的自修复加速了骨破损的自愈合。本方法兼顾了原发性骨肿瘤或转移瘤的光热治疗以及对骨破损的支撑与修复，与现有临床中肿瘤非手术治疗手段相比，本发明在治疗过程中操作简单快捷，疗效显著。

本发明放眼于骨相关肿瘤的光热治疗与骨相关并发症的治疗，与其他同类型光热材料相比，不但拥有较高的光热转换效率，对骨性结构的力学支持作用，更是其他光热材料所不具备的。这种一举两得的治疗策略将为临床骨相关恶性肿瘤非手术治疗提供新的思路。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种可注射钙离子响应型光热水凝胶、其制备方法及应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

1.1合成带有大量正电荷的UCNP-Au纳米颗粒：

第一步：通过高温油溶剂法，制备壳核型六方相-稀土掺杂荧光上转换纳米材料(βOA-UCNP)。

具体如下：取GdCl₃ 205.6mg，YbCl₃ 55.88mg，ErCl₃ 5.47mg加入到100mL圆底烧瓶中，后加入6ml油酸和18ml十八烯，持续搅拌。排空气体后，氮气保护下升温至160℃维持40min，后降至50℃。取149mg NH₄F和100mg NaOH溶于10mL甲醇中，超声混匀后，加入到上述溶液中，50℃搅拌2h。溶液升温至100℃将甲醇蒸除，氮气保护下加热至300℃，维持1h。降至室温，乙醇/环己烷溶液交替洗3次，最后分散在10mL环己烷中得到溶液A。

取GdCl₃ 158.2mg，YbCl₃ 55.88mg，NdCl₃ 50.1mg加入到100mL圆底烧瓶中，后加入6ml油酸和18ml十八烯，持续搅拌。排空气体后，氮气保护下升温至160℃维持40min，后降至50℃。取149mg NH₄F和100mg NaOH溶于10mL甲醇中，超声混匀后，加入到上述溶液中，随后加入10mL溶液A，于50℃下共同搅拌2h。溶液升温至100℃将甲醇、环己烷蒸除，氮气保护下加热至300℃，维持1h。降至室温，乙醇/环己烷溶液交替洗3次，最后获得的上转换纳米颗粒(UCNPs)分散在10mL环己烷中。

第二步：通过配体交换，将表面油酸分子置换成聚乙烯亚胺(PEI)。具体如下：将10mL UCNPs环己烷溶液离心，向沉淀中加入10mL乙醇、10mL盐酸(1M)以及1mL环己烷，共同超声30min。经水、乙醇洗涤3次后，分散在10mL去离子水中。将100mg聚乙烯亚胺(Mw＝1800)溶于10mL去离子水中，随后加入到上述溶液中，搅拌过夜。最后产物经乙醇、水洗涤3次，所得[email protected]分散在10mL去离子水中备用。

第三步：随后通过氧化还原在其表面原位生长超小纳米尺寸的金纳米粒子，得到UCNP-Au。具体如下：将150mg氯金酸溶于5mL去离子水中，用0.1M NaOH溶液滴定至pH为7，随后滴入10mL [email protected]溶液，加热搅拌至70℃并维持5min。经水、乙醇洗涤3次后，获得UCNP-Au。

在本发明中，β相OA-UCNP由Gd、Yb、Nd、Er等稀土元素掺杂，利用Nd离子吸收808nm近红外激光，经Yb将能量传递给Er离子后，发射绿、红可见光。通过配体交换在UCNP表面包裹PEI后，由于带有高密度的氨基，因此保证了纳米材料在水溶液中带有正电荷。利用氧化还原作用，在[email protected]表面原位生长超小纳米尺寸的Au纳米粒子(≤2nm)，经透射电镜显示UCNP-Au的尺寸约36nm。UCNP-Au可均匀分散在水溶液中(水合粒径为221.5nm)。经电感耦合等离子体发射光谱仪测定每1mg UCNP-Au杂化材料中，含有Au 77.2μg。

2.制备稀土-海藻酸钠水凝胶

第一步：将带负电荷的海藻酸钠(G/M＝2/1，200cps)，超声分散在水溶液中，除气泡，静置过夜，得到3wt％海藻酸钠溶液A。

第二步：将UCNP-Au冻干、称重，配置0.6wt％水溶液B。

第三步：将A与B按体积比2：1混合，得到可注射钙离子响应型光热水凝胶(含2wt％海藻酸钠、0.2wt％UCNP-Au)。

3.可注射钙离子响应型光热水凝胶的应用

在本发明中，可注射稀土-海藻酸钠水凝胶用于转移性骨肿瘤的光热治疗，治疗温度保持在55℃以上。同时，通过原位UCNP-Au-Alg-Ca²⁺水凝胶的形成，对受损骨质提供了力学支持，确保其在自然愈合之前，在应力作用下不会发生病理性骨折。

