马蓝鲜叶连续制备青黛、靛蓝、靛玉红的方法
阅读说明：本技术 马蓝鲜叶连续制备青黛、靛蓝、靛玉红的方法 (Method for continuously preparing indigo naturalis, indigo and indirubin from fresh leaves of kale ) 是由 赵亮 刘兆宇 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：马蓝鲜叶连续制备青黛、靛蓝、靛玉红的方法,其特征在于,由以下步骤组成：(1)青黛制备；(2)青黛中提取靛蓝、靛玉红；(3)靛蓝、靛玉红粗品除杂；(4)靛蓝、靛玉红分离纯化；(5)靛蓝衍生物食用靛蓝制备。通过对叶柄、马蓝老枝浸泡液预处理,提前使马蓝叶内微生物增殖能缩短马蓝鲜叶浸泡时间,提前处理浸泡液能缩短青黛生产周期,及提高青黛转化率,通气搅拌使溶液中氧气含量增加,促进靛前体物质转化为生成靛蓝、靛玉红的中间体,增加靛蓝靛玉红的含量,利用NaOH调节PH可以减少碳酸钙的用量,便于青黛后期除杂纯化,提高青黛得率。(The method for continuously preparing indigo naturalis, indigo and indirubin from fresh leaves of kale is characterized by comprising the following steps: (1) preparing indigo naturalis; (2) extracting indigo and indirubin from indigo naturalis; (3) removing impurities from crude indigo and indirubin products; (4) separating and purifying the indigo and the indirubin; (5) indigo derivatives are prepared from edible indigo. Through pretreatment of a petiole and a Chinese cabbage old branch soaking solution, microbial proliferation in a Chinese cabbage leaf can be shortened through the pretreatment, the Chinese cabbage fresh leaf soaking time can be shortened through the pretreatment of the petiole and the Chinese cabbage old branch soaking solution, the natural indigo production period can be shortened through the pretreatment of the Chinese cabbage old branch soaking solution, the natural indigo conversion rate can be improved through the pretreatment of the Chinese cabbage fresh leaf soaking solution, the oxygen content in the solution is increased through aeration and stirring, the indigo precursor substance is promoted to be converted into an intermediate for generating the natural indigo and the indirubin, the content of the indigotin indirubin is increased, the use amount of calcium carbonate can be reduced through the regulation of PH.)
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种以马蓝鲜叶为原料制备靛蓝的方法。
