抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用 (Anti-rice fertility developmental protein OsP31 polyclonal antibody and preparation method and application thereof ) 是由 纪剑辉 周颖君 高清松 刘廷武 罗玉明 李正鹏 于 2021-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用,属于分子生物技术领域及免疫学领域。本发明包括：(1)分析预测水稻OsP31蛋白抗原性,选择多肽蛋白序列作为免疫抗原；(2)构建含有抗原的表达载体；(3)利用所述表达载体转化大肠杆菌；(4)表达并纯化所述多肽；(4)使用所述多肽或含有所述多肽的组合物免疫哺乳动物；(5)从所述哺乳动物血清中纯化抗体,即得抗水稻育性发育蛋白OsP31抗体。本发明所提供特异性抗体,能够通过免疫荧光染色技术特异性识别水稻中育性发育蛋白OsP31,能够检测及区分水稻减数分裂、雄配子发育等过程中的相关突变体,亲和力强、特异性好,具备工业化生产的可能性。(The invention provides a polyclonal antibody against rice fertility developmental protein OsP31, a preparation method and application thereof, belonging to the field of molecular biotechnology and the field of immunology. The invention comprises the following steps: (1) analyzing and predicting the antigenicity of OsP31 protein of rice, and selecting a polypeptide protein sequence as an immune antigen; (2) constructing an expression vector containing the antigen; (3) transforming escherichia coli by using the expression vector; (4) expressing and purifying the polypeptide; (4) immunizing a mammal with said polypeptide or a composition comprising said polypeptide; (5) purifying the antibody from the serum of the mammal to obtain the anti-rice fertility development protein OsP31 antibody. The specific antibody provided by the invention can specifically identify the fertility development protein OsP31 in rice through an immunofluorescence staining technology, can detect and distinguish related mutants in the processes of rice meiosis, male gamete development and the like, has strong affinity and good specificity, and has the possibility of industrial production.)
技术领域
本发明属于分子生物技术领域及免疫学领域，更具体地说，涉及抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
减数分裂是所有有性生殖生物中一种高度保守细胞分裂过程。减数分裂整个过程包括一次DNA复制和连续两次细胞核的分裂，细胞学上可以定义为减数分裂I和II。在减数分裂前期I，同源染色体配对、联会和重组，随后在后期I发生分离，在末期I的时候两个姐妹染色单体被拉向两极。同源重组对于遗传多样性的保持是必不可少的，同时也是同源染色体正常分离的先决条件。
联会复合体是减数分裂前期I的标志性结构，其正确形成及解离是同源染色体配对、联会、重组及分离等的必要保障。从结构上分析，联会复合体为一拉链样结构。拉链的轴形成于减数分裂细线期，联会后成为联会复合体拉链的两条平行骨架，因此染色体轴也通常被称为联会复合体侧向元件，其蛋白通常被称为侧向元件蛋白。联会复合体的装配从减数分裂前期I开始，并从偶线期开始组装，粗线期趋于成熟并发挥功能，到双线期开始解体。植物中研究表明，从偶线期到粗线期，组成侧向元件的同源染色体被横向纤维蛋白紧密的联系在一起，而中央元件蛋白则形成在中心位置；到了粗线期晚期，联会复合体将逐渐解体；到了双线期，联会复合体基本上已经完全解体了，而同源染色体则仍然被交叉结所维系在一起，这一过程对于同源染色体的正确分离是至关重要的。减数分裂的重要意义在于不仅使后代的染色体数目保持恒定，又通过同源重组使个体间的遗传物质在双亲染色体之间发生交换，从而维持了物种的遗传多样性并促进了物种的进化。对于动植物来说，减数分裂这一最基本特征给遗传改良带来了无限广阔的机遇。水稻OsP31就是一个在水稻花粉发育过程中起重要控制作用的关键基因(GeneID：4338221)，充分研究该基因将为在水稻雄性不育系的创新提供种质资源。
