阅读说明：本技术 一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法 (Method for preparing indirubin by taking fresh leaves of kale as raw materials ) 是由 赵亮 刘兆宇 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法,属于天然产物提取领域,包括以下步骤：(1)浸泡工艺,(2)靛玉红合成,(3)靛玉红提取,(4)纯化,(5)精制。本发明通过设置浸泡条件：温度、加碱、通气、搅拌。30℃浸泡温度适宜微生物繁殖,有利于酶的生产和活性,促进马蓝鲜叶中靛前体物质苷键水解断键形成游离的吲哚酚。浸泡PH溶液调为7,使吲哚酚在碱性环境下异构成吲哚酮。通气搅拌使溶液中氧气含量增加,促进靛前体物质转化为生成靛玉红的中间体物质,可以提高靛玉红的提取率和纯度。(The invention relates to a method for preparing indirubin by taking fresh leaves of kale as a raw material, which belongs to the field of natural product extraction and comprises the following steps: (1) the method comprises the following steps of (1) soaking process, (2) indirubin synthesis, (3) indirubin extraction, (4) purification and (5) refining. The invention sets the soaking conditions as follows: temperature, adding alkali, aerating and stirring. The soaking temperature of 30 ℃ is suitable for microbial propagation, which is beneficial to the production and activity of enzyme and promotes the hydrolysis and bond breaking of the precursor substance glycoside bond of the indigo in the fresh leaves of the kalanchoe indica to form free indoxyl. The PH value of the soaked solution is adjusted to be 7, so that indoxyl is isomerized into indolone in an alkaline environment. The oxygen content in the solution is increased by aeration and stirring, the indirubin precursor is promoted to be converted into an intermediate substance for generating the indirubin, and the extraction rate and the purity of the indirubin can be improved.)

一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法。

背景技术

马蓝(Baphicacanthus cusia Brem)为爵床科马蓝属多年生草本植物,广泛分布于我国西南、华南及华东地区。马蓝根、茎、叶均可入药。其根和茎作为南板蓝根入药，干燥叶作为大青叶入药，既是临床上的常用中药，也是许多中成药的主要原料。靛玉红制备原料主要有马蓝、菘蓝、蓼蓝等“蓝”类植物，其中靛玉红在新鲜马蓝叶中的含量最高，同时马蓝茎叶含有大量靛前体物质一一吲哚苷或游离态的吲哚酚，由马蓝茎叶加工的成品靛蓝，靛玉红含量高，质量优于其它同类产品。

靛玉红是从中药青黛中分离出来的抗白血病的有效成分，为一双吲哚类抗肿瘤药物。靛玉红对多种移植性动物肿瘤有抑制作用，能破坏白血病细胞；靛玉红无论对动物移植性肿瘤还是人体肿瘤均显示一定治疗作用，能使变性坏死的细胞多呈肿胀、溶解性坏死。且靛玉红在临床治疗慢性粒细胞性白血病上，总有效率达90％以上，与临床首选药物马利兰疗效相当，疗效快，副作用小。目前国内用于研究的靛玉红有3中来源：即从中药大青叶、青黛中提取的天然产物，半合成、全合成的靛玉红。

靛玉红制备方法主要有：1>使用有机溶剂直接从原料大青叶中提取。马蓝越新鲜加工成青黛含靛蓝与靛玉红就越多,原料叶片在干燥、加热提取过程会造成靛玉红含量降低，且原料中的靛类前体物质不能转化为靛玉红。

2>新鲜茎叶原料发酵制备成青黛，再从青黛中分离提取靛玉红。制备青黛的方法传统，靛类前体物质大部分转化为靛蓝，青黛中靛玉红含量与叶片中含量相当。

3>半化学合成。在新鲜原料浆液添加转化靛玉红的另一种前体物质吲哚醌，使其与原料中的前体物质吲哚酚结合生成靛玉红。或是直接由靛蓝和吲哚醌合成靛玉红。反应需要化合物吲哚醌参与生成。

