靶向dkk1基因的双链寡核苷酸、包含其的构建体以及含有其的脱发预防或毛发生长组合物
阅读说明：本技术 靶向dkk1基因的双链寡核苷酸、包含其的构建体以及含有其的脱发预防或毛发生长组合物 (DKK1 gene-targeted double-stranded oligonucleotide, construct comprising same, and alopecia prevention or hair growth composition comprising same ) 是由 朴翰浯 尹成一 卞相轸 尹坪伍 李相圭 金泰琳 高映浩 孙承燮 高恩雅 金亨槇 于 2020-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及：一种双链寡核苷酸构建体,其具有这样的结构,其中亲水性物质和疏水性物质通过DKK1特异性双链寡核苷酸的两个末端处的简单共价键或接头介导的共价键缀合,以将所述双链寡核苷酸有效地递送到细胞中；一种纳米颗粒,其可以通过所述双链寡核苷酸构建体在水溶液中经由疏水相互作用进行自组装而产生；以及一种含有所述双链寡核苷酸构建体或所述纳米颗粒的预防脱发和促进毛发生长的组合物。一种双链寡核苷酸构建体,其包含DKK1特异性双链寡核苷酸；一种纳米颗粒；以及一种根据本发明的含有所述双链寡核苷酸构建体或所述纳米颗粒作为活性成分的脱发预防或毛发生长组合物高效地抑制DKK1的表达而没有副作用,并且对于预防脱发和促进毛发生长显著有效,因此可以非常有效地用于预防脱发和促进毛发生长的组合物。(The present invention relates to: a double-stranded oligonucleotide construct having a structure in which a hydrophilic substance and a hydrophobic substance are conjugated through a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond at both ends of a DKK 1-specific double-stranded oligonucleotide to efficiently deliver the double-stranded oligonucleotide into a cell; a nanoparticle that can be produced by self-assembly of the double-stranded oligonucleotide construct via hydrophobic interaction in an aqueous solution; and a composition for preventing hair loss and promoting hair growth comprising the double-stranded oligonucleotide construct or the nanoparticle. A double stranded oligonucleotide construct comprising a DKK1 specific double stranded oligonucleotide; a nanoparticle; and a composition for preventing hair loss or promoting hair growth according to the present invention, which contains the double-stranded oligonucleotide construct or the nanoparticle as an active ingredient, efficiently inhibits the expression of DKK1 without side effects, and is significantly effective for preventing hair loss and promoting hair growth, and thus can be very effectively used for preventing hair loss and promoting hair growth.)
技术领域
本发明涉及一种靶向DKK1基因的双链寡核苷酸、包含其的构建体、包含所述寡核苷酸或构建体的纳米颗粒及其用于预防脱发或促进毛发生长的用途，并且具体涉及一种DKK1特异性双链寡核苷酸；一种双链寡核苷酸构建体，其具有这样的结构，其中亲水性物质和疏水性物质通过简单的共价键或接头介导的共价键结合至所述双链寡核苷酸的两个末端，以有效地将所述寡核苷酸递送到细胞中；纳米颗粒，其可以通过所述双链寡核苷酸构建体在水溶液中经由疏水相互作用自组装而产生；以及含有所述寡核苷酸、构建体和/或纳米颗粒的用于预防脱发和促进毛发生长的组合物。
背景技术
头发在创造个人身份和形象方面起着重要作用，除了以上美学功能之外，头发还具有阻挡UV和保护头皮的功能。脱发(脱发症)是一种体毛异常减少的疾病，并且与生活没有直接关系，但往往伴随着关于外貌的严重心理困扰。因此，严重的脱发可能会对生活质量产生非常负面的影响(Passchier J.等人,Dermatology,197:217,1998；McDonagh,A.J和Messenger,A.G.,Dermatol Clin.,14:661,1996)。由于如工作压力、环境污染、暴露于有害环境和不健康的饮食习惯的外部因素，使得通常被认为是影响男性的遗传疾病的脱发症的发病率最近在女性和男性中均有所上升，因此对脱发症的预防或治疗剂的需求正在增加。脱发症分为瘢痕性脱发症，其中毛囊被破坏并恢复成纤维组织以使脱发永久化；和非瘢痕性脱发症，其中毛囊被保存而不转化为纤维组织。非瘢痕性脱发症包括休止期落发、遗传性雄激素性脱发症、斑秃和生殖器落发(Jand IW等人,J.KoreanMed.Ophthal.Otol.Dermatol.2015)。
毛发生长遵循一个周期，也称为“毛发周期”，包括生长阶段、退化阶段、休止阶段和外生阶段。生长阶段通常为2-8年，占整个毛发周期的约90％，并且毛母细胞在与毛囊乳头接触的毛球下部不断分裂，以产生毛发。退化阶段是毛发在生长阶段后停止生长一段时间的阶段。退化阶段是过渡到休止阶段的时期，这时毛发的产生和生长停止。由于发根的变化、毛发母细胞和色素细胞的失活以及由此角蛋白产生的失败，毛发生长停止。在休止阶段，毛球收缩。毛发仅在外生阶段开始脱落，已知这是由蛋白酶介导的(Kim Eun-Hwa等人,Journal of the Korean Society of Skin and Beauty,第5卷,第2期,45；Naito等人,Br.J.Dermatol.159:300-305,2008)。调节毛发生长的因素(如雄激素、雌激素、甲状腺激素、类固醇、催乳素和生长激素)被认为与毛发生长有关。其中，雄激素被认为是最有效的调节剂。表明激素参与脱发的最常见的例子是产后暂时性脱发。在怀孕期间，雌激素的量增加，因此毛发周期从生长阶段到休止阶段的进展受到抑制。分娩后，雌激素的量快速减少，并加速向休止阶段进展，从而导致休止阶段期间脱发。换句话说，脱发症取决于激素。然而，脱发的其他原因包括遗传因素、雄性激素、衰老、血液循环障碍、压力、超氧自由基等，并且对策可能因这些原因而异。DHT阻断剂被用作由雄性激素引起的脱发的治疗剂，并且这些阻断剂基于睾酮向高活性二氢睾酮(下文称为“DHT”)的转化被5-α-还原酶抑制的基本机制。同时，DHT能够与雄激素受体(AR)结合的强度超出睾酮的5倍，因此将可通过延迟毛囊中的蛋白质合成来阻止与雄激素受体结合以防止DHT过度产生的物质用作治疗剂(Dallob A.L.等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.79:703-709,1994；Ellsworth,K.和Harris G.,Biochem.Biophys.Res.Commun.215:774-780,1995；Kaufman K.D.,Mol.andCell.Endocrinology.198:85-59,2002)。
