一种利用起皱假单胞菌ⅱ型合酶生产pha的方法
阅读说明：本技术 一种利用起皱假单胞菌ⅱ型合酶生产pha的方法 (Method for producing PHA (polyhydroxyalkanoate) by utilizing pseudomonas puckeri type II synthase ) 是由 胡风庆 赵小慧 辛知纯 于 2021-02-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及PHA生物合成领域,具体涉及一种新型生产PHA的方法。具体实施方案是：以起皱假单胞菌为出发菌株,利用起皱假单胞菌pBBR1MCS2-phaC1、pBBR1MCS2-phaC2的表达质粒,选用果糖、甘油、月桂酸、葡萄糖酸钠、油酸钠等不同碳源验证起皱假单胞菌pBBR1MCS2-phaC2合酶功能活性,结果表明重组菌可以利用油酸钠为碳源产生了PHA。从而保证了今后嵌合酶的成功构建,嵌合PHA合酶可以扩展其底物的广泛性,以提高PHA产量,极大的促进PHA的广泛应用。(The invention relates to the field of PHA biosynthesis, in particular to a novel PHA production method. The specific implementation scheme is as follows: the pseudomonas corrugating is used as an initial strain, expression plasmids of pseudomonas corrugating pBBR1MCS2-phaC1 and pBBR1MCS2-phaC2 are used, different carbon sources such as fructose, glycerol, lauric acid, sodium gluconate and sodium oleate are selected to verify the functional activity of the pseudomonas corrugating pBBR1MCS2-phaC2 synthase, and the result shows that the recombinant strain can generate PHA by using sodium oleate as a carbon source. Thus ensuring the successful construction of the chimeric enzyme in the future, and the chimeric PHA synthase can expand the universality of the substrate thereof so as to improve the PHA yield and greatly promote the wide application of the PHA.)
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用起皱假单胞菌II型合酶生产PHA的方法。
背景技术
羟基脂肪酸酯(PHA)是一种由许多细菌在营养不平衡条件下合成的胞内能量和碳源贮藏性的物质。PHA有着良好的生物相容性、生物可降解性、憎水性以及由不同官能团带来的独特性质，被用作组织工程材料药物缓释材料，是一种有很好发展潜力的生物材料，但目前生物合成的PHA存在产率低、成本高、单体组分单一等问题，不能满足各领域对于新型生物材料的需求，学术界和产业界等研究人员都试图通过各种方法解决这一关键技术问题。PHA合成中很需多种酶的参与，利用分子生物学技术对PHA合酶进行改造以改变其底物特异性、提高催化活性、改变单体组成、获得新型PHA是当前研究热点。
由于起皱假单胞菌388 II型合酶(phaC2)与恶臭假单胞菌KT2442II型合酶(phaC2)基因序列同源性为73.1％，且恶臭假单胞菌KT2442与起皱假单胞菌388均可利用多种碳源合成PHA，适合构建嵌合酶。恶臭假单胞菌KT2442 phaC2已有人成功克隆并表达，而对于起皱假单胞菌phaC2研究较少，尚未成功验证起皱假单胞菌phaC2的表达质粒功能活性，若其功能活性，即可构建II型嵌合酶。
构建嵌合酶则可以融合不同菌株PHA合酶的特性，使底物范围扩大、改变产物PHA的单体组分，从而产生新型PHA。这些对于今后PHA生产成本的降低、新型PHA的合成具有重大理论和实践意义，将极大的促进PHA的广泛应用。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供起皱假单胞菌构建II型嵌合酶生产PHA的方法，以解决PHA生产量低和生产成本高的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法，包括如下步骤：
1)挑取在LB琼脂培养基上30℃温度下培养12h的起皱假单胞菌单菌落接种于10mlLB培养基中，在30℃，200rpm，摇床培育8-12h，作为种子液；
2)将种子液以5％接种量接种于矿物盐发酵培养基，在30℃，200rpm条件下，摇床培养72h；
3)培养结束后，洗涤、收集菌体；
4)将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
上述的一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法，LB培养基的制备方法如下：取5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/lNaCl，分装后在121℃灭菌15-20min。
上述的一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法，所述的LB琼脂培养基的制备方法如下：取5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/lNaCl，加入15g/l的琼脂粉，分装后在121℃灭15-20min。
