一种脂质体乳液的制备方法
阅读说明：本技术 一种脂质体乳液的制备方法 (Preparation method of liposome emulsion ) 是由 卢永杰 程路诗 张炽坚 张兵 江桦 关焕敏 艾勇 何廷刚 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及脂质体技术领域,尤其涉及一种脂质体乳液的制备方法。本发明公开了一种脂质体乳液的制备方法,该制备方法将磷脂、难溶性药物与水混合,得到悬浊液,在适当的温度下,通过高速剪切进行分散,磷脂和难溶性药物被粉碎,形成微米尺度。在微米尺度下,经长时间剪切,难溶性药物颗粒跟磷脂颗粒相互作用,发生乳化,并接着自组装形成微米级脂质体。该制备方法不使用有毒有害有机溶剂,生产过程安全环保,产品安全性高；制备设备和过程简单,且适合大规模生产,提高生产效率。(The invention relates to the technical field of liposome, in particular to a preparation method of liposome emulsion. The invention discloses a preparation method of liposome emulsion, which comprises the steps of mixing phospholipid, insoluble drugs and water to obtain suspension, dispersing at a proper temperature through high-speed shearing, and crushing the phospholipid and the insoluble drugs to form a micron scale. Under the micron scale, after long-time shearing, the insoluble drug particles and the phospholipid particles interact to emulsify, and then self-assemble to form the micron-scale liposome. The preparation method does not use toxic and harmful organic solvents, the production process is safe and environment-friendly, and the product safety is high; the preparation equipment and the process are simple, and the method is suitable for large-scale production and improves the production efficiency.)
技术领域
本发明涉及脂质体
技术领域
，尤其涉及一种脂质体乳液的制备方法。背景技术
近年来，脂质体的应用越来越备受关注，在生物医学、化妆品、保健食品等领域得到广泛的应用。
对于制备脂溶性药物脂质体的方法有很多，如：薄膜法、逆相蒸发法、注射法等，绝大部分的制备方法都涉及使用有机溶剂。有机溶剂的引入，可能会引起环境污染、产品溶剂残留等风险，直接影响产品的质量，因此在工业生产上需要进行严格的控制管理。并且，除薄膜法外，其他传统的脂质体制备方法一般不适宜大规模工业化生产，从而限制了脂质体在产业化的推广和应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种纳米脂质体乳剂的制备方法，该制备方法在不使用有机溶剂的情况下，能简单快速的制备得到脂溶性药物脂质体。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种纳米脂质体乳剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将磷脂、胆固醇、药物与水混合，形成悬浊液；所述药物包括脂溶性药物；所述水为去离子水、纯水或超纯水；
步骤2：将所述悬浊液在加热保温状态下进行高速剪切，得到乳液；
本发明将磷脂、难溶性药物与水混合，得到悬浊液，在适当的温度下，通过高速剪切进行分散，磷脂和难溶性药物被粉碎，形成微米尺度。在微米尺度下，经长时间剪切，难溶性药物颗粒跟磷脂颗粒相互作用，发生乳化，并接着自组装形成微米级脂质体。
本发明在制备脂溶性药物脂质体的过程中不使用有毒有害有机溶剂，生产过程安全环保，产品安全性高；制备设备和过程简单，且适合大规模生产，提高生产效率。
本发明步骤1中，所述脂溶性药物包括：光甘草定、神经酰胺、白藜芦醇和脂溶性维生素中的一种或两种以上。
所述磷脂包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酰胆碱、二棕榈酰磷酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上。
所述药物还包括：水溶性药物。所述水溶性药物包括透明质酸钠、纳米金属胶体分散液和水溶性维生素中的一种或两种以上。
步骤1所述进行混合前，还包括：加入表面活性剂。表面活性剂的加入可以促进脂溶性药物的增溶。
所述表面活性剂为离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂，其中阳离子表面活性剂包括季铵盐类，阴离子表面活性剂包括高级脂肪酸盐类或硫酸酯盐类，非离子表面活性剂包括吐温、司盘、PEG脂肪酸酯和聚甘油-10-硬肪酸酯中的一种或两种以上。
步骤1所述进行混合前，还包括：加入多元醇。多元醇的加入可以进一步促进部分脂溶性药物的溶解。光甘草定在多元醇中的溶解度较低。
所述多元醇包括甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇和异戊二醇的一种或多种。
本发明中，按质量百分数计，
磷脂2～15％；
药物0.01～5％；
胆固醇0～5％；
余量为水。
优选地，按质量百分数计，
磷脂2～10％；
药物0.01～4％；
胆固醇0～4％；
余量为水。
更优选地，按质量百分数计，