迄今为止开发的脱发治疗剂主要是单一化合物，其例子包括靶向5-α还原酶以抑制DHT的过度产生的非那雄胺、用于促进血液循环的米诺地尔、以及JAK抑制剂(鲁索利替尼、托法替尼)，它们最近已被美国FDA批准，作为抗癌药物出售，并已被发现具有促进毛发生长的作用。然而，以寻找比以上物质更有效的物质为目标的研究正在进行中。
Dickkopf 1(DKK1)是雄激素性脱发症中上调最多的脱发基因，并且其表达是在脱发部位处的真皮乳头细胞中由DHT诱导的，已知DHT是脱发的主要原因。已知当DKK1强烈表达时，它通过诱导直接包裹和保护毛发并将毛发运输到表皮的外根鞘的细胞凋亡来干扰毛囊的生长，并促进进展到毛发退化阶段(Kwack等人,J.Invest.Dermatol.132(6):1554-60.2012)。这是基于DKK1的Wnt拮抗作用，DKK1抑制Wnt/β信号传导所需的在维持毛发生长阶段方面起关键作用的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6共受体。自从发现DKK1极大地影响毛细胞从生长阶段到退化阶段的进展以来，增加了靶向DKK1的脱发治疗的关注。
抑制基因表达的技术是开发用于治疗疾病和验证靶标的药物的重要手段。在此类技术中，自从发现其作用以来，已发现RNA干扰(RNAi)作用于各种类型的哺乳动物细胞中的序列特异性mRNA(Barik,J Mol Med 83:764-773,2005)。当长链RNA双链被递送到细胞时，递送的RNA双链被称为“dicer”的内切核酸酶转化为加工成21至23个碱基对(bp)的小干扰RNA(siRNA)，并且siRNA结合至RISC(RNA诱导的沉默复合物)，并通过引导(反义)链识别和降解靶mRNA的过程以序列特异性方式抑制靶基因的表达(Opalinska等人,Nature ReviewsDrug Discovery.1:503-514,2002)。
Bertrand的研究团队发现，与反义寡核苷酸(ASO)相比，对于相同靶基因的siRNA在体外和体内对mRNA表达均具有优越的抑制作用，并且这种作用持续时间很长(Biochem.Biophys.Res.Commun.296:1000-1004,2002)。此外，siRNA具有与靶mRNA互补结合并以序列特异性方式调节靶基因表达的机制，因此与常规的基于抗体的药物或化学药物(小分子药物)相比是广泛适用的(Behlke,MOLECULAR THERAPY.13(4):664-670,2006)。
尽管siRNA具有优异的效果和广泛的应用范围，但为了将siRNA开发为治疗剂，必须通过提高siRNA的体内稳定性和细胞递送效率来将siRNA有效地递送到靶细胞(Xie等人,Drug Discov.Today.11(1-2):67-73,2006)。
为了解决这个问题，正在积极地进行关于修饰siRNA的一些核苷酸或骨架以赋予其核酸酶抗性从而改善体内稳定性，以及关于使用载体(如病毒载体、脂质体或纳米颗粒)的研究。
使用病毒载体(如腺病毒或逆转录病毒载体)的递送系统具有高转染功效，但也具有高免疫原性和致癌性。另一方面，包括纳米颗粒的非病毒递送系统比病毒递送系统具有更低的细胞递送效率，但具有以下优点：具有高体内稳定性、提供靶特异性递送、具有改善的递送效果，如其中包含的RNAi寡核苷酸被吸收和内化到细胞或组织中而几乎不引起细胞毒性或免疫刺激。因此，非病毒递送系统目前被认为比病毒递送系统更有效(Akhtar等人,J.Clin.Invest.117(12):3623-3632,2007)。
在非病毒递送系统中，使用纳米载体的方法被设计成使得使用各种聚合物(如脂质体和阳离子聚合物复合材料)形成纳米颗粒，并且负载在纳米颗粒(即纳米载体)上的siRNA被递送到细胞。通常使用的纳米载体包括聚合物纳米颗粒、聚合物胶束、脂质体复合物(lipoplex)等。其中，由阳离子脂质构成的脂质体复合物与内体的阴离子脂质相互作用，以诱导内体的不稳定，并将内体递送到细胞内(Proc.Natl.Acad.Sci.15；93(21):11493-8,1996)。
为了提高将siRNA递送到细胞内的效率，已开发了使用siRNA缀合物来确保siRNA的稳定性和有效细胞膜渗透性的技术，其中作为生物相容性聚合物的亲水性物质(例如，聚乙二醇，PEG)通过简单的共价键或接头介导的共价键与siRNA缀合(韩国专利号883471)。然而，siRNA的化学修饰及其与聚乙二醇(PEG)的缀合(聚乙二醇化)仍具有缺点，如体内稳定性低和向靶器官的递送效率低。为了解决这些缺点，已开发了一种双链寡RNA构建体，其中亲水性和疏水性物质结合至寡核苷酸，特别是双链寡RNA，如siRNA。这种构建体形成被称为“SAMiRNATM自组装胶束抑制性RNA”的自组装纳米颗粒(韩国专利号1224828)，并且与常规的递送系统相比，所述SAMiRNATM系统可以获得更均匀和小得多的纳米颗粒。
SAMiRNATM系统的具体例子包括PEG(聚乙二醇)和HEG(六乙二醇)，它们是亲水性物质。PEG是一种合成聚合物，并且通常用于增加药物、尤其是蛋白质的溶解度，并调节药代动力学。PEG是一种多分散物质，其中一个批次中聚合物的数量对应于不同单体数量的总和，因此分子量形成高斯曲线。多分散值(Mw/Mn)指示物质的同质性程度。即，具有低分子量(3-5kDa)的PEG展现出约1.01的多分散指数，而具有高分子量(20kDa)的PEG展现出约1.2的高多分散指数。换句话说，随着物质分子量的增加，物质的同质性降低(F.M.Veronese.Biomaterials 22:405-417,2001)。因此，当PEG与药物缀合时，PEG的多分散性反映在了所得缀合物中，不利地使得难以验证单一物质。因此，近年来，通过改善PEG合成和纯化过程，已生产出具有低多分散指数的物质。然而，PEG与低分子量物质的缀合物具有与所述物质的多分散性特征相关的问题，如由于不容易验证是否有效地实现了结合的不便之处(Francesco M.DRUG DISCOVERY TODAY 10(21):1451-1458,2005)。
因此，最近，作为常规自组装纳米颗粒的改善形式，通过以下方法开发了与常规SAMiRNATM相比具有更小尺寸和显著改善的多分散性的新型递送系统SAMiRNATM：将构成SAMiRNATM的双链RNA构建体的亲水性物质封闭成基本单元，每个基本单元包括1至15个具有恒定分子量的均匀单体，并且任选地包括接头，并根据需要使用适当数量的基本单元。
同时，据报道，到2024年全球脱发市场将增长到118亿美元(Grand ViewResearch,Inc.)，七分之四的美国男性和五分之一的中国男性成为秃头，并且其90％或更多的原因已知是雄激素性脱发症。然而，迄今为止开发的大多数脱发治疗剂靶向DHT和5-α还原酶(5-α-还原酶)，但尚未开发出靶向DKK1的用于治疗脱发或促进毛发生长的药剂，所述DKK1是与雄激素性脱发症相关的重要脱发基因。
因此，作为大力开发靶向与毛发生长直接相关的DKK1的用于预防脱发或促进毛发生长的产品的结果，本发明人已发现DKK1特异性双链寡核苷酸可以有效地抑制DKK1的表达，并且包含其的双链寡核苷酸构建体和含有其的组合物可以展现出预防脱发和促进毛发生长的优异效果。基于此发现，完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种能够高度特异性和高效抑制DKK1表达的双链寡核苷酸，优选包括RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合形式、最优选包括DNA/RNA杂合形式的双链寡核苷酸；包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体；以及包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防脱发或促进毛发生长的药物组合物或化妆品组合物，所述药物组合物或化妆品组合物含有DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体作为活性成分的纳米颗粒。
本发明的另一个目的是提供所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于预防脱发或促进毛发生长的用途。
