具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明公开了一种多肽纳米复合物，多肽纳米复合物是通式为[peptide-S-Au]_n的纳米颗粒，n为正整数，其中peptide为(ALA-Hyp-Y-Hle-PM-^DR^DC)-PEG₃-MDMX，ALA-Hyp-Y-Hle-PM-^DR^DC为Von HippelLindau因子的片段。

本发明还公开了一种多肽纳米复合物的制备方法，由以下步骤组成：

步骤1：根据FMOC化学法通过固相多肽合成得到peptide，其中peptide为(ALA-Hyp-Y-Hle-PM-^DR^DC)-PEG₃-MDMX；

步骤2：将peptide和NH₂-PEG_n-SH磁力搅拌后混合到HAuCl₄溶液中即得多肽纳米复合物。

本发明还公开了一种多肽纳米复合物的应用，用于抑制肿瘤的生长，通过诱导MDMX泛素化依赖性降解，进而恢复p53和p73的抗癌功能。

本发明设计了一种多肽衍生的PROTACs，可以结合到MDMX和VonHippel Lindau因子(VHL)E3连接酶表面的空隙中，由于像粘合剂一样桥接了MDMX和VHL，这个多肽衍生的PROTACs被叫做分子胶水MG。此外，为了克服基于多肽的PROTACs药理学障碍，通过金-多肽前体Peptide-S-Au的自组装得到[peptide-S-Au]_n，如图1所示，简称为Nano-MG，Nano-MG是一个纳米尺寸的颗粒。

1.Nano-MG的设计和合成

MG由三个部分组成：1)MDMX结合基团(bindingmotif)；2)一个由聚乙二醇三聚体(tripolymerglycol)(PEG₃)和6-氨基己酸组成的柔性连接体；3)E3泛素化连接酶复合体中的募集目标的亚基VHL识别的羟基脯氨酸-和高亮氨酸-组成的八肽(图2A)。

两个额外的右旋Cys和Arg残基被引入MG的C末端，用于构建纳米团簇。值得注意的是，MG很容易根据FMOC化学(FMOCchemistry)通过固相多肽合成(SPPS)进行合成，收率约75％，纯度>95％，从而进一步提高了其应用潜力，MG的纳米工程化是在温和条件下通过“一锅两步”法进行的。

步骤1：1mgMG和1mgNH₂-PEG_n-SH(MW2000Da)磁力搅拌5min后混合到5ml20mMHAuCl₄溶液中。

步骤2：加入5ml100mMHEPES(pH7.4)，溶液变成紫色(图2B)。

2.Nano-MG的表征

紫外-可见光谱证实了Nano-MG的形成，Nano-MG的等离子体共振(plasmaresonance)给出了特征性紫外吸光度(UVabsorbance)(540nm)。动态光散射测量表明，Nano-MG的流体动力学尺寸为25nm(图2B)。图2C中傅立叶变换红外光谱(FTIR)显示，从MG的光谱中游离巯基的特征性吸收峰从偏移到了Nano-MG的光谱中金(I)-硫醇盐(Thiolate)络合物(complex)的峰，表明了金离子已经被硫酸盐中的硫原子桥接入MG，通过X射线光电子能谱(XPS)对该中间体进行进一步表征，其中Nano-MG的Au(4f)峰位与在Cys残基中Au(I)离子与烷硫醇共轭(conjugated)的结果一致(图2D)。

上述这些结果表明，MG多肽已成功组装成超分子金(I)-硫醇-多肽纳米复合物(Nano-MG)。此外，通过高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)图像和X射线能谱分析(EDS)，确定了Nano-MG的形态和元素组成。如图2E所示，HRTEM图像和衍射图谱(diffractionpattern)显示了成球型的微球体、具有单一(single)良好分散性能的、良好结晶度的Nano-MG。EDS分析表明，所观察到的Nano-MG由Au、N、O和S所组成(图2G)，与多肽和金的构成一致。元素叠加图(overlay chartofelements)和TEM图像显示了在纳米颗粒中均匀地分散着的Au、N、O和S(图2F)，表明了Nano-MG具有良好均匀性。总的来说，以上结果说明了Nano-MG被成功地构建为球形超分子金(I)-硫醇-多肽纳米复合物。