随着对育性机制研究的不断深入，在水稻减数分裂进程中相关蛋白的表达变化属于极其灵敏的指标，通过研究这些基因的多克隆抗体在细胞学水平上的分布和变化情况将有利于研究者和育种家进一步充分认识水稻育性发育的机理机制，而以往对于育性过程中的基因的研究局限于细胞学表型观察，花药形态分析以及基因表达变化研究等，这些研究仅能说明该蛋白功能上的变化，并不能充分反映相关特异性蛋白在其特异组织时空变化情况，也不能完整反映在整个减数分裂中的变化情况；此外，这些蛋白在细胞学水平上与其他减数分裂育性蛋白的关系也无法明确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗水稻育性蛋白OsP31多克隆抗体。本发明所要解决的另一技术问题在于提供制备所述抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的方法。本发明还要解决的最后一个技术问题在于提供所述抗水稻育性蛋白OsP31多克隆抗体的具体应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种水稻OsP31蛋白的免疫抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
含有所述免疫抗原的免疫组合物。
含有编码所述多肽的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系。
一种抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的制备方法，使用氨基酸序列如SEQID NO.15所示的水稻OsP31蛋白的免疫抗原或其组合物免疫哺乳动物。
进一步地，所述方法具体包括：
(1)构建含有所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原的重组表达载体；
(2)使用重组表达载体制备重组微生物或重组细胞系；
(3)表达并纯化所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原；
(4)使用所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原或含有所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原的组合物免疫，免疫动物为兔、小鼠、大鼠、山羊等中的一种；
(5)从所述哺乳动物血清中纯化抗体，即得抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体。
进一步地，所述重组微生物是大肠杆菌。
任一所述的抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的制备方法制备得到的抗体。
所述的抗体能应用于基于抗原抗体反应监测目的蛋白在植物细胞中定位或分布规律中的应用，尤其是应用于免疫荧光染色实验。
进一步地，所述的植物为水稻、玉米、油菜、小麦或大豆。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1)本发明制备的抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与水稻OsP31蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。
2)本发明制备的抗体，是从多个候选多克隆抗体中挑选出来，能够进行免疫荧光组化分析的特异性抗体，可对水稻不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行精确分析，可以在一切与水稻育性发育相关的机理机制研究中应用，为水稻OsP31蛋白的功能和作用机理的研究提供检测与验证技术支持。例如可通过免疫组化、免疫印迹等方法观察水稻及其它植物中育性蛋白OsP31的细胞定位，揭示调控植物减数分裂和育性控制的机制，阐明植物花发育与植物有性生殖的内在联系，从而利用育性调控机制为植物遗传改良奠定理论和技术基础。
3)本发明所制备抗体是一种特异性识别抗原的功能性蛋白。主要识别的是蛋白质的一级结构，也就是其具有抗原性的氨基酸序列。采用抗体来识别水稻OsP31蛋白，能准确的反应蛋白质的含量，而不会由于样本处理或保存条件不当，而引起结构变化导致无法检出。
附图说明
图1为根据表1设计的7个抗原所扩增产物在基因全长DNA上的位置示意图；
图2为利用引物组合SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所得的抗原7纯化后的OsP31原核表达蛋白SDS-PAGE鉴定电泳图，其中，1为蛋白Marker(KDa)；2为标准蛋白BSA；3和4为纯化的蛋白；箭头指示的条带为目标蛋白条带；
图3为抗原7所对应的多克隆抗体Western检测图，其中，1为蛋白Marker；2-4为野生型日本晴材料中OsP31抗体定位，5-6为突变体材料中OsP31抗体定位；
图4为抗原7免疫所得OsP31多克隆抗体在野生型花粉母细胞中与OsREC8蛋白的定位信号分析图，标尺长度为5μm；
图5为利用免疫荧光染色实验技术检测OsP31抗体(抗原7免疫所得多克隆抗体)在水稻不同突变体中的应用结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pMD19-T载体：北京华奥正生科技有限公司产品，其产品目录号为3271。
PET30载体：pET30a(美国Novagen公司，货号69909-3)。
BL21表达菌株：(北京全式金生物技术有限公司，货号CD601)。
水稻品种中籼3037：记载