磷脂2～8％；
药物0.1～3％；
胆固醇0～3％；
当药物为脂溶性药物和水溶性药物时，本发明对两者的用量比不做具体限定。
本发明中，按重量百分数计，表面活性剂0.1～20％，优选为0.1～15％，更优选为0.1～8％；多元醇5～60％，优选为5～45％，更优选为5～30％。
本发明步骤2中，所述悬浊液的加热温度需达到磷脂的相变温度以上。所述加热的温度为50℃～100℃，优选为50～70℃；然后保持加热温度进行剪切，所述剪切采用剪切分散机；所述剪切的速率为8000～20000rpm(转子直径为13mm)，剪切的时间为30min以上，优选在8000～15000rpm(转子直径为13mm)的剪切速率下剪切60min以上，更优选剪切60～90min。经剪切后得到的脂质体为微米级。
纳米级别的脂质体分散性和稳定性较好，皮肤渗透性较佳。因此，本发明步骤2所述进行高速剪切后，还包括：高压均质。高压均质可以将微米级的脂质体进行粉碎细化得到纳米级脂质体。所述高压均质具体为：在400bar、600bar、800bar、1000bar压力下各循环2次或以上。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种纳米脂质体乳剂的制备方法，该制备方法将磷脂、难溶性药物与水混合，得到悬浊液，在适当的温度下，通过高速剪切进行分散，磷脂和难溶性药物被粉碎，形成微米尺度。在微米尺度下，经长时间剪切，难溶性药物颗粒跟磷脂颗粒相互作用，发生乳化，并接着自组装形成微米级脂质体。该制备方法仅通过机械剪切作用便将脂溶性药物溶解，具有意想不到的效果。此外，该制备方法不使用有毒有害有机溶剂，生产过程安全环保，产品安全性高；制备设备和过程简单，且适合大规模生产，提高生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图2为本发明实施例2步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图3为本发明实施例3步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图4为本发明实施例4步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图5为本发明实施例5步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图6为本发明实施例6步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图7为本发明实施例7步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图8为本发明实施例8步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图9为本发明实施例9步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图10为本发明实施例10步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图11为本发明实施例11步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图12为本发明实施例1步骤1获得的乳液中脂质体的平均粒径图；
图13为本发明实施例2步骤1获得的乳液中脂质体的平均粒径图；
图14为本发明实施例3步骤1获得的乳液中脂质体的平均粒径图；
图15为本发明实施例4步骤1获得的乳液中脂质体的平均粒径图；
图16为本发明实施例6中脂质体样品冷冻透射电镜图(左图的标尺为50nm，右图的标尺为100nm)；
图17为本发明实施例6中脂质体粒径分布图；
图18为本发明实施例6、实施例9和实施例10中步骤1在不同剪切时间下(剪切速率10000rpm，剪切温度50℃)获得的脂质体乳液的平均粒径图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中的试剂均为市购。
其中，实验型高速均质分散机：德国IKA公司。
实验型高压均质机：苏州ATS公司。
Zeta纳米粒度仪：英国马尔文公司。
试剂：
大豆卵磷脂：PC≥95％，Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
光甘草定：HPLC纯度≥90％，青海湖药业有限公司。
胆固醇：纯度＞96％，Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
聚甘油-10-硬脂酸酯：日光化学贸易(上海)有限公司。
丁二醇：纯度＞98％，日本大赛璐株式会社。
实施例1
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的光甘草定脂质体。
如图12所示，本实施例步骤(1)获得的乳液中的脂质体的粒径约为10～20微米之间，说明此时高速剪切样品未达到纳米级别，脂溶性药物被乳化并溶解在水中。
从图1可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例2
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的光甘草定脂质体。
从图2可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
如图13所示，本实施例步骤(1)获得的乳液中的脂质体的粒径约为4～10微米之间，说明此时高速剪切样品未达到纳米级别，脂溶性药物被乳化并溶解在水中。
实施例3
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的光甘草定脂质体。
从图3可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
如图14所示，本实施例步骤(1)获得的乳液中的脂质体的粒径约为4～8微米之间，说明此时高速剪切样品未达到纳米级别，脂溶性药物被乳化并溶解在水中。
实施例4
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的光甘草定脂质体。