3.Nano-MG的稳定性

化学稳定性、细胞膜渗透性和药物可控性释放这三个关键特性对Nano-MG的药效至关重要。

首先检测了Nano-MG的化学稳定性，通过将其悬浮在pH分别为4.0、6.0和7.4的含20％FBS的PBS中，用DLS测量随时间变化(time-dependentchanges)的粒度值(particlesize)。图2H显示，Nano-MG能够在整个24h内保持单分散和大小不变，说明Nano-MG可以避免不良聚集(infaustaggregation)以及随之发生的网状内皮系统(reticuloendothelialsystem)摄取的风险。

为了探明Nano-MG的穿癌细胞膜的能力，将异硫氰酸荧光素(FITC)通过N-端结合到MG上，并在孵育6h后，通过流式细胞术分析^FITCMG和Nano-^FITCMG的细胞摄取情况。如图2I所示，与^FITCMG相比，内化的Nano-^FITCMG水平明显增高。加之，与3mM阿米洛利(微胞饮抑制剂)和2μM细胞松弛素D(肌动蛋白抑制剂)预孵育，阻碍了Nano-^FITCMG的内化作用，也说明了是肌动蛋白依赖的微胞饮作用。

Nano-MG的一个关键性设计是它可以增加细胞内对还原环境的敏感性。金(I)-烷硫醇键响应癌细胞内高浓的谷胱甘肽(GSH)，释放负载的药物，而在细胞外环境中保持稳定。可以预期，在一个含标准PBS，5mMGSH且pH为6.0的模拟细胞内环境的溶液中孵育3h，Nano-MG可释放约90％的MG量(cargo)(图2J)，而在一个含标准PBS，5mMGSH且pH为7.4的模拟细胞内环境的溶液中孵育12h，Nano-MG通常能保持它们的完整性，且释放量小于10％(图2J)。总之，这些数据验证了的超分子金(I)-硫醇-多肽纳米复合物是一种能够作为细胞内递送释放多肽类产品(cargo)的稳定可行的平台。

4.Nano-MG促使MDMX降解和随后p53及p73的功能恢复

合成后的Nano-MG可促细胞内MDMX降解的能力，首先通过免疫印迹进行评估(图3A)。选择视网膜母细胞瘤细胞系WERI-Rb-1初步评估Nano-MG，考虑到对这种细胞系中存在过表达的MDMX和野生型状态(wild-typestatus)的p53以及p73。Nano-MG在体外下调了MDMX，稳定了p53和p73(图3A)。p53的一个下游靶点p21，也因响应Nano-MG而被显著下调(图3A)。

值得注意的是，稳定p53以及p73的Nano-MG的效力(potency)比利用同样方法通过MDMX-p53抑制剂^DPMI合成的Nano-^DPMI更加有效。为了进一步验证在MDMX在蛋白质水平上的降解以及消除转录的干扰，用核糖体抑制剂CHX对细胞预处理12h。用增加浓度的Nano-MG对WERI-Rb-1细胞进行48h的处理诱导MDMX水平的敲除，并且发现100nM能造成95％的MDMX最高降解浓度(图3B)。

此外，蛋白酶体抑制剂MG132和E2泛素化酶抑制剂PYR41，可以在一定程度上抑制MDMX的降解(图3B)，表明了Nano-MG以泛素依赖的方式降解MDMX。此外，通过RNA测序分析显示，和用PBS处理的WERI-Rb-1细胞相比，用Nano-MG处理24h后，能触发细胞转录水平的差异化改变(图3C)。发现对Nano-MG应答的776差异表达的基因，并且基因集合富集分析(GSEA)显示，p53调控的基因表达信号出现了一致且可重复的富集(图3D-F)。此外，Nano-MG处理的细胞中，最主要上调的通路涉及p73信号传导(signaling)(图3G)、凋亡(图3H)、细胞周期检查点(图3I)和细胞周期有丝分裂(图3J)。结果是，Nano-MG在体外显著抑制了WERI-Rb-1的增殖(图3K)，并诱导其凋亡(图3L)以及细胞周期停滞。更重要的是，相比于Nano-^DPMI，Nano-MG表现出了增强的抗癌活性(图3K和3L)。这些结果共同证明了，Nano-MG可以降解MDMX，并且在体外显示出了靶向p53和p73通路的活性。