本发明的另一个目的是提供所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于制备预防脱发或促进毛发生长的药物或化妆品的用途。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防脱发或促进毛发生长的方法，所述方法包括向需要预防脱发或促进毛发生长的受试者施用所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒、或者所述组合物。
根据本发明的一个方面，以上和其他目的可以通过提供双链寡核苷酸来完成，所述双链寡核苷酸包含具有选自SEQ ID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链和具有与其互补的序列的反义链。
根据本发明的另一方面，提供了一种双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体具有由以下结构式(1)表示的结构：
A-X-R-Y-B 结构式(1)
其中A是亲水性物质，B是疏水性物质，X和Y各自独立地是简单的共价键或接头介导的共价键，并且R是DKK1特异性双链寡核苷酸，所述DKK1特异性双链寡核苷酸包含具有选自SEQ ID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链和具有与其互补的序列的反义链。
根据本发明的另一方面，提供了包含所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于预防脱发或促进毛发生长的药物组合物，所述药物组合物含有所述双链寡核苷酸构建体或所述纳米颗粒作为活性成分。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于预防脱发或促进毛发生长的化妆品组合物，所述化妆品组合物含有所述双链寡核苷酸构建体或所述纳米颗粒作为活性成分。
根据本发明的另一方面，提供了所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于预防脱发或促进毛发生长的用途。
根据本发明的另一方面，提供了所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于制备预防脱发或促进毛发生长的药物的用途。
根据本发明的另一方面，提供了所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于制备预防脱发或促进毛发生长的化妆品的用途。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于预防脱发或促进毛发生长的方法，所述方法包括向需要预防脱发或促进毛发生长的受试者施用所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒、或者所述组合物。
附图说明
图1示出了通过对DKK1 mRNA序列应用1碱基滑动窗口算法来设计人DKK1特异性双链寡核苷酸候选序列，从而选择包含19个核苷酸的候选序列的过程。
图2示出了312个靶向DKK1的双链寡RNA的初级和二级筛选的结果。
图3示出了具有最高DKK1表达抑制效果的18个序列的初级和二级筛选的结果。
图4示出了通过用具有最高DKK1表达抑制效果的18个序列处理A549细胞而最终选择的10个序列。
图5示出了在作为人真皮毛乳头细胞的HFDPC细胞中对10个最终选择的序列进行的再现性测试的结果。
图6示出了包括随机选择的DKK1特异性寡核苷酸的双链寡核苷酸的纳米颗粒尺寸分布。
图7示出了关于被发现具有最高的DKK1表达抑制效果的序列#72，SAMiRNA抑制mRNA表达的能力。
图8示出了当用SAMiRNA-DKK1#72处理HFDPC细胞系时DKK1的蛋白质表达水平。
图9是示出将SAMiRNA-DKK1#72有效递送到人发根细胞的结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与由本发明涉及的领域中的技术人员所理解的相同含义。通常，本文所用的命名法在本领域中为熟知的并且为通常使用的。
DKK1是一种类型的Dickkopf，其为Wnt抑制蛋白，并且最早被认为是参与两栖动物头部形成的重要蛋白。DKK1是Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的抑制剂，并且据报道参与Wnt上游信号传导，以阻断Wnt信号传导从而抑制癌细胞的生长(Mao等人,Nature 411:321,2001；Niida A.等人,Oncogene 4:23,2004)。研究已经报告了DKK1的功能，包括阿尔茨海默病患者的脑中神经元的退化、黑色素细胞生长和分化的抑制、以及干细胞周期调节(Caricasole A.等人,J.Neurosci.24,2004；Yamaguchi Y.等人,J.Cell.Biol.165,2004)，并且研究也已经报告了参与脂肪形成、软骨形成、胃肠上皮增生、与风湿病相关的骨质流失和卵泡基板的形成。
存在许多关于癌症与DKK1基因之间关联的报道，因为Wnt/β信号传导可以调节上皮-间充质转变，这种转变参与上皮细胞的结合和维持，因此可能影响癌细胞转移过程所需的上皮细胞浸润和细胞分化。因此，DKK1作为Wnt/β信号传导的拮抗剂，可以限制癌细胞在各种类型癌症中的侵袭性。最近，发现在非小细胞肺癌细胞系中DKK1的表达水平根据辐射敏感性而存在差异，并且在A549和H1299细胞系中DKK1的表达增加，所述A549和H1299细胞系是高度抗辐射的细胞系。作为使用DKK1的siRNA抑制A549或H1299中DKK1表达的结果，观察到对辐射的敏感性显著增加。因此，还报道了抑制DKK1的表达或活性对于抗癌治疗可能是重要的(韩国专利号10-1167675)。
此外，自从发现DKK1在毛发生长和退化阶段起着非常重要的作用以来，增加了靶向DKK1的脱发治疗的关注。
迄今为止开发的大多数脱发治疗剂均靶向DHT和5-α-还原酶。作为FDA批准的成分，非那雄胺是一种用于脱发的口服治疗剂，其仅用于男性脱发，并且由于已报道了与雄性激素水平降低相关的副作用而导致使用受到限制，并且在非连续施用后不能保持毛发生长效果。因此，非那雄胺经常与米诺地尔组合使用。非那雄胺的缺点在于由于24小时的药效期它必须在每天的特定时间施用，这是不方便的，并且是昂贵的，因此在经济上是低效的。作为头皮治疗剂，已知米诺地尔因其已被开发为一种降压药并以不同的含量用于男性和女性而对血压具有负面影响。已经开始开发使用与雄激素性脱发症相关的Wnt信号传导通路的脱发治疗剂，但尚未开发靶向DKK1的脱发治疗剂和促进毛发生长的产品，所述DKK1是Wnt信号传导通路中重要的脱发相关基因。
在本发明中，使用1碱基滑动窗口算法设计了对DKK1具有特异性的siRNA候选序列，选择了312个siRNA，并且在其中选择了10个具有特别优异效果的siRNA。此外，通过从所述siRNA产生双链寡核苷酸构建体(SAMiRNA)和纳米颗粒，可以提高细胞内递送效率，并且可以改善预防脱发和促进毛发生长的效果。
在一方面，本发明涉及一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含具有选自SEQID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链和具有与其互补的序列的反义链。
如本文所用，术语“寡核苷酸”包括具有一般RNAi(RNA干扰)作用的所有物质，并且对于本领域技术人员将清楚的是，所述DKK1特异性双链寡核苷酸包括DKK1特异性siRNA、shRNA等。
此外，对于本领域技术人员将清楚的是，包含如下有义链和反义链的DKK1特异性siRNA也落入本发明的范围，只要DKK1特异性siRNA保持对DKK1的特异性即可，所述有义链和反义链具有通过在具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:305的任何一个序列的有义链中或与其互补的反义链中取代、删除或插入一个或多个核苷酸而获得的序列。
SEQ ID NO:1至305表示人DKK1特异性序列，并且是与除了DKK1
mRNA之外的基因具有15个核苷酸或更少同源性的siRNA有义链序列(参见表2)。同时，SEQ ID NO:306至309表示从相关专利(KR 10-1167675、KR10-2010-0051195)中已知的人DKK1特异性siRNA序列(参见表3)。
