硫化氢供体的制药用途
阅读说明：本技术 硫化氢供体的制药用途 (Pharmaceutical use of hydrogen sulfide donor ) 是由 季勇 罗姗姗 周雪纯 孔垂玉 于 2021-01-26 设计创作，主要内容包括：硫化氢供体的制药用途,具体来说是硫化氢及其供体在制备治疗主动脉瘤和主动脉夹层药物中的应用。尤其涉及硫化氢供体硫氢化钠,DATS,L-半胱氨酸及其类似物,GYY4137,ADT-OH及其类似物,Gem-dithiol及其类似物在制备治疗主动脉瘤及主动脉夹层药物中的应用。本发明通过整体动物模型,明确了硫化氢及其供体能够降低主动脉瘤和主动脉夹层的发生率及死亡率,增加循环血中硫化氢含量,抑制主动脉瘤及主动脉夹层过程中炎症因子表达,并改善主动脉瘤及主动脉夹层过程中平滑肌细胞丢失。可作为治疗药物,用于改善主动脉瘤及主动脉夹层发生发展。(The application of hydrogen sulfide donor in preparing medicine for treating aortic aneurysm and aortic dissection is disclosed. In particular to the application of hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfide, DATS, L-cysteine and analogues thereof, GYY4137, ADT-OH and analogues thereof, and Gem-dithiol and analogues thereof in preparing medicaments for treating aortic aneurysm and aortic dissection. According to the invention, through an integral animal model, the hydrogen sulfide and the donor thereof are determined to be capable of reducing the incidence rate and the death rate of aortic aneurysm and aortic dissection, increasing the hydrogen sulfide content in circulating blood, inhibiting the expression of inflammatory factors in the aortic aneurysm and aortic dissection process and improving the loss of smooth muscle cells in the aortic aneurysm and aortic dissection process. Can be used as therapeutic medicine for improving aortic aneurysm and aortic dissection.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及硫化氢供体在制备治疗主动脉瘤和主动脉夹层药物中的应用。
背景技术
主动脉瘤(AoA)和主动脉夹层(AoD)是多种因素诱导的具有遗传倾向性潜在致命的血管疾病。主动脉瘤表现为主动脉的瘤样扩张,其定义为动脉扩张为正常动脉直径的1.5倍以上。主动脉夹层表现为主动脉壁内膜撕裂，循环中的血液通过内膜破口进入主动脉壁中层，导致中层大范围撕裂并形成夹层。80％以上AoA和AoD的患者病因是高血压。据统计在发达国家65-85岁的成年男性死亡率中，AoA和AoD占了1％-3％。AoA和AoD的病理机制目前还不清楚，除已知的遗传因素如FBN1突变引起的Marfan综合征，TGFBR2突变形成的Loeys-Dietz综合征等，血管组成细胞结构和功能的变化在AoA和AoD中也发挥重要的作用。主动脉夹层起病急，发病后致死率高，但目前主动脉瘤和主动脉夹层存在很高的漏诊和误诊率，且临床上没有特异性针对其治疗的药物。因此，寻找新的主动脉瘤及主动脉夹层诊断和治疗的手段极为重要。
主动脉瘤及主动脉夹层是多种细胞功能损伤共同作用的结果，已有研究发现血管中膜平滑肌细胞功能异常，如平滑肌细胞凋亡，基质粘附能力降低等参与AoA和AoD。此外，单核细胞活化及血管炎症反应增强也能够促进AoA和AoD的发生。而血管内皮细胞在血管收缩、形态和功能调控中发挥关键作用，提示内皮功能障碍可能同样促进AoA和AoD的发生。因此，能够综合改善平滑肌，炎症细胞核内皮功能的治疗，可能是治疗AoA和AoD的有效手段。