5.Nano-MG抑制异种移植小鼠模型中的视网膜母细胞瘤

视网膜母细胞瘤是目前儿童原发性眼内恶性肿瘤中发病率最高的，它的出现不仅能够导致失明，还能够威胁患者年轻的生命。因此，它是一种检验Nano-MG的合适且有意义的眼内疾病模型。

将1×10⁵的WERI-Rb-1细胞植入Balb/c裸鼠单眼的视网膜下，以建立原位异种移植视网膜母细胞瘤小鼠模型(图4A)。将视网膜母细胞瘤荷瘤小鼠随机分到3组中(n＝3/组)：分别向玻璃体腔内注射盐水、Nano-MG、Nano-^DPMI进行治疗，如图4A。在第11天，可以发现，和对照相比，Nano-MG治疗可以明显阻碍视网膜母细胞瘤的进展(图4B)。同时，Nano-MG比Nano-^DPMI更有治疗效果(图4B)。这些结果进一步在H&E染色中被证实，被Nano-MG治疗后肿瘤区明显缩小，与对照和Nano-^DPMI处理后的形成了鲜明的对比(图4C)。

此外，细胞凋亡的TUNEL免疫荧光分析、细胞增殖的ki67免疫组化(IHC)检测结果进一步支持了这些结果(图4D)。在经Nano-MG治疗后的肿瘤中也发现了MDMX水平的明显下降(图4D)，表明了其在MDMX降解中的作用。p53和p73的恢复进一步验证了Nano-MG的抗癌活性以及机制(图4D)。而对老鼠用Nano-MG或者Nano-^DPMI的治疗并没有对其体重以及内脏的病理学形态上有引起明显改变，进一步表明了纳米粒子本身没有急性毒性。综上，这些数据都表明了Nano-MG能够通过降解MDMX，安全而有效地抑制视网膜母细胞瘤的发展。

6.Nano-MG治疗后可以从体内排出

可清除的纳米颗粒近来已成为一类新的工程纳米药物，可以有目的将载药递送到目标位点，同时脱靶的纳米颗粒和执行工作的纳米载体可以被快速通过肾脏排泄和/或单核巨噬系统(MPS)快速清除。这些纳米颗粒能够通过避免在健康组织或器官中非特异性积累，显示出了减弱全身毒性的巨大的潜力。这些纳米颗粒具有超小尺寸(＜6nm)，可以有效地在全身和/或局部给药后从体内排出。

Nano-MG可以响应细胞内还原环境而被分解成尺寸仅约5nm的超微纳米颗粒(图5A)，这在5mMGSH处理后的TEM图像(图5B)以及DLS结果中被充分证明。这种超微尺寸能够赋予Nano-MG跨血眼屏障的渗透性，在玻璃体腔注射后，用质谱监测(mass-spectrographicallymonitor)在老鼠中Nano-MG的动力学分布(disturbedkinematics)，用电感藕合等离子体质谱(ICP-MS)对组织和器官中的¹⁹⁷Au进行测定和定量。在眼内¹⁹⁷Au随着时间变化值用ID％表示，产生的代谢动力学，8h后可有超过70％的¹⁹⁷Au从眼内清除，到2w后被排空(图5C)。此外，注射2w后，在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺和脑子中也几乎检测不到任何¹⁹⁷Au(图5C)。值得注意的是，肝脏和脾脏是主要对¹⁹⁷Au进行代谢的(图5C)，意味着Nano-MG以MPS依赖性的方式排出的。综上，这些结果表明Nano-MG是一种可以清除的纳米颗粒。