基于与相关专利中公开的DKK1特异性siRNA序列进行细胞内活性的比较，设想了根据本发明的具有优越效率和与其他人mRNA的低同源性的siRNA序列。根据本发明的寡核苷酸优选地是具有选自SEQ ID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的DKK1特异性双链寡核苷酸，更优选地是具有SEQ ID NO:72的序列作为有义链的DKK1特异性双链寡核苷酸。
根据本发明的寡核苷酸的有义链或反义链优选地由19至31个核苷酸组成，并且包括具有选自SEQ ID NO:1至305中的任何一个序列的有义链和与其互补的反义链。
在本发明中，所述寡核苷酸可以是siRNA、shRNA或miRNA。
此外，在本发明中，所述有义或反义链可以独立地是DNA或RNA。
由本发明提供的DKK1特异性双链寡核苷酸具有设计为与编码所述基因的mRNA互补结合的核苷酸序列，因此可以有效地抑制所述基因的表达。此外，所述双链寡核苷酸可以包含突出端，所述突出端是在所述寡核苷酸的3'端处包含一个或多个未配对的核苷酸的结构。
此外，为了提高所述双链寡核苷酸的体内稳定性，所述双链寡核苷酸可以包含各种修饰以提供核酸酶抗性并降低非特异性免疫应答。例如，所述双链寡核苷酸的有义链或反义链可以包含化学修饰。构成所述双链寡核苷酸的第一或第二寡核苷酸的修饰可以包括选自以下的一种或多种：通过用甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、胺(-NH2)、氟(-F)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫代乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰胺基或-O-二甲基酰胺基氧乙基取代至少一个核苷酸中糖结构的2'碳位置处的羟基基团(-OH)进行修饰；通过用硫取代核苷酸的糖结构中的氧进行修饰；将核苷酸键修饰成硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯键；修饰成PNA(肽核酸)、锁核酸(LNA)或非锁核酸(UNA)形式；以及修饰成DNA-RNA杂合形式，但不限于此(Ann.Rev.Med.55,61-65 2004；US 5,660,985；US 5,958,691；US 6,531,584；US 5,808,023；US 6,326,358；US 6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；Nucleic AcidRes.31:589-595,2003；Nucleic Acids Research,38(17)5761-5773,2010；Nucleic AcidsResearch,39(5)1823-1832,2011)。
在本发明中，可以将一个或多个磷酸基团结合至所述双链寡核苷酸的反义链的5'端。
由本发明提供的DKK1特异性双链寡核苷酸不仅抑制相应基因的表达，而且还显著抑制相应蛋白质的表达。
在本发明中，制备了一种缀合物，其中亲水性物质和疏水性物质分别与所述寡核苷酸的两个末端缀合，以提供所述DKK1特异性双链寡核苷酸的有效的体内递送和改善的稳定性。
其中所述亲水性物质和所述疏水性物质结合至所述寡核苷酸的如上所述siRNA缀合物通过疏水性物质的疏水相互作用形成自组装纳米颗粒(韩国专利号1224828)，并且此类纳米颗粒展现出极其优异的体内递送效率和体内稳定性，并且由于优异的颗粒尺寸均匀性而便于质量控制，从而通过简单的过程制备成药物。
即，在本发明中，制备了包含所述制备的DKK1特异性寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体(SAMiRNA)和纳米颗粒。
在另一方面，本发明涉及一种双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体具有由以下结构式(1)表示的结构：
A-X-R-Y-B 结构式(1)
其中A是亲水性物质，B是疏水性物质，X和Y各自独立地是简单的共价键或接头介导的共价键，并且R是上述DKK1特异性双链寡核苷酸。在一个实施方案中，R是DKK1特异性寡核苷酸，所述DKK1特异性寡核苷酸包含具有选自SEQ ID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链和具有与其互补的序列的反义链。
在下文中，根据本发明的双链寡核苷酸将以RNA为焦点进行描述。然而，对于本领域技术人员将清楚的是，所述双链寡核苷酸可以体现为与本发明的双链寡核苷酸具有相同特性的其他种类的双链寡核苷酸(例如，DNA/RNA杂合体)。
更优选地，包含根据本发明的DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(2)的结构：
其中A、B、X和Y如结构式(1)所定义，S是所述DKK1特异性双链寡核苷酸的有义链，并且AS是所述DKK1特异性双链寡核苷酸的反义链。
更优选地，包含所述DKK1特异性双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体具有由以下结构式(3)或(4)表示的结构：
其中A、B、S、AS、X和Y如结构式(1)所定义，并且5'和3'表示所述DKK1特异性双链寡核苷酸有义链的5'和3'端。
对于本领域技术人员将清楚的是，包含结构式(1)至(4)中的所述DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体可以具有其中一个至三个磷酸基团结合至所述反义链的5'端的结构，并且可以使用shRNA代替siRNA。
结构式(1)至(4)中的所述亲水性物质优选地是分子量为200至10,000的聚合物物质，并且更优选地是分子量为1,000至2,000的聚合物材料。例如，所述亲水性聚合物物质优选地是非离子型亲水性聚合物化合物，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚噁唑啉，但不必限于此。
特别地，结构式(1)至(4)中的所述亲水性物质(A)可以以由以下结构式(5)或结构式(6)表示的亲水性物质嵌段的形式使用。通过根据需要以适当数量(以下结构式(5)或结构式(6)中的n)使用这种亲水性物质嵌段，可以大大地改善使用一般合成聚合物物质等时可能出现的由多分散性导致的问题。
(A′m-J)n 结构式(5)
(J-A′m)n 结构式(6)
其中A'是亲水性物质单体，J是将m个亲水性物质单体连接在一起或将m个亲水性物质单体与siRNA连接的接头，m是1至15的整数，n是1至10的整数，并且由(A'm-J)或(J-A'm)表示的重复单元对应于亲水性物质嵌段的基本单元。
当亲水性物质A具有在结构式(5)或结构式(6)中所示的亲水性物质嵌段时，包含根据本发明的DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体具有由以下结构式(7)或结构式(8)表示的结构：
(A′m-J)n-X-R-Y-B 结构式(7)
(J-A′m)n-X-R-Y-B 结构式(8)
其中X、R、Y和B如结构式(1)所定义，并且A'、J、m和n如结构式(5)和(6)所定义。
在结构式(5)和(6)中，非离子型亲水性聚合物的任何单体、优选选自表1中所示的化合物(1)至(3)的单体、更优选化合物(1)的单体可以不受限制地用作亲水性物质单体(A')，只要它满足本发明的目的即可，并且化合物(1)中的G优选地选自O、S和NH。
特别地，在亲水性物质单体中，由化合物(1)表示的单体具有如下优点：引入各种官能团、展现出优异的生物相容性(如展现出优异的生物亲和力和降低的免疫应答)、以及增加了包含在根据结构式(7)或结构式(8)的构建体中的寡核苷酸的体内稳定性和递送效率，因此非常适合于制备根据本发明的构建体。
[表1]
根据本发明的亲水性物质单体的结构