在心血管系统中H2S发挥多种生物学效应，包括舒张血管、调节血压、拮抗氧化应激、抑制平滑肌细胞增殖、保护线粒体及抗炎等，从而维持心血管正常功能。硫化氢作为第3种气体信号分子，能激活内皮细胞ATP敏感钾通道，舒张血管、抑制内皮细胞与白细胞间的黏附、直接和间接降低内皮细胞氧化应激状态，从而降低炎症水平，维持血管内皮细胞功能，减轻内皮细胞损伤后的血管重构。但是，在主动脉瘤和主动脉夹层发生过程中，硫化氢是否发生变化，是否参与主动脉瘤和主动脉夹层中炎症损伤和平滑肌丢失未见报道。此外，硫化氢供体对于主动脉瘤和主动脉夹层的发生发展是否具有治疗作用，目前仍没有相关研究。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种硫化氢供体的制药用途，具体涉及硫化氢供体在治疗主动脉瘤及主动脉夹层中的应用。
技术方案：硫化氢供体在制备治疗主动脉瘤和主动脉夹层药物中的应用。
本发明所述的硫化氢供体包括DATS,L-半胱氨酸及其类似物，GYY4137，ADT-OH及其类似物，Gem-dithiol及其类似物。
有益效果：申请人通过高效液相分析发现主动脉夹层病人血浆中硫化氢水平相较正常人下降。在动物模型中，利用皮下埋置血管紧张素II(AngII)微渗泵诱导小鼠主动脉瘤模型，同时给予硫氢化钠，DATS，L-半胱氨酸，GYY4137，ADT-OH及Gem-dithiol进行干预，发现硫化氢供体能够显著提高造模小鼠血浆硫化氢水平，降低IL-1β炎症因子水平，同时降低血管组织中ROS水平。此外，硫化氢供体能够显著改善AngII微渗泵引起的小鼠主动脉弹性纤维断裂，降低主动脉瘤及主动脉夹层的发生率，降低死亡率。表明硫化氢供体可作为治疗药物应用于主动脉瘤和主动脉夹层的治疗。
附图说明
图1为正常人和主动脉夹层病人的血浆中的H2S表达水平：提取正常人和主动脉夹层病人血浆后，用化学发光法检测H2S的表达。*P<0.05。
图2硫化氢供体恢复AngII微渗泵诱导的主动脉瘤小鼠血浆硫化氢水平。Apoe-/-小鼠皮下埋植Ang II渗透泵构建小鼠主动脉瘤模型，硫化氢供体进行干预治疗，于28天后检测血浆硫化氢水平。*P<0.05。
图3硫化氢供体降低AngII微渗泵诱导的主动脉瘤小鼠血管组织炎症因子表达。Apoe-/-小鼠皮下埋植Ang II渗透泵构建小鼠主动脉瘤模型，给予硫化氢供体进行干预治疗，于28天后处死，取小鼠主动脉血管组织提取RNA，检测IL-1β表达水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4硫化氢供体降低AngII微渗泵诱导的主动脉瘤小鼠血管组织氧化损伤。Apoe-/-小鼠皮下埋植Ang II渗透泵构建小鼠主动脉瘤模型，每天给予硫化氢供体进行干预治疗，于28天后处死，取小鼠主动脉血管组织OCT包埋后，行冰冻切片染色，之后通过DHE探针检测主动脉组织ROS水平。*P<0.05，**P<0.01。
图5硫化氢供体降低主动脉瘤发生率和小鼠死亡率。Apoe-/-小鼠皮下埋植Ang II渗透泵构建小鼠主动脉瘤模型，每天给予硫化氢供体进行干预治疗，于28天后处死，分离小鼠血管大体并拍照。同时计算主动脉瘤发生率和死亡率。A图为主动脉大体图片，其中主动脉瘤主要发生于腹主动脉；图B为发生率统计，硫化氢供体可显著降低主动脉瘤发生率；C图为生存率曲线，硫化氢供体可显著改善生存率。
图6硫化氢供体降低弹力纤维断裂。Apoe-/-小鼠皮下埋植Ang II渗透泵构建小鼠主动脉瘤模型，每天给予硫化氢供体进行干预治疗，于28天后处死，分离小鼠血管进行石蜡包埋并切片行HE染色，检测弹力纤维断裂情况。
具体实施方式
下面的实施例可使本领域技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
1.RNA提取及Q-PCR
总RNA的提取
(1)血管组织经冰PBS洗涤后，加入1mL的Trizol，吹打细胞并转移至无RNA酶的Eppendorf离心管中，冰上放置5min；
(2)加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上2-3分钟；
(3)12000rcf，4℃，15分钟；
(4)吸取上清400μL转移至新的Eppendorf离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，冰上10分钟；
(5)12000rcf，4℃，10分钟，弃上清；