大量研究表明青黛的有效成分靛蓝、靛玉红并不完全是直接存在于植物体内,只有小部分靛蓝直接存在于植物体内,茎叶中含有大量靛蓝的前体物质一一吲哚苷或游离态的吲哚酚。青黛在加工浸泡过程中,靛苷中的苷键在微生物发酵作用下酶解断键形成游离的吲哚酚，吲哚酚在热水或碱性环境下异构成吲哚酮，最后两分子的吲哚酮在碱性条件下发生氧化缩合反应，形成靛蓝。

由成靛机制可知:吲哚酚自由基的生成由原浸泡液中的溶解氧供氧即可,但是进一步氧化生成的吲哚满二酮则需要外界额外供氧。因此,体系pH的控制与酶解时通氧与否是使反应生成何种靛的关键。若使产靛向着靛玉红方向进行,则在酶解过程中,通过通氧气、调高pH等手段促进吲哚满二酮的生成,若向着靛蓝方向进行,则应在酶解过程中控制氧气含量和体系pH,防止吲哚满二酮的生成,故体系含氧量和pH与生成何种靛密切相关。

通过控制适宜微生物繁殖浸泡温度，加速微生物发酵，促进吲哚酚的生成。通过控制体系PH和通氧量使靛前体更多转化为靛玉红方向。

发明内容

基于上述背景技术中的不足本发明拟公开一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红，增加靛玉红的提取效率。

本发明是通过以下工艺步骤来实现的：

一种以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法，包括以下步骤：(1)浸泡工艺，(2)靛玉红合成，(3)靛玉红提取，(4)纯化，(5)精制。所述的以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法，具体步骤为：

(1)浸泡工艺：将鲜叶置于pH为7的30℃去离子水中，其中水体积为鲜叶质量为30倍，通气，1小时搅拌一次，浸泡48h后，滤筛过滤除去叶渣；

(2)靛玉红合成：向滤液中加碱调节浸泡液pH至10.5，加热浸泡液至60度，同时通气搅拌1h，静止置冷；

(3)靛玉红提取：混浸泡液先于大滤网过滤除杂，过滤液再于超滤膜过滤，得靛玉红粗品；

(4)纯化：将步骤(3)得到的红棕色膏状靛玉红，加入3倍体积当量去离子水，加入盐酸使溶液呈酸性，控制pH3-4，置于温度设置为2-5℃的冰箱冷却沉淀，过滤，并将溶液回调为中性至弱碱性，将此滤液过大孔树脂柱，先用6倍量水洗至近无色，然后50％乙醇冲洗，最后用醋酸100％乙醇洗脱，将此洗脱液减压浓缩，得到靛玉红精品；

(5)精制：靛玉红精品于100％乙醇，加热溶解，旋转浓缩，缓慢降温，得靛玉红结晶。结晶用水冲洗，乙醇重结晶，得靛玉红纯品。作为优选，所述的以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法：

步骤(3)超滤膜的孔径为0.002μm。

作为优选，所述的以马蓝鲜叶为原料制备靛玉红的方法：步骤(4)中的大孔树脂过滤过程为：将的预处理了的D3520树脂装进500×10mm的玻璃柱，样品溶液过柱进行吸附，样品吸附完成后先用去离子水过柱冲洗样品中水溶性杂质，再用4BV量的50％乙醇过柱冲洗样品中脂溶性杂质，最后用6BV量100％乙醇3BV/h流速进行过柱洗脱样品，收集样品洗脱液。

本发明的有益效果

1、通过设置浸泡条件：温度、加碱、通气、搅拌。30℃浸泡温度适宜微生物繁殖，有利于酶的生产和活性，促进马蓝鲜叶中靛前体物质苷键水解断键形成游离的吲哚酚。

2、浸泡PH溶液调为7，使吲哚酚在碱性环境下异构成吲哚酮。通气搅拌使溶液中氧气含量增加，促进靛前体物质转化为生成靛玉红的中间体物质。

3、靛玉红合成：通气搅拌使溶液中氧气含量增加，促进靛玉红的生成。

4、在提取的过程中采用超滤膜结合大孔树脂进行提取：操作简单，简化工艺流程，提取效率高。纯化精制用乙醇，安全绿色，毒作用小。

具体实施方式

实施例1

不同氧量对提取粗品靛玉红的影响

称取四份1kg鲜叶置于pH为7的30℃自来水中，其中水体积位鲜叶质量为30倍。通气1小时搅拌一次(不通气搅拌)，浸泡48h后，滤筛过滤除去叶渣。向浸泡液中加NaOH调节滤液pH至10.5，再通空气1h后(不通气)，通气搅拌1h，静止置冷，混浸泡液先于大滤网过滤除杂，过滤液再于孔径为0.002μm的超滤膜过滤，得靛玉红粗品。RP-HPLC法测定粗品中靛玉红含量，具体数据见表1。