特别优选的是，结构式(5)至(8)中的所述亲水性物质的总分子量在1,000至2,000的范围内。因此，例如，当使用其中为六乙二醇(即根据结构式(7)和(8)中的化合物(1)的G是O并且m是6)的亲水性物质时，六乙二醇间隔物的分子量是344，因此重复次数(n)是3至5。特别地，在本发明中，结构式(5)和(6)中由(A'm-J)或(J-A'm)n表示的亲水性基团的重复单元，即亲水性物质嵌段，以适当的数量(根据需要由“n”表示)使用。包含在一个亲水性物质嵌段中的亲水性物质单体A和接头J可以独立地与另一个亲水性物质嵌段的那些相同或不同。即，当使用三个亲水性物质嵌段(n＝3)时，不同的亲水性物质单体可以用于各自的亲水性物质嵌段，例如，第一嵌段含有根据化合物(1)的亲水性物质单体，第二嵌段含有根据化合物(2)的亲水性物质单体，并且第三嵌段含有根据化合物(3)的亲水性物质单体，或者选自根据化合物(1)至(3)的亲水性物质单体的任何一种亲水性物质单体可以用于所有的亲水性物质嵌段。类似地，每个亲水性物质嵌段可以使用相同的不同接头来介导亲水性物质单体的结合。另外，表示亲水性物质单体数量的m在亲水性物质嵌段之间可以是相同或不同的。即，不同数量的亲水性物质单体可以用于所有的亲水性物质嵌段；例如，在第一亲水性物质嵌段中可以连接三个亲水性物质单体(m＝3)，在第二亲水性物质嵌段中可以连接五个亲水性物质单体(m＝5)，并且在第三亲水性物质嵌段中可以连接四个亲水性物质单体(m＝4)，并且相同数量的亲水性物质单体可以用于所有的亲水性物质嵌段。此外，在本发明中，接头(J)优选地选自PO3-、SO3和CO2，但不限于此。对于本领域技术人员将清楚的是，可以使用任何接头，只要它满足根据所用的亲水性物质的单体的本发明的目的即可。
结构式(1)至(4)、结构式(7)和结构式(8)中的疏水性物质(B)通过疏水相互作用形成由根据结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)的寡核苷酸构建体构成的纳米颗粒。所述疏水性物质优选地具有250至1,000的分子量，并且可以是类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺、脂质、生育酚、生育三烯酚等，但不限于此。对于本领域技术人员将清楚的是，可以使用任何疏水性物质，只要其满足本发明的目的即可。
所述类固醇衍生物可以选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇基甲酸酯、胆甾烷基甲酸酯和胆甾醇胺，并且所述甘油酯衍生物可以选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯等。在这种情况下，甘油酯的脂肪酸优选地是C12至C50不饱和或饱和脂肪酸。
特别地，在疏水性物质中，饱和或不饱和烃或胆固醇是优选的，因为它们具有在合成根据本发明的寡核苷酸构建体的步骤中容易结合的优点，并且C24烃、特别是其含有二硫键的形式是最优选的。
所述疏水性物质结合至所述亲水性物质的远端，并且可以结合至所述双链寡核苷酸或siRNA的有义链或反义链的任何位置。
根据本发明的结构式(1)至(4)、结构式(7)和结构式(8)中的亲水性或疏水性物质通过简单的共价键或接头介导的共价键(X或Y)结合至所述DKK1特异性双链寡核苷酸。对介导共价键的接头没有特别限制，只要它在所述DKK1受体特异性双链寡核苷酸的末端处与亲水性物质或疏水性物质共价键合即可，并且如果必要的话，提供可以在特定环境中降解的键。因此，在根据本发明的双链寡核苷酸构建体的制备过程中，介导结合从而激活所述DKK1受体特异性双链寡核苷酸和/或亲水性物质(或疏水性物质)的任何化合物均可以用作接头。所述共价键可以是不可降解键或可降解键。在这种情况下，所述不可降解键包括酰胺键或磷酸键，并且所述可降解键包括二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键，但不限于此。
此外，任何寡核苷酸均可以不受限制地用作结构式(1)至(4)和结构式(7)和(8)中由R(或S和AS)表示的DKK1特异性双链寡核苷酸，只要它可以特异性地结合至DKK1的mRNA即可，并且优选地包含具有选自SEQ ID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链以及具有与其互补的序列的反义链。
特别地，包含在根据本发明的结构式(1)至(4)和结构式(7)和(8)中的双链寡核苷酸优选地是DKK1特异性双链寡核苷酸，所述DKK1特异性双链寡核苷酸包含具有选自SEQ IDNO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链以及具有与其互补的序列的反义链。
在包含根据本发明的DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体中，可以在亲水性物质的寡核苷酸的远端处进一步引入胺基团或多组氨酸基团。
这旨在促进包含根据本发明的DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的载体的细胞内引入以及内体逃逸。已报道了胺基团的引入、多组氨酸基团的使用及其作用，以促进载体(如量子点、树枝状聚合物和脂质体)的细胞间引入以及内体逃逸。
具体地，已知所述载体的末端或外部处的经修饰伯胺基团在体内pH下被质子化，并通过静电相互作用与带负电的基因形成缀合物，并且所述载体可以被保护免受溶酶体的降解，因为由于内部叔胺导致促进了内体逃逸，所述内部叔胺在细胞内引入后的低内体pH下具有缓冲作用(Gene transfer and expression inhibition using a polymer-basedhybrid substance.Polymer Sci.Technol.,第23卷,第3期,第254-259页)。
已知组氨酸作为非必需氨基酸在其残基(-R)处具有咪唑(pKa3为6.04)，因此具有增加内体和溶酶体中缓冲能力的作用，因此组氨酸的修饰可以用于增加包括脂质体的非病毒基因载体中内体逃逸的效率(Novel histidine-conjugated galactosylated cationicliposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatomaHepG2 cells.J.Controlled Release 118,pp262-270)。
胺基团或多组氨酸基团可以通过一个或多个接头结合至亲水性物质或亲水性物质嵌段。
在将胺基团或多组氨酸基团引入根据本发明的结构式(1)的双链寡核苷酸构建体的亲水性物质中的情况下，获得了在结构式(9)中所示的结构。
P-J1-J2-A-X-R-Y-B 结构式(9)
其中A、B、R、X和Y如结构式(1)所定义，P是胺基团或多组氨酸基团，并且J1和J2是接头，并各自独立地选自简单的共价键PO3 -、SO3、CO2、C2-12烷基、烯基和炔基，但不限于此。对于本领域技术人员将清楚的是，取决于所使用的亲水性物质，满足本发明目的的任何接头均可以用作J1和J2。
当引入胺基团时，J2优选地是简单的共价键或PO3 -，并且J1优选地是C6烷基，但不限于此。
此外，当引入多组氨酸基团时，优选地，在结构式(9)中，J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是化合物(4)，但不限于此。
此外，当根据结构式(9)的双链寡核苷酸构建体的亲水性物质是根据结构式(5)或(6)的亲水性物质嵌段并且胺基团或多组氨酸基团被引入其中时，获得了由以下结构式(10)或结构式(11)表示的结构：
P-J1-J2-(A'm-J)n-X-R-Y-B 结构式(10)
P-J1-J2-(J-A′m)n-X-R-Y-B 结构式(11)
其中X、R、Y、B、A'、J、m和n如结构式(5)或(6)所定义，并且P、J1和J2如以上结构式(9)所定义。
特别地，在结构式(10)和(11)中，所述亲水性物质优选地结合至所述DKK1特异性双链寡核苷酸的有义链的3'端。在这种情况下，结构式(9)至结构式(11)可以分别采用以下结构式(12)至(14)的形式。
其中X、R、Y、B、A、A′、J、m、n、P、J1和J2如以上结构式(9)至(11)所定义，并且5'和3'表示DKK1特异性双链寡核苷酸的有义链的5'端和3'端。
可以在本发明中引入的胺基团可以是伯胺至叔胺基团中的任何一种，并且特别优选地是伯胺基团。引入的胺基团可以作为胺盐存在；例如，伯胺基团的盐可以以NH3 +的形式存在。