“Wang，K.，Tang，D.，Hong，L.，Xu，W.，Huang，J.，Li，M.，Gu，M.，Xue，Y.and Cheng，Z.(2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice.Plos Genetics，6”一文中的“Zhongxian 3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻品种日本晴：中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A13071。
实施例1：
(1)蛋白结构特征的分析
根据分析氨基酸序列的亲水性、表露性和柔韧性等，分析预测水稻OsP31蛋白抗原性。根据多克隆抗体可识别多个抗原决定簇的原则，选择7个多肽蛋白序列来构建原核表达蛋白，作为免疫抗原，如图1所示。
(2)原核表达载体的构建
为了得到OsP31所对应的多克隆抗体，利用野生型水稻日本晴的cDNA，以7组引物分别进行扩增(引物序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，分别得到不同大小的扩增产物，相关引物序列和扩增产物大小见表1，随后将上述片段分别导入中间载体pMD19-T(simple)中，酶切和测序鉴定正确，随后将这些片段分别连接到pET30a(Novagen Cat.No69909-3)载体，载体用限制性内切酶BamHI-XhoI进行处理。
表1.设计的7个位置的多肽引物序列及其扩增片段大小
(3)原核蛋白的表达和纯化
将上述原核表达载体通过热击法转入大肠杆菌BL21感受态。挑单菌落接种到4mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜作为种子液。按照200倍稀释比例，将种子液接种到400mL新鲜的含卡那霉素的LB培养基中，待菌体OD值达到0.6，加入终浓度1mM的IPTG(异丙基-丙基G浓硫代吡喃半乳糖苷)，180rpm振荡培养12h，诱导表达，最终蛋白表达浓度介于1.2mM-1.6mM为适宜浓度，4℃离心15min收集菌体。菌体中加入菌体积1/10体积的PBS(内含1％的Triton-100)，混匀后进行超声波菌体破碎，处理40次，每次10秒并间隔10秒，超声时保持菌液低温状态。4℃，12000rpm离心15min，弃上清，再加入1/20体积的蛋白Loading Buffer缓冲液，由于形成的蛋白以包涵体的方式进行表达，因此将上述蛋白样品进行12％的SDS-PAGE胶电泳，图2是以抗原7为例的电泳结果图。KCl溶液染色后割取特异性重组蛋白条带，晾干后研磨成干粉。
(4)免疫动物
选择年龄在三个月左右、体重2kg以上的健康新西兰大白兔，以步骤(3)中制备的抗原免疫动物。具体步骤如下：
首先对每只兔子进行免疫前诱导，通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐剂，刺激局部免疫反应，一周后进行首次免疫。首次免疫前，经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)稀释至1mg/mL，分装后储存于-20℃。取500μL的1mg/mL抗原(即0.5mg)加入300μL PBS再次稀释，然后加入等体积的弗氏完全佐剂(首次免疫)或弗氏不完全佐剂(第二次至第四次免疫)。对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，首次免疫两周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次(共进行4次免疫)。第三次免疫12天后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者于第四次免疫11天后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜或者37℃温育3h，在4℃条件下，5000rpm离心10min，收集血清，分装后-80℃保存。
(5)抗体Western Blotting检测
选取水稻材料日本晴和OsP31基因突变体为实验材料，使用康为世纪公司的植物蛋白质提取试剂盒(货号：CW0885B)，分别提取总蛋白。具体步骤为：
选取水稻叶片组织大约100mg，放置在研钵中，加入抽提试剂0.5mL，进行匀浆处理；匀浆后冰上孵育20分钟后，利用低温高速冷冻离心机4℃12,000rpm，离心20分钟；收集上清中的可溶性蛋白，放置在4℃，待下一步实验。提取蛋白质，经SDS-PAGE电泳后，经半干转膜仪，转移至硝酸纤维素膜上，以5％的脱脂奶粉(TBST缓冲液溶解)在4℃条件下，封闭2h；加入纯化的多克隆抗体(1∶5000)，在4℃条件下，反应12h；加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG抗体(1∶2000)，在37℃条件下，反应1h。检测结果显示：上清中含有一条目的蛋白大小的条带由图可知，该蛋白为水稻OsP31抗体的特异抗原(图3)。检测结果显示，野生型水稻日本晴有一条单一清晰的杂交条带，而突变体中没有检测信号。结果证明：本发明所制备的多克隆抗体，能够识别植物体内的OsP31蛋白，且能够特异性地与OsP31蛋白结合。因此，该多克隆抗体，可以作为OsP31蛋白检测试剂，
(6)染色体免疫荧光染色实验观察蛋白在染色体上的定位
1)采集新鲜幼穗用4％多聚甲醛(w/v)室温固定30min；
2)挑取时期合适的小花，取出花药，用PBS缓冲液进行压片；
3)液氮浸泡20s，用刀片迅速揭去盖玻片晾干；
4)加50μL含有一抗抗体的TNB缓冲液，盖上封口膜，放入湿盒内于37℃保温1h；
5)PBS缓冲液洗涤三次，每次5min，晾干；