实施例2

实施例2与实施例1操作方法相似，不同之处在于海藻酸钠中G/M比为1/2。

实施例3

实施例3与实施例1合成方法相同，为其光热治疗的延伸，可经单次注射后，多次实施近红外光照射，从而实现最大限度的杀灭肿瘤。

将实施例1与实施例2中得到的可注射钙离子响应型光热水凝胶在体外经2mMCaCl₂溶液诱导12小时，对其性能进行测试。

得到其实施例1、2中可注射钙离子响应型光热水凝胶体外经钙离子二次交联后获得的稀土-海藻酸钙基水凝胶的压缩测试结果图，如图2所示(图2A与图2B中左边柱形为稀土-海藻酸钙水凝胶(G/M＝2/1)，右边柱形为稀土-海藻酸钙水凝胶(G/M＝1/2))。由图2可知，通过对比当海藻酸钠的G/M比为2/1时，拥有更强的断裂强度以及相对较小的形变量，更为适合用于骨缺损的力学填充。

得到实施例1、2中可注射钙离子响应型光热水凝胶体外经钙离子二次交联后获得的稀土-海藻酸钙基水凝胶的拉伸测试结果图，如图3所示(图3A与图3B中左边柱形为稀土-海藻酸钙水凝胶(G/M＝2/1)，右边柱形为稀土-海藻酸钙水凝胶(G/M＝1/2))。同样证实，当海藻酸钠的G/M比为2/1时，拥有更强的断裂强度以及相对较小的形变量。

将实施例1中得到的可注射钙离子响应型光热水凝胶在体外经2mM CaCl₂溶液诱导12小时，充分完成交联后对其进行测试。测试样品呈原片状(高1mm，直径8mm)，经ModelDHR-2(TA Instruments，美国)流变仪测得其剪切流变结果图，如图4所示。由图4可知，在所有剪切频率下，储存模量(G’)始终接近但大于损耗模量(G”)充分的证明了其水凝胶的特性。

对实施例1中得到的可注射钙离子响应型光热水凝胶的光转换性能进行测试。首先将200μL UCNP-Au-Alg水凝胶置于小EP管中，将激光光源置于其上方2cm进行照射(1W/cm²)，3分钟后停止照射。整个过程采用FLIR A×5红外热感照相机对温度进行观测，记录最高温度变化。依据公式：

t＝-τs Lnθ；

θ＝(T-T_surr)/(T_max,NPs-T_surr)；

hS＝m_dC_d/τs.

(m_d＝0.2g,C_d＝4.2J/g T_max,NPs＝84℃,T_max,solvent＝31.1℃,T_surr＝25.8℃；

A₈₀₈＝0.72,I＝1W/cm²)

计算得到其光热转换结果图，如图5所示。由图5可知，其光热转换效率为36.7％。

将实施例1中可注射钙离子响应型光热水凝胶在体外经钙离子二次交联后，测试其光热转换效果，得到结果图如图6所示。由图6可以看出在单位时间内其上可上升至更高的温度，但由于水分子在凝胶骨架中被限定，因此发热非常局限，从而避免了体内应用时对临近非照射部位的损伤。

图7为实施例1、3小鼠荷瘤(人膀胱癌)实验。将100μL可注射钙离子响应型光热水凝胶(海藻酸盐2w％，UCNP-Au 0.2w％)瘤旁注射到BABL/c裸鼠中，随后接受单次(实施例1)或两次(实施例3)激光照射(808nm 激光，1.0W·cm^-2，持续3分钟)后所采集的图片。可以看出肿瘤在治疗后瘤体逐渐萎缩。在实施例3中，肿瘤最终完全消失。

图8为实施例1、3小鼠荷瘤(人膀胱癌)实验后主要器官的H&E染色结果，可以看出光热水凝胶未对小鼠主要器官造成明显损伤。

图9为原位钙离子诱导稀土-海藻酸钙水凝胶对骨缺损的填充的模式图及为期2周观察期后的辅助检查图像。如图A所示，我们人为在SD大鼠的双侧胫骨中段制造了面积为4mm²的贯穿性骨缺损。随后于左侧缺损中注入50 μL的实施例1中的UCNP-Au-Alg水凝胶，右侧缺损注入同体积的PBS作为对照。结合图B-E中的结果，可以基本明确，由于UCNP-Au-Alg-Ca²⁺水凝胶对骨结构的力学支撑，从而确保了成骨细胞的增殖，避免了病理性骨折、假关节的发生。