此外，可以在本发明中引入的多组氨酸基团可以包含3至10个组氨酸，特别优选5至8个组氨酸，并且最优选6个组氨酸。此外，除了组氨酸之外，还可以包含一个或多个半胱氨酸。
同时，如果在包含根据本发明的DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和由其形成的纳米颗粒中提供靶向部分，即使在相对低浓度的剂量下也可以有效地促进向靶细胞的递送，可以获得优异的靶基因表达控制功能，并且可以防止所述DKK1特异性双链寡核苷酸向其他器官和细胞的非特异性递送。
因此，本发明提供了一种双链寡核苷酸，其中配体(L)、特别是具有特异性结合至通过受体介导的内吞作用(RME)促进靶细胞内化的受体的特性的配体，进一步结合至根据结构式(1)至(4)和结构式(7)和(8)的构建体的亲水性物质。其中所述配体结合至由结构式(1)表示的双链寡核苷酸构建体的形式具有由以下结构式(15)表示的结构：
(Li-Z)-A-X-R-Y-B 结构式(15)
其中A、B、X和Y如以上结构式(1)所定义，L是具有特异性结合至通过受体介导的内吞作用(RME)促进靶细胞内化的受体的特性的配体，并且i是1至5的整数、优选1至3的整数。
结构式(15)中的配体优选地选自靶受体特异性抗体、适体或具有用于以靶细胞特异性方式增强内化的RME特性的肽；或化学物质如叶酸盐(通常“叶酸盐”和“叶酸”可互换使用，并且本发明中的叶酸盐是指人体内呈天然状态或激活状态的叶酸盐)；糖，包括六胺(如N-乙酰半乳糖胺(NAG))、葡萄糖和甘露糖，或碳水化合物，但不限于此。
此外，结构式(15)中的亲水性物质A可以以根据结构式(5)和(6)的亲水性物质嵌段的形式使用。
在另一方面，本发明涉及包含含有所述DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒。
如上所述，包含所述DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体包含疏水性和亲水性物质两者，因此是两亲性的，并且所述亲水性物质通过与体内的水分子相互作用(如氢键)而对其具有亲和力，因此是指向外部的，并且所述疏水性物质通过疏水性分子之间的疏水相互作用是指向内部的，从而导致热力学稳定的纳米颗粒的形成。即，所述疏水性物质位于纳米颗粒的中心处，并且所述亲水性物质位于所述DKK1特异性双链寡核苷酸的外围处，从而形成保护所述DKK1特异性双链寡核苷酸的纳米颗粒。由此形成的纳米颗粒改善了DKK1特异性双链寡核苷酸的细胞内递送和功效。
根据本发明的纳米颗粒可以仅由包含具有相同序列的双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体形成，或者由包含具有不同序列的双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的混合物形成。在本发明中，具有不同序列的双链寡核苷酸应被解释为包含对不同靶基因(例如DKK1)具有特异性的双链寡核苷酸，并且可以具有相同的靶基因特异性，但序列不同。
另外，除了所述DKK1特异性双链寡核苷酸之外，包含另一种脱发相关基因特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体可以包含在根据本发明的纳米颗粒中。
在本发明中，所述纳米颗粒可以被冻干。
在本发明中发现，所述双链寡核苷酸构建体(SAMiRNA)和纳米颗粒具有预防脱发和促进毛发生长的效果。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防脱发、特别是雄激素性脱发症或促进毛发生长的药物组合物，所述药物组合物包含含有所述DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和/或含有所述DKK1特异性双链寡核苷酸的纳米颗粒。
所述药物组合物可以被用作选自软膏、糊剂、凝胶、胶状物、血清、气溶胶喷雾剂、非气溶胶喷雾剂、泡沫、乳膏、洗剂、溶液和悬浮液的配制品，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防脱发、特别是雄激素性脱发症或促进毛发生长的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含含有所述DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和/或含有所述DKK1特异性双链寡核苷酸的纳米颗粒。
所述组合物被用作选自护发素、头发调理剂、头发香精、头发洗剂、头发营养洗剂、洗发香波、头发调理剂、头发处理剂、发乳、头发营养霜、头发保湿霜、头发按摩霜、发蜡、发胶、发膜、头发营养包、发皂、头发清洁泡沫、发油、头发干燥剂、头发防腐剂、染发剂、头发波面霜、头发漂白剂、头发啫喱、发釉、头发美容剂、头发定型剂、头发保湿剂、发用摩丝和头发喷雾的配制品。
如下组合物通过抑制作为由DHT诱导的脱发基因的DKK1的表达有效地预防脱发或诱导毛发生长，所述组合物根据本发明含有所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含其的双链寡核苷酸构建体和/或包含所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒作为活性成分。
特别地，根据本发明的用于预防脱发或促进毛发生长的组合物可以含有所述双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体包含具有选自SEQ ID NO:72、80、81、209、214、215、216、217、254和256的任何一个序列的有义链和具有与其互补的序列的反义链。
此外，根据本发明的组合物还可以含有对与脱发疾病相关的基因具有特异性的双链寡核苷酸，或者含有包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体，而不是包含所述DKK1特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体。
根据本发明的组合物可以用于预防与参与DKK1的上游或下游信号传导的基因相关的脱发、特别是雄激素性脱发症，但不限于此。
除了上述活性成分之外，本发明的组合物可以通过掺入一种或多种药学上可接受的载体来制备。所述药学上可接受的载体应与本发明的活性成分相容，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或其两种或更多种的组合。所述组合物可以任选地含有其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲液和抑菌剂。此外，通过进一步向其中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，所述组合物可以被制备成可注射配制品，如水溶液、悬浮液或乳液。特别地，所述组合物优选地被制备成冻干配制品。所述冻干配制品可以使用本发明所属领域熟知的方法来制备，或者通过进一步添加冻干稳定剂来制备。此外，所述冻干配制品优选地使用本领域已知的合适方法或Remington's Pharmaceutical Science(宾夕法尼亚州伊斯顿的Mack Publishing公司)中公开的方法根据每种疾病或组分来制备。
本发明组合物中包含的活性成分等的含量及其施用方法可以由本领域技术人员基于个体的典型症状和脱发的严重程度来确定。此外，所述组合物可以制备成各种形式，如粉末、片剂、注射剂、软膏和功能性化妆品，并且可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中提供。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防脱发或促进毛发生长的方法，所述方法包括向需要促进毛发生长的受试者施用所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或包含其的纳米颗粒。本发明涉及一种预防脱发疾病、特别是雄激素性脱发症、斑秃或休止期脱发症或者促进或诱导毛发生长的方法。
在另一方面，本发明涉及所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于预防脱发或促进毛发生长的用途。