(6)加入DEPC水稀释的75％乙醇，7500rcf，4℃，5分钟；
(7)取上清，室温干燥后加入20μL DEPC水溶解，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度；
(8)纯化的RNA样品置于-80℃保存。
逆转录
使用II SuperMix kit进行逆转录,反应总体积为20μL，具体组成如下所示：
反应在Bio-Rad半定量PCR仪上进行，具体反应条件如下：
95℃ 50秒
4℃ 5分钟
Real-time PCR
本实验采AceQ qPCR SYBR Green Master Mix对心肌成纤维细胞基因进行相对定量检测，PCR反应体系如下：
反应在Bio-Rad 480ΙΙ型定量PCR仪上进行，具体反应条件如下：
2.血浆H2S表达检测：
(1)收集血液样本，离心，4℃，3000rpm，10min，小心吸取上层清液(500μL左右)转移至新的EP管中。
(2)在缺氧室1％O2加入200mM冰的磺基水杨酸溶液密封，37℃孵育30min。
(3)涡旋，离心，4℃，12000rpm，5min，将100μL的上清液转移到装有200μL插入物的HPLC瓶中。
(4)通过高效液相色谱法检测H2S含量，乙腈和水梯度洗脱，加入0.08％乙酸。
3.血管活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平检测
(1)分离小鼠血管组织，OCT包埋后行冰冻切片。
(3)滴加含有2μmol/L二氢乙锭(DHE)的PBS，避光，37℃孵育30min，
(4)孵育结束后，PBS清洗组织切片。在倒置荧光显微镜下观察红色荧光并统计荧光强度。
所述的硫化氢供体结构：
4.动物主动脉夹层模型的建立及给药
选取8周龄的ApoE-/-小鼠麻醉后，在小鼠腹部皮下手术埋植Micro-osmotic pump2004(Alzet，USA)，实验组给予Ang II(200ng/kg/min)，Sham组给予生理盐水，治疗组每天每天腹腔注射硫氢化钠(100mg/kg/day)，DATS(50mg/kg/day)，GYY4137(50mg/kg/day)，L-半胱氨酸(300mg/kg/day)。或者隔天灌胃ADT-OH(40mg/kg)及Gem-dithiol(75mg/kg)。皮下埋置时间为28天。
5.主动脉血管HE染色
(1)将石蜡切片放入65℃烘箱烘烤30min。
(2)脱蜡：二甲苯5min，共3次。100％乙醇1min。95％乙醇1min。70％乙醇1min。
(3)蒸馏水浸洗，至玻片上不挂水珠，甩尽切片上水分，苏木素染色5min。
(4)自来水浸洗，除去切片上的浮色。
(5)1％盐酸乙醇1-3s。自来水洗涤数次。
(6)Scott液1min，自来水洗数次。甩尽水分，伊红染色，血管10s。
(7)蒸馏水洗涤数下，洗去切片上浮色。70％乙醇迅速浸洗一下。95％乙醇迅速浸洗一下。100％乙醇30s，共3次。
(8)二甲苯2min，共3次。二甲苯未干时用中性树胶封片。
实验结果
为了探索在正常人主动脉组织中和主动脉夹层病人的主动脉中硫化氢是否参与了主动脉的病变，收集主动脉夹层病人和正常人血浆，HPLC检测血浆中硫化氢水平。发现相比于正常人，主动脉夹层病人血浆中H2S的水平明显降低(图1)。
为了明确硫化氢及其供体在主动脉瘤及主动脉夹层中的作用，我们构建了主动脉瘤动物模型。在Apoe-/-小鼠上，对照组埋植生理盐水微渗泵；模型组埋植Ang II(1μg/min/kg)微渗泵；给药组埋植Ang II(1μg/min/kg)微渗泵的同时每天腹腔注射硫氢化钠(100mg/kg/day)，DATS(50mg/kg/day)，GYY4137(50mg/kg/day)，L-半胱氨酸(300mg/kg/day)。或者隔天灌胃ADT-OH(40mg/kg)及Gem-dithiol(75mg/kg)。4周后收集小鼠血浆检测硫化氢水平(图2)，并提取小鼠主动脉血管组织，分离RNA检测炎症因子水平(图3)，进行冰冻切片观察血管氧化损伤(图4)，观察血管大体形态并计算主动脉瘤发生率和死亡率(图5)，并进行石蜡切片HE染色观察弹力纤维断裂情况(图6)。结果显示，给予H2S供体可有效减少主动脉瘤的形成。以上实验结果可以进一步证明：H2S能够有效抑制主动脉瘤及主动脉夹层的发生。
以上的实验结果充分证明，硫化氢参与主动脉瘤及主动脉夹层的进程。通过外源性给予硫化氢供体可以有效抑制主动脉瘤及主动脉夹层的发展。因此，我们认为硫化氢供体可以作为临床上治疗主动脉瘤及主动脉夹层的药物。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。