7.经咪唑修饰后的Nano-MG进一步增加了肿瘤特异性积累

为了制备肿瘤微环境(TME)响应的纳米团簇，合成了聚丙烯酰基巯基咪唑(PSI)以包装Nano-MG。对于PSI的合成，首先将巯基咪唑与N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺基己酸酯反应生成N-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺巯基咪唑(图5D)。接下来，通过PAA的氨基与羧基荧光二乙酸琥珀酰亚胺酯的反应，将该活化的咪唑偶联到聚丙烯酰胺(PAA，MW20000Da)上(图5D)。产物PSI可以涂布在Nano-MG外部得到Nano-M[email protected]，这可以通过增加的流体动力学直径(图5E)和在pH7.4时减少的ZETA电位(图5F)来证明。

咪唑的解离常数(pKa)在6到7之间，因此在TME上，PSI处将会在pHe中进一步质子化。如预期的那样，[email protected]的ZETA电位可从pH7.4时的28mV变为pH6.0时的50mV。具有强正电荷的纳米颗粒可以将负电荷通过静电吸引到癌细胞膜，并且随后引发细胞的内化。与生理pH相比，在pH为6.5时，[email protected]可以增强癌细胞的内化作用(图5G)。这种pH响应的细胞内化作用将使[email protected]具有增强肿瘤蓄积的能力。

为了验证，用ICP-MS检测并定量了器官和肿瘤内的¹⁹⁷Au。在如图5H所示，两种纳米颗粒的生物学分别以每克组织或肿瘤的注射剂量百分比(ID％/g)表示。[email protected]预计在注射6h后肿瘤积累量增加。通过进一步分析这些¹⁹⁷Au分布，发现所有肿瘤和正常器官中[email protected]的比率都优于Nano-MG(图5I)，表明咪唑修饰进一步增加了Nano-MG在肿瘤特异性蓄积。

[email protected]诱导了胰腺癌在PDX模型中的逆转(regression)

数十年来，单细胞(monocellular)肿瘤异种移植的小鼠模型一直是肿瘤学研究的标准工具。然而越来越多的研究证实了单细胞肿瘤及其实际的肿瘤(actual tumor)在主要组织学(principalhistologic)、基因和微环境特征上存在很大差异。因此，PDX模型将从患者身上原发或者转移的肿瘤直接异种移植到严重联合免疫缺陷型小鼠上，在治疗筛选、生物标志物的发现、尤其是近十年来药物的临床前评估中越来越受欢迎。

为了进一步研究[email protected]的治疗功效，利用NOD/SCID小鼠负荷由手术切除的带有野生型p53和KRAS、APC、PI3KCA突变的残余肿瘤中取得的第一代高度恶性的胰腺癌PDX肿瘤，将[email protected]与Nano-^D[email protected]对肿瘤生长、肿瘤重量、肿瘤细胞凋亡和MDMX、p53、p21水平的影响进行了比较研究(图6A)。

当肿瘤体积达到100±25mm³时，老鼠被随机分为3组：每隔一天静脉注射PBS(对照)、Nano-MG和Nano-^DPMI。治疗10天后，对照组老鼠肿瘤体积增加了13倍以上，而1.5mg/kg多肽当量(equivalentdose)的[email protected]和Nano-^D[email protected]，分别抑制了85.7％和59.7％的肿瘤生长(图6B)。分离出的PDX肿瘤质量(图6C)和形态(image)(图6D)支持了[email protected]的超强抗癌活性。另外，不同治疗组残余肿瘤的脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)分析显示，与PDS或者Nano-^D[email protected]处理相比，[email protected]处理后会显著增加细胞凋亡(图6E)。