在另一方面，本发明涉及所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于制备预防脱发或促进毛发生长的药物的用途。
在另一方面，本发明涉及所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、或者包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒用于制备预防脱发或促进毛发生长的化妆品的用途。
当所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的构建体、含有其的组合物或包含其的纳米颗粒用于制备功能性化妆品或皮肤外用制剂时，功能性化妆品或皮肤外用制剂的配制品选自乳膏、洗剂、凝胶、水溶性液体和香精，但不限于此。
在本发明中，所述脱发包括所有雄激素性脱发症、斑秃和休止期脱发症。
[实施例]
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员将清楚的是，这些实施例仅提供用于说明本发明，并且不应理解为限制本发明的范围。
实施例1：用于筛选靶向DKK1的siRNA的算法候选序列的选择
设计了312个能够结合至DKK1(智人)基因的mRNA序列(NM_012242.3，1913bp)的靶核苷酸序列(有义链)。
更具体地，DKK1的siRNA候选序列的设计过程是通过以下方法进行的：审查人DKK1mRNA的外显子图，使用1碱基滑动窗口算法设计包含19个核苷酸的候选序列，以及在与人总参考req RNA比较的siRNA候选序列列表上以100或更小的e值进行BLAST，以选择与其他基因具有15个核苷酸或更小的RNA序列同一性的305个siRNA候选序列(表2)。此时，使用总共312个siRNA序列进行了DKK1抑制实验，包括已知文献(KR 10-1167675、KR10-2010-0051195)中提到的四个siRNA序列(表4)(图1)。
[表2]
使用1碱基滑动窗口筛选选择了305个DKK1特异性siRNA候选序列
[表3]
相关文献(KR 10-1167675、KR 10-2010-0051195)中提到的DKK1特异性siRNA序列
实施例2：靶向人DKK1基因的siRNA的筛选
使用312个靶向实施例1中合成的人DKK1序列的siRNA进行了筛选，以找到有效抑制DKK1 mRNA表达的序列。
2-1：用hDKK1 siRNA转染细胞
为了找到有效抑制人DKK1表达的siRNA序列，使用了作为人肺癌细胞系的A549和作为人毛囊真皮乳头细胞的HFDPC。使用含有10％胎牛血清(HyClone，美国)和1％青霉素-链霉素(HyClone，美国)的RPMI培养基(HyClone，美国)在存在5％CO2的情况下于37℃下培养A549细胞系，并且使用含有SupplementMix(Promo cell，德国)的毛囊真皮乳头细胞生长培养基(Promo cell，德国)在存在5％CO2的情况下于37℃下培养HFDPC。将A549和HFDPC细胞以4X104个细胞/孔接种在12孔板(Falcon，美国)上，并且第二天，根据制造商的方案，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，美国)用20nM siRNA转染细胞。
2-2：通过hDKK1表达抑制功效分析对308个siRNA进行初级和二级筛选
以与实施例2-1中相同的方式，用312种类型的siRNA将A549细胞重复转染3次。使用通用RNA提取试剂盒(Bioneer)从细胞裂解物提取了总RNA，并且使用GreenStarTM Master Mix(Bioneer)，根据制造商的方案使用RNA作为模板测量hDKK1和hRPL13A(内部对照)的mRNA表达水平，并分析了hDKK1基因与对照样品相比的相对mRNA表达率。针对每种基因的引物序列如下给出(表4)。
[表4]
hDKK1和RPL13A(内部对照)引物序列
SEQ ID NO:310
DKK1-正向
5'-TGACAACTACCAGCCGTACC-3'
SEQ ID NO:311
DKK1-反向
5'-CAGGCGAGACAGATTTGCAC-3'
SEQ ID NO:312
RPL13A-正向
5'-GTGTTTGACGGCATCCCACC-3'
SEQ ID NO:313
RPL13A-反向
5'-TAGGCTTCAGACGCACGACC-3'
作为结果，鉴定出46个显示50％或更高的DKK1 mRNA抑制活性的序列，如图2所示。通过二级筛选鉴定出52个显示50％或更高的DKK1 mRNA抑制活性的序列，以确保以与上述相同方式的再现性。通过反复的初级和二级筛选，筛选出18个显示55％或更高的DKK1 mRNA抑制活性的共有序列(图2)。
2-3：选择的hDKK1 siRNA候选序列的再现性评价
为了评价在实施例2-2中选择的18个hDKK1 siRNA序列中具有优异抑制活性的10个序列的再现性，用10个不同的siRNA序列将A549细胞重复转染3次。结果显示，与初级和二级筛选类似，所有10个序列均显示出55％或更高的抑制活性，特别是#72序列显示出70％或更高的高抑制活性(图3和图4)。
对于二级再现性评价，以与上述相同的方式用10个序列将人毛囊真皮乳头细胞(HFDPC)重复转染三次，并对其进行分析。结果显示，所有10个序列均显示出高的DKK1 mRNA抑制活性，并且像A549细胞一样，#72序列展现出80％或更高的高抑制活性(图5)。
通过重复和再现性评价，最终选择了一个最有效地抑制人DKK1基因表达的序列，并且所述DKK1 siRNA序列的信息如下表5所示。
[表5]
有效抑制hDKK1基因表达的siRNA序列
SEQ ID NO:
代码名称
位置
有义链序列
72
SAMi-DKK1#72
369-387
ATAAGTACCAGACCATTGA
实施例3：使用选择的DKK1序列#72合成双链寡核苷酸构建体并评价其DKK1表达抑制活性
3-1：SAMiRNA-DKK1#72构建体的合成
本发明中制备的双链寡核苷酸构建体(SAMiRNA)具有由以下结构式表示的结构。
具有所需序列的寡核苷酸单链通过合成过程获得，所述合成过程通过使用结合核苷的固体支持物(CPG)重复执行包括解封闭、偶联、封端和氧化的循环来完成。使用RNA合成器(384合成器，韩国BIONEER)进行了一系列用于合成所述双链寡核苷酸的过程。
所述双链寡核苷酸构建体的有义链通过以下方法产生：使用β-氰乙基亚磷酰胺与聚乙二醇(PEG)-CPG作为支持物重复连接构成DNA骨架结构的磷酸二酯键，以合成双螺旋寡核苷酸-亲水性物质构建体，所述构建体包含有义链，其中聚乙二醇结合至3'端，并且包含二硫键的C24结合至5'端。待与有义链退火的反义链通过以下方法产生：使用β-氰乙基亚磷酰胺重复连接构成RNA骨架结构的磷酸二酯键以产生具有与有义链互补的序列的反义链，然后使用化学磷酸化试剂(CPR)产生具有结合至5'端的磷酸基团的反义链。
在合成完成后，通过在60℃水浴中用28％(v/v)氨处理而合成的寡核苷酸单链和寡核苷酸-聚合物构建体与CPG分离，然后通过去保护去除保护残基。在70℃的烘箱中，用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三乙胺和三乙胺三氢氟酸盐处理已去除保护残基的单链寡RNA和寡RNA-聚合物构建体，以去除2'端。通过高效液相色谱法(HPLC)从反应产物分离寡核苷酸单链、寡核苷酸-聚合物构建体和配体结合的寡核苷酸-聚合物构建体，通过MALDI-TOF质谱法(MALDI TOF-MS，SHIMADZU，日本)测量其分子量，并确定它们是否对应于待合成的核苷酸序列和寡核苷酸-聚合物构建体。然后，为了制备每个双链寡核苷酸构建体，将等量的有义链和反义链混合，使所得混合物在1X退火缓冲液(30mM HEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁，pH为7.0)中在90℃恒温水浴中反应3分钟，然后在37℃下反应以产生所需的SAMiRNA、monoSAMiRNA(n＝1)、monoSAMiRNA(n＝2)、monoSAMiRNA(n＝3)和monoSAMiRNA(n＝4)。通过电泳鉴定了制备的双链寡核苷酸构建体的退火。