表1

优选发酵搅拌+打靛前通气。常规生产青黛中靛玉红含量与叶片中含量相当，青黛制备过程增加氧量，能促进靛前体定向转为靛玉红。

实施例2

PH对靛玉红的影响

称取3份1kg鲜叶置于pH分别为3.5、5.5、7的30℃自来水中，其中水体积位鲜叶质量为30倍。通气1小时搅拌一次，浸泡48h后，滤筛过滤除去叶渣。向浸泡液中加NaOH调节滤液pH至10.5，通气搅拌1h，静止置冷，混浸泡液先于大滤网过滤除杂，过滤液再于孔径为0.002μm的超滤膜过滤，得靛玉红膏体，分别称取膏体的重量，具体见下表。

表2

浸泡PH	靛玉红g/kg
		3.5	4.82
5.5	6.04
		7	6.21

实施例3

使用超滤膜

称取1kg鲜叶置于pH为7的30℃自来水中，其中水体积位鲜叶质量为30倍。通气1小时搅拌一次，浸泡48h后，滤筛过滤除去叶渣。向浸泡液中加NaOH调节滤液pH至10.5，再通空气1h后，通气搅拌1h，静止置冷，混浸泡液先于大滤网过滤除杂，过滤液再于孔径为0.002μm的超滤膜过滤，得靛玉红粗品，为靛玉红粗品54.25g，靛玉红含量为11.13％，靛玉红收率97％。

实施例4

未使用超滤膜的常规工艺

称取1kg鲜叶置于pH为7的30℃自来水中，其中水体积位鲜叶质量为30倍。通气1小时搅拌一次，浸泡48h后，滤筛过滤除去叶渣。向浸泡液中加NaOH调节滤液pH至10.5，再通空气1h后，加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，过滤取沉淀，滤液重过滤回收，沉淀加水混合后水飞除杂，得粗靛。靛膏加入4倍乙醇搅拌300W超声处理40min，过滤，滤渣再用乙醇提取两次合并三次滤液，旋转蒸发浓缩回收乙醇溶剂，达到一定浓度后加入与乙醇等量的蒸馏水。浓缩回收1/2的水后冷却过滤，得滤渣即为靛玉红粗品55.32g，靛玉红含量为8.68％，靛玉红收率89％。

超滤膜过滤比目前生产工艺简单，效率高。

实施例5

靛玉红的纯化

称取1kg鲜叶置于pH为7的30℃自来水中，其中水体积位鲜叶质量为30倍。通气1小时搅拌一次，浸泡48h后，滤筛过滤除去叶渣。向浸泡液中加NaOH调节滤液pH至10.5，再通空气1h后，通气搅拌1h，静止置冷，混浸泡液先于大滤网过滤除杂，过滤液再于孔径为0.002μm的超滤膜过滤，得靛玉红粗品。将已预处理的D3520树脂5g装进500×10mm的玻璃柱BV为30ml。将1kg马蓝鲜叶制备的靛蓝靛玉红粗品溶于乙醇，配成样品溶液，将3BV样品溶液以1BV/h流速流入层析柱进行吸附处理。吸附完成后用去离子水冲洗水溶性杂质，再用4BV50％乙醇冲洗脂溶性杂质，最后用6BV量100％乙醇3BV/h流速进行解离，收集洗脱液，旋转浓缩，得靛蓝靛玉红品湿重48.47g。

将上述得到靛玉红膏用80％乙醇加热溶解，于低温旋转浓缩，有红棕色晶体层析出，过滤水冲洗晶体，滤液洗液回收，加80％乙醇重结晶3次，得靛玉红结晶。最后得到靛玉红纯度高于97.3％，靛玉红回收率达78％。

纯化过程只使用无毒害乙醇做溶剂，未入如目前技术使用甲醇、二氯甲烷、氯仿等溶剂，成品绿色安全。