上述的一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法，所述的矿物盐发酵培养基，由组分I、组分II、组分III和组分IV组成；
所述的组分I为：十二水磷酸氢二钠180g/l、磷酸氢二钾30g/l；
所述的组分II为：硫酸铵1g/l、硫酸镁0.41g/l；
所述的组分III为：柠檬酸铁铵(17％)5g/l、氯化钙2g/l；
所述的组分IV为：氯化镍20mg/l、硫酸铜10mg/l、钼酸钠30mg/l、氯化锰30mg/l、氯化钴200mg/l、硫酸锌100mg/l、硼酸300mg/l。
上述的一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法，步骤3)具体为培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。
上述的一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法，所述的矿物盐发酵培养基中含有碳源，所述的碳源是甘油、月桂酸、葡萄糖酸钠、果糖、油酸钠中的一种。
本发明的有益效果是：证明一种新型用于生产合成PHA的菌株，以油酸钠为碳源的pBBR1MCS2-phaC2的重组菌可用于生产PHA，从而为下一步嵌合酶的构建和继续研发生产PHA提供了基础。
附图说明
图1是中长链PHA标准品的气相色谱分析图谱。
图2是R.eutropha PHB-4利用油酸钠发酵后GC图谱。
图3含有空载体的R.eutropha PHB-4利用油酸钠发酵后的GC图谱。
图4是重组R.eutropha PHB-4-phaC2利用油酸钠发酵后的GC图谱。
图5为中长链PHA标准品的GC图谱
图6为对照组的含有空载体的R.eutropha PHB-4利用油酸钠发酵后的GC图谱
图7对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株利用油酸钠发酵后的GC图谱
图8为重组R.eutropha PHB-4-phaC2利用油酸钠发酵后的GC图谱
具体实施方式
实施例1用起皱假单胞菌II型合酶以油酸钠为碳源生产PHA
菌种：起皱假单胞菌pBBR1MCS2-phaC2
培养基：
1.LB培养基：5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/lNaCl，分装后在121℃灭菌15-20min。
2.LB琼脂培养基(pH7.0-7.2)：加入上述各成分后，加入15g/l的琼脂粉，分装后在121℃灭15-20min。
3.矿物盐发酵培养基：
表1矿物盐发酵培养基组分表
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的油酸钠于组分II中为碳源配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量接种于pBBR1MCS2-phaC2的重组菌(来自本实验室保存)，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
一种利用起皱假单胞菌株II型合酶生产PHA方法首先对起皱假单胞菌388 II型合酶(phaC2)与其他菌株基因序列的同源性进行对比：
表2 PHA产生菌菌株的序列同源性对比表
注：
1:食油假单胞菌(P.oleovorans)14682Ⅰ型合酶(phbC)GenBank:AF422800
2:恶臭假单胞菌(P.putida)II型合酶KT2442(phaC1)GenBank:AF150670
3:恶臭假单胞菌(P.putida)II型合酶KT2442(phaC2)GenBank:AF150670
4:起皱假单胞菌(P.corrugata)388 II型合酶(phaC1)GenBank:GU966686
5:起皱假单胞菌(P.corrugata)388 II型合酶(phaC2)GenBank:GU966687
6:嗜水气单胞菌(A.hydrophila)WQⅠ型合酶(phaC)GenBank:AY665302
上表为本实验室产PHA产生菌菌株序列同源性对比，可知基因序列同源性最高的为起皱假单胞菌388 II型合酶(phaC2)与恶臭假单胞菌KT2442 II型合酶(phaC2)基因序列，同源性达到73.1％，恶臭假单胞菌KT2442 phaC2(来自清华大学生物科学与技术系)已有人成功克隆并表达，而对于起皱假单胞菌phaC2研究较少，但本实验室已成功克隆并申请GeneBank号(GU966686，GU966687)，同时成功构建了起皱假单胞菌phaC2的表达质粒，尚未成功验证其功能活性，只需验证其功能活性，即可构建II型嵌合酶，生产PHA。
对比例1用空载体的R.eutropha PHB-4以油酸钠为碳源生产PHA
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的油酸钠于组分II中为碳源配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量接种于空载体的R.eutropha PHB-4(来自本实验室保存)，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
对比例2用R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株以油酸钠为碳源生产PHA
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的油酸钠于组分II中为碳源配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量于R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株(来自本实验室保存)，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