3-2：SAMiRNA-DKK1#72纳米颗粒的颗粒尺寸的分析
为了分析实施例3-1中合成的SAMiRNA-DKK1#72的颗粒尺寸，使用Zetasizer NanoZS(英国Malvern)测量SAMiRNA的尺寸和多分散指数。SAMiRNA-DKK1#72纳米颗粒的尺寸和多分散指数在下表6中示出，并且代表性图在图6中示出。
[表6]
SAMiRNA-DKK1#72纳米颗粒的尺寸和多分散指数
SEQ ID NO:
代码名称
尺寸
PDI
72
SAMi-DKK1#72
11.43
0.403
3-3：用SAMiRNA-DKK1#72纳米颗粒转染细胞
将人毛囊真皮乳头细胞(HFDPC)用于评价最终候选SAMiRNA-DKK1#72的DKK1表达抑制活性。使用含有SupplementMix(Promo cell，德国)的毛囊真皮乳头细胞生长培养基(Promo cell，德国)在存在5％CO2的情况下于37℃下培养HFDPC系。将HFDPC以4X104个细胞/孔接种在12孔板(Falcon，美国)上，并且第二天，用1X DPBS稀释SAMiRNA-DKK1#72，并用5μMSAMiRNA-DKK1#72处理细胞。每12小时一次，将细胞用SAMiRNA-DKK1#72总共处理两次或四次，并在存在5％CO2的情况下于37℃下进行培养。
3-4：SAMiRNA-DKK1#72纳米颗粒的DKK1 mRNA表达抑制活性的评价
进行qRT-PCR分析以评价最终候选SAMiRNA-DKK1#72的DKK1基因表达抑制活性。将HFDPC系以4X104个细胞/孔接种在12孔板(Falcon，美国)上，并在存在5％CO2的情况下于37℃下进行培养。第二天，将细胞用5μM SAMiRNA-DKK1#72处理两次和四次，并且使用lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，美国)用20nM SAMiRNA-DKK1#72转染作为阳性对照组。将细胞培养48小时，使用通用RNA提取试剂盒(Bioneer，韩国)从细胞裂解物提取了总RNA，并且使用GreenStarTM Master Mix(Bioneer，韩国)，根据制造商的方案使用RNA作为模板通过qRT-PCR分析DKK1和RPL13A(内部对照)的mRNA表达水平。
结果显示，SAMiRNA-DKK1#72具有约70％或更高的DKK1 mRNA表达抑制活性，这高于阳性对照组的DKK1 mRNA表达抑制活性(图7)。
3-5：SAMiRNA-DKK1#72纳米颗粒的DKK1蛋白表达抑制活性的评价
确定最终候选SAMiRNA-DKK1#72对抑制HFDPC系中DKK1蛋白表达的影响。将HFDPC系以4X104个细胞/孔接种在12孔板(Falcon，美国)上，在存在5％CO2的情况下于37℃下培养，并且第二天，用5μM SAMiRNA处理两次或四次。使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，美国)，用20nM SAMiRNA转染细胞作为阳性对照组。将细胞培养48小时，收集上清液并取样，并且使用人Dkk-1 Quantikine ELISA试剂盒(R&D systems，美国)，根据制造商的方案定量分析DKK1蛋白的表达水平。
ELISA分析的结果显示，最终候选物质SAMiRNA-DKK1#72展现出约70％或更高的蛋白质抑制活性，这类似于实施例3至实施例4的DKK1 mRNA表达抑制活性，并且SAMiRNA-DKK1#72的蛋白质抑制活性与阳性对照组的蛋白质抑制活性相当(图8)。
实施例4：将SAMiRNA纳米颗粒递送到发根中的测定
为了确定将最终选择的SAMiRNA-DKK1#72递送到人发根中的效率，使用人发测试递送效果。在实验当天，通过在保持头发尖端的同时拔头发来获得头发，剪去距根部约1cm的长度，然后在96孔板上在200μl M199培养基(10％FBS+1％青霉素)中培养1小时。然后，将头发在200μl的含有10μM用FAM荧光标记的SAMiRNA的M199培养基中培养24小时。在用SAMiRNA处理24小时后，用DPBS将头发洗涤三次，并将发根固定在含有3.7％甲醛和2％FBS的PBS中20分钟。将固定的发根种植在含有OCT化合物的基底模具中，并放置在预冷冻的不锈钢板上，以完全冷冻OCT化合物。将冷冻组织在-70℃下储存，并在-20℃下放置约30分钟，以便于在用组织切片器切割之前进行组织切片。将厚度为10μm的组织切片放置在载玻片上并干燥1小时。在干燥后，使用含有DAPI的封固溶液封固组织切片。
用共聚焦激光扫描显微镜(LSM5 LIVE CONFIGURATION VARIOTWO VRGB)观察荧光。结果显示，SAMiRNA被很好地递送到头发组织根部的细胞中(图9)。
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求书和其等同物进行限定。
工业适用性
所述DKK1特异性双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的所述双链寡核苷酸构建体、包含所述双链寡核苷酸或所述双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒、或者含有所述双链寡核苷酸、所述双链寡核苷酸构建体或所述纳米颗粒作为活性成分的用于预防脱发或毛发生长的组合物可以高效地抑制DKK1的表达而不引起副作用，并且展现出优异的预防脱发和促进毛发生长的效果，因此对于预防脱发和促进毛发生长非常有用。
序列自由文本
附有电子文件。
序列表
<110> 柏业公司
<120> 靶向DKK1基因的双链寡核苷酸、包含其的构建体以及含有其的脱发预防或毛发生长组合物
<130> PF-B2633
<140> PCT/KR2020/000750
<141> 2020-01-15
<150> 10-2019-0005277
<151> 2019-01-15
<160> 313
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 137
catgcgtcac gctatgtgc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SAMi-hDKK1#139
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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cgtcacgcta tgtgctgcc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> SAMi-hDKK1#142
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<212> DNA
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<220>
<223> SAMi-hDKK1#143
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SAMi-hDKK1#151
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SAMi-hDKK1#152
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SAMi-hDKK1#239
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SAMi-hDKK1#240
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gtacacattg attgttatc 19
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<211> 19
<212> DNA
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taggcttcag acgcacgacc 20
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