从图4可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。如图15所示，本实施例步骤(1)获得的乳液中的脂质体的粒径约为4～10微米之间，说明此时高速剪切样品未达到纳米级别，脂溶性药物被乳化并溶解在水中。
实施例5
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的光甘草定脂质体。
从图5可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例6
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
从图6可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
从图16可以看出，光甘草定被成功包裹在脂质体内。
从图17可以看出，光甘草定脂质体的平均粒为78nm。
实施例7
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速8000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
从图7可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例8
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
从图8可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例9
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
从图9可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例10
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切90min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
从图10可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
从图18可以看出，随着剪切时间的增加，乳液中脂质体的粒径趋于平稳并维持在约5～6微米附近，说明此时高速剪切样品未达到纳米级别，且粒径较均匀，脂溶性药物被乳化并溶解在水中。
实施例11
本实施例为光甘草定脂质体的制备配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的光甘草定脂质体。
从图11可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
对比例1
本对比例为光甘草定脂质体的制备，配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇溶于甲醇-氯仿(62:38)，得到澄清透明溶液，旋转蒸发去除有机溶剂，得到薄膜。
(2)将步骤(1)得到的薄膜置于60℃的水浴中，搅拌下加入处方量的水和丁二醇混合溶液，得到粗的乳状液。将粗乳状液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到光甘草定脂质体。
对比例2
本对比例为光甘草定脂质体的制备，配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇溶于甲醇-氯仿(62:38)，得到澄清透明溶液，旋转蒸发去除有机溶剂，得到薄膜。
(2)将步骤(1)得到的薄膜置于60℃的水浴中，搅拌下加入处方量的水和丁二醇混合溶液，得到粗的乳状液。将粗乳状液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到光甘草定脂质体。
对比例3
本对比例为光甘草定脂质体的制备，配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速5000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
对比例4
本对比例为光甘草定脂质体的制备，配方见表2，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，30℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的光甘草定脂质体。
表1实施例1～4配方
(g)
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
大豆卵磷脂
15
8
2
5
胆固醇
5
3
0
1.5
光甘草定
5
3
0.1
0.5
水
75
86
97.9
93
表2实施例4～11和对比例1～4配方
试验例
使用PBS作为分散剂分散实施例1～11制得的光甘草定脂质体，使用Zeta纳米粒度仪测定平均粒径；采用超滤离心管分离包封和游离的光甘草定，使用HPLC检测光甘草定含量并计算包封率。测试结果表3和表4。
由表3～4的结果可知，实施例1～11均成功制得光甘草定脂质体。实施例5相比于对比例1、实施例6～10相比于对比例2制得的光甘草定脂质体在外观、平均粒径、光甘草定含量上基本无差异，说明实施例制得脂质体的效果不随工艺发生改变，可以替代传统制备方法。对比例3的脂质体制备方法制得的光甘草定脂质体在外观呈黄色浑浊状态，存在不溶颗粒；样品粒径较大，光甘草定药物包封率显著降低，说明只有在较低的剪切速度下，光甘草定等脂溶性药物难以与磷脂分子发生充分作用，导致粒径增大，包封率降低，降低脂质体制剂的品质。对比例4的脂质体制备方法制得的光甘草定脂质体在外观呈黄色浑浊状态，存在不溶颗粒；样品粒径较大，光甘草定药物包封率显著降低，说明当温度不足时，磷脂相未能充分转变为液晶相，光甘草定等脂溶性药物难以与磷脂分子发生充分作用，导致粒径增大，包封率降低，降低脂质体制剂的品质。
表3实施例1～4光甘草定脂质体的表征
表4实施例1～10和对比例1～4光甘草定脂质体的表征
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。