对比例3用起皱假单胞菌II型合酶以甘油为碳源生产PHA
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的甘油于组分II中为碳源配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量分别接种：空载体的R.eutropha PHB-4、对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和重组R.eutropha PHB-4，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
对比例4用起皱假单胞菌II型合酶以月桂酸为碳源生产PHA
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的月桂酸为碳源于组分II中配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量分别接种：空载体的R.eutropha PHB-4、对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和重组R.eutropha PHB-4，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
对比例5用起皱假单胞菌II型合酶以葡萄糖酸钠为碳源生产PHA
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的葡萄糖酸钠为碳源于组分II配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量分别接种：空载体的R.eutropha PHB-4、对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和重组R.eutropha PHB-4，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
对比例6用起皱假单胞菌II型合酶以果糖为碳源生产PHA
培养方法：起皱假单胞菌在LB琼脂培养基上30℃培养12h左右，挑取单菌落接种于10ml LB培养基中，摇床30℃，200rpm，8-12h，作为种子液。再添加1％的果糖为碳源于组分II配制矿物盐发酵培养基，以5％接种量分别接种：空载体的R.eutropha PHB-4、对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和重组R.eutropha PHB-4，摇床30℃，200rpm，72h。培养结束后，8000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗菌体沉淀，8000rpm，离心10min收集菌体，再用95％乙醇洗涤菌体，8000rpm，离心10min收集菌体。将得到的湿细胞在-20℃冰箱中冷冻过夜，干燥到细胞恒重。
实施例2证明起皱假单胞菌II型合酶以油酸钠为碳源生产PHA
检测方法：称量细胞干重，气相色谱分析。
表3含有空载体R.eutropha PHB-4、对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和含有五种碳源的重组R.eutropha PHB-4的摇瓶发酵结果表
注：ND：not detected
称量细胞干重：如上表通过称量对比三组细胞：含有空载体R.eutropha PHB-4、对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和重组R.eutropha PHB-4，结果表明只有以油酸钠为碳源的重组菌产生PHA，约占细胞干重的1.25％。通过细胞干重测量结果可知，只有油酸钠为碳源的重组菌产生了PHA，因此继续对以油酸钠发酵含有空载体的R.eutropha PHB-4、R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株和重组R.eutropha PHB-4-phaC2进行气相色谱分析检测。
气相色谱法制备样品：将50mg干细胞放入酯化管中，加入2ml氯仿和2ml酯化液，盖紧盖子。密闭置于100℃的烘箱中酯化4h。酯化后取出，冷却至室温后开盖，加入1ml无菌水，振荡混匀水相的有机相，静置放置待水相与氯仿相完全分层，将氯仿相转移到另外的管中保存，用于气相色谱分析。
图5为中长链PHA标准品的GC图谱，由GC图谱可知，标准PHA含有HO、HD、HDD。
图6为对照组的含有空载体的R.eutropha PHB-4利用油酸钠发酵后的GC图谱，并未检测到任何PHA。
图7为对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株利用油酸钠发酵后的GC图谱，并未检测到任何PHA。
图8为重组R.eutropha PHB-4-phaC2利用油酸钠发酵后的GC图谱，可以重组菌以油酸钠为碳源成功生成PHA。
结果：带有pBBR1MCS2-phaC2的重组菌仅在油酸钠为碳源的培养基中能够产生PHA，而R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株及不含pBBR1MCS2-phaC2的重组菌，不能产生PHA，从而证明了表达质粒构建成功且合酶基因具有功能。重组菌以油酸钠为碳源产生的PHA由3HO、3HD、3HDD组成，约占细胞干重的1.25％。
本发明中以葡萄糖酸钠、甘油、月桂酸、油酸钠、果糖五种碳源发酵，结果中只有以油酸钠为碳源的重组R.eutropha PHB-4菌株中产生PHA，而对照组的R.eutropha PHB-4合酶缺失突变株、含有空载体R.eutropha PHB-4菌株利用上述五种碳源发酵，GC检测均不能产生任何PHA，证明了合酶基因的功能，以油酸钠为碳源的pBBR1MCS2-phaC2的重组菌可用于生产PHA。
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