6)避光条件下加50μL含有TRITC偶联的羊抗兔二抗以及FITC偶联的羊抗鼠二抗的TNB缓冲液，盖上封口膜，放入湿盒内37℃保温30min；
7)避光条件下1×PBS缓冲液洗三次，每次5min，晾干；
8)避光条件下加10μLDAPI染色液，盖上盖玻片，压片，在荧光相差显微镜下观察拍照。
图4为OsP31蛋白所对应多克隆抗体在野生型花粉母细胞中与OsREC8蛋白的定位信号分析。OsP31抗体的免疫荧光定位结果在图4中显示，为显示染色体不同时期的形态特征，用Marker蛋白联合复合体侧向原件蛋白OsREC8进行标记；在细线期，OsP31以点状信号开始在细胞内出现(图4A)，在偶线期的时候，OsP31蛋白呈现不连续的线状信号分布(图4B)，从偶线期到早粗线期，这种线状信号逐渐增强，呈现为连续的线状信号，且其线状信号能够与OsREC8蛋白共定位(图4C)。从晚粗线期到早双线期，OsP31蛋白信号呈现逐渐衰退现象，最终只残留部分点状信号在细胞中(图4D)；图5为OsP31蛋白水稻不同类型突变体中的免疫荧光定位分析。OsREC8蛋白用来显示减数分裂时期染色体轴，该蛋白能够很好的标识细胞中染色体的位置(红色)，OsP31抗体荧光染色中用绿色信号显示，在zep1、crc1、OsP31等不同类型联会复合体突变体花粉母细胞中，OsP31抗体都不能正常定位(图5)。
从得到的7个不同多克隆抗体的染色体免疫荧光染色实验观察发现(图4-5)，抗原7所得到的多克隆抗体能够有效的检测，能够识别植物体内的OsP31蛋白，且能够特异性地与OsP31蛋白结合。因此，抗原7所得到的多克隆抗体，可以作为OsP31蛋白检测试剂，且对OsP31蛋白的功能鉴定具有重要的意义。抗原7的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，是一小段肽段，编码该抗原的核苷酸序列如SEQ NO.16所示，长度为537bp。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 淮阴师范学院
<120> 抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Val Ile Trp Phe Gln Cys Lys His Thr Ile Arg Gly Leu Pro Cys Lys
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atggagaggg ctaccacctc cggaggcggc ggcggcggca gccagccgcc gcggggggta 60
gggctgccgt tggtggaggt gcaggcggcg gcggcgtcgc tgcggcggtc ggaggtgttc 120
tacgtcgtga aggagctcct cggcttcgtc ctctacatgc accaccagat ccccgcggta 180
ttgcagaatc ttgaaaatga atttgcaagt 210
<210> 27
<211> 125
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 27
Arg Arg Arg Ile Lys Lys Gln Glu Lys Leu Met Asn Gly Leu Ser Ser
1 5 10 15
Val Phe Ser Ala Leu Gln Lys Ala Leu Asp Glu Val Pro Ser Ile Glu
20 25 30
Gly Val Leu Leu Ile Leu Gly Gly Ser Leu Val Arg Pro Leu Phe Val
35 40 45
Tyr Asp Ile Thr Ile Ser His Gly Arg Phe Asp Ala Gly Ser Ala Asn
50 55 60
Glu Arg Gly Ala Ser Lys Leu Ala Gln Ser Val Ser Arg Lys Ala Ile
65 70 75 80
Arg Ala Leu Ile Ser Ser Gly Ala Gly Ser Leu Ser Tyr Thr Gly Pro
85 90 95
Thr Lys Leu Phe Val Leu Val Arg Cys Pro Cys Thr Leu Asn Leu Pro
100 105 110
Leu Asp Phe Leu Pro Lys Arg Asp Phe Arg Tyr Ser Lys
115 120 125
<210> 28
<211> 375
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 28
agacggagga tcaagaagca ggagaagtta atgaatggcc tctccagcgt attttctgct 60
cttcagaaag cactcgatga agttcctagc attgaaggag ttctcctgat cctcggtggt 120
agccttgtca ggcctctgtt tgtctatgac attacaattt ctcatggtag atttgatgct 180
ggaagtgcca atgagcgtgg tgcaagcaaa ttagcgcagt ccgtttctcg aaaggccatt 240
cgtgctctta tatcaagtgg tgcagggagt ttatcttata caggccctac caagctgttt 300
gttctagtca gatgtccctg tacattgaac ttaccactgg acttcctgcc gaaacgtgat 360
tttcgttaca gcaaa 375
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