肿瘤组织切片的免疫组化染色显示，[email protected]处理的肿瘤组织中，MDMX的显著性下调(图6F)，p53(图6G)和p73(图6H)上调。另外，和假给药组(mock-treatedgroup)比，用[email protected]和Nano-^D[email protected]治疗的PDX鼠在体重、血生化指标(图6I)、内脏病例切片(图6J)上无统计学差异，表明了其安全性。综上，这些表明[email protected]在KRAS突变的胰腺癌中通过降解MDMX和随后恢复p53、p73的途径增强了治疗效果，同时也保持了高度有利的生物安全性。

尽管小分子衍生的PROTAC技术取得了重大的进步，由于多肽扩展了能利用其完成靶向蛋白质降解的E3连接酶和靶蛋白的配体范围，使多肽衍生的降解剂(degrader)在制药领域引起了很大关注。然而，多肽制剂(therapeutics)总是受累于其缺乏细胞通透性、抗蛋白水解(proteolyticresistance)以及目标位点积累(accumulationinthesiteofinterest)的能力。

本发明扩展了PROTAC技术，开发了靶向MDMX的多肽降解剂，并将其纳米工程化为针对过表达MDMX的恶性肿瘤有潜在候选药物能力的被命名为Nano-MG的金(I)-硫醇-多肽纳米复合物。

本发明得出的结论是：Nano-MG特异性地诱导了MDMX泛素依赖性降解，并随后恢复了p53和p73抗癌功能。Nano-MG在体外具有高抗视网膜母细胞瘤的活性，并且在体内，显示出了在玻璃体腔注射后，从生物体内快速排出的高度有利的可清除性。此外咪唑修饰后的Nano-MG在全身注射后，表现出了肿瘤特异性聚积并且能在具有KrasG12D突变的恶性胰腺癌PDX模型中有效地阻止肿瘤进展。牛奶外泌体包被(coating)使其实现了Nano-MG的口服用药，并随后在结肠癌的PDOX模型中能够显著抑制肿瘤生长。这些结果表明了，Nano-MG具有成为一种靶向MDMX的候选药物的潜力。值得注意的是，现有技术成功的能靶向MDM2-一种同样具有抑制p53、p73抗癌活性的MDMX同源蛋白的基于小分子的PROTACs；但能靶向MDMX或MDM2的基于多肽的PROTACs仅显示了有限的细胞和生物功能。因此，这项工作不仅填补了MDMX降解的空白，也将PROTAC技术扩展到了多肽领域。

本发明是一种在构建PROTAC分子上多肽和纳米技术的成功组合的应用，并且清楚地显示了的多肽衍生的纳米降解剂在靶向各种PPIs的潜能，本发明的策略将很容易扩展到其他多肽-蛋白质的相互作用上，极大地弥补了多肽与PROTACs之间的鸿沟。

综上，本发明不仅验证了MDMX降解是一种有前景的抗癌治疗的临床策略，更重要的是，提供一项将多肽衍生的PROTACs转变为一种有潜力的候选药物的可行性的方法，并且很有可能重振该类药物针对多种疾病“不可成药”靶点的成果。

值得注意的是，Nano-MG具有很高的装载效率，因为被装载的MG本身就是其中的构成要素之一。Nano-MG会通过降解MDMX，随后恢复p53以及p73的途径，在体外和体内表现出抗视网膜母细胞瘤的高活性，同时也显示出了其能在生物体内快速排泄的高度有利的可清除性能。此外，由于自身具有响应肿瘤微环境(TME)的电荷反转(chargereversal)性能，[email protected]可以有效地在含有KrasG12D突变的胰腺癌人源性肿瘤异种移植(PDX)模型中抑制肿瘤进展。包被了牛奶外泌体后的口服制剂[email protected]能显著有效地靶向并降解在结肠癌的人源性原位移植瘤模型(PDOX)中的MDMX。因此，本发明不仅验证了降解MDMX是一种有前途的抗肿瘤治疗的临床策略，更重要的是，提供了一种将多肽衍生的PROTACs转化为潜在的候选药物的可行方式，并且极有可能重振其在多种疾病中的发现成果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。