背景技术
马蓝(Baphicacanthus cusia Brem)为爵床科马蓝属多年生草本植物,广泛分布于我国西南、华南及华东地区。马蓝根、茎、叶均可入药，其茎叶主要加工成一种深蓝色的粉末作为中药入药称为青黛，性寒，味咸，亦具有清热解毒、凉血、定惊功效。靛蓝(Indigo)和靛玉红(Indirubin)为青黛的有效成分,其中靛蓝广泛用于染料，食用色素，且对肝有一定的保护作用。靛玉红是我国从中草药青黛中发现的一种对慢性粒细胞白血病(慢粒)有治疗作用的新型双吲哚类抗肿瘤药物，为我国首创的新型结构的抗白血病药物。
青黛、靛蓝、靛玉红制备原料主要有马蓝、菘蓝、蓼蓝等“蓝”类植物，其中靛玉红在新鲜马蓝叶中的含量最高，同时马蓝茎叶含有大量靛前体物质一一吲哚苷或游离态的吲哚酚，由马蓝茎叶加工的成品靛蓝，靛玉红含量高，质量优于其它同类产品。
青黛，中药名。为爵床酬科植物马蓝、蓼科植物蓼蓝、十字花科植物菘蓝的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末、团块或颗粒。具清热解毒、凉血消斑，泻火定惊等作用，在古代亦常用于印染布匹、画眉等。主产于福建、云南、江苏等地。性味咸寒，有清热解毒，凉血消斑，泻火定惊等功效。其主要用于温病热盛，斑疹，吐血、咯血，咽痛口疮，小儿惊痫，疮肿，丹毒，蛇虫咬伤等。青黛由“蓝”加工制成,在上千年的应用历史中,积累了大量而丰富的加工及应用经验,青黛靛蓝逐渐由染料发展为药用,而“蓝”也由制青的原料发展为制靛的原料。青黛的传统炮制主要包括浸泡、打靛、精制等三环节，其炮制过程主要是将蓝类植物新鲜叶或茎叶中的吲哚苷、靛红烷B等前体物质转化为靛蓝、靛玉红等有效成分。
靛玉红是从中药青黛中分离出来的抗白血病的有效成分，为一双吲哚类抗肿瘤药物。靛玉红对多种移植性动物肿瘤有抑制作用，能破坏白血病细胞；靛玉红无论对动物移植性肿瘤还是人体肿瘤均显示一定治疗作用，能使变性坏死的细胞多呈肿胀、溶解性坏死。且靛玉红在临床治疗慢性粒细胞性白血病上，总有效率达90％以上，与临床首选药物马利兰疗效相当，疗效快，副作用小。目前国内用于研究的靛玉红有3中来源：即从中药大青叶、青黛中提取的天然产物，半合成、全合成的靛玉红。
靛蓝，是中药青黛主要成分，具有抗炎保肝护肝作用。靛蓝类色素是人类所知最古老的色素之一，最早从蓝草类植物提取，为水溶性非偶氮类着色剂，并以其磺酸钠盐或其铝化的形式等用作食用色素，广泛用于食品、医药和印染工业。靛蓝最初是从植物中提取，后来发展为化学合成制备。植物提取的方法为：将靛叶堆积，经常浇水，使其发酵2～3个月，成为黑色土块状。用臼捣实后称为球靛，含靛蓝色素2％～10％。球靛中拌入木灰、石灰及麸皮，再加水拌和，加热至30～40℃，暴露在空气中，成为蓝色不溶性靛蓝，收率低。化学合成制备靛蓝的方法污染环境且有潜在的致癌风险，因此用植物制备靛蓝具有较高的发展前景。
发明内容
基于上述背景技术中的不足，本发明拟公开一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛、靛蓝和靛玉红的方法，增加马蓝综合利用率，提高生产效益。
马蓝，为爵床科灌木状多年生草本植物，其根、茎、叶均可入药。其中，马蓝的鲜叶可用于制备青黛，青黛主要有效成分是靛蓝、靛玉红，但是靛蓝、靛玉红并不完全是直接存在于马蓝植物体内,只有小部分靛蓝直接存在于植物体内,茎叶中含有大量靛蓝、靛玉红的前体物质-吲哚苷或游离态的吲哚酚。控制马蓝鲜叶浸泡PH、温度、浸泡液体积量，氧量等，促进靛前体物质定向转化为靛蓝、靛玉红，提高青黛中靛蓝、靛玉红的产量。
制备高产优质青黛后，采用超声辅助提取法用乙醇从青黛中提取靛蓝靛玉红，乙醇提取剂便宜、安全、环保、易回收，超声辅助提取法操作快速、简单、高效。未提取充分的青黛废渣璜化用于制备食用靛蓝，减让浪费，提高综合利用率。
采用本发明是通过以下工艺步骤来实现的：
马蓝鲜叶连续制备青黛、靛蓝、靛玉红的方法，由以下步骤组成：(1)青黛制备；(2)青黛中提取靛蓝、靛玉红；(3)靛蓝、靛玉红粗品除杂；(4)靛蓝、靛玉红分离纯化；(5)靛蓝衍生物食用靛蓝制备。所述的马蓝鲜叶为原料连续性制备青黛、靛蓝、靛玉红的方法，具体步骤为：
(1)青黛制备：称取新鲜马蓝叶，切制成1cm长度的小段，冲洗干净后置于干净器皿，加20倍量的清水，30℃浸泡48h，浸泡发酵完成后，浸泡液先通过10目的筛网，然后再通过40目的筛网滤过除杂，称取原料6％重量的石灰，加适量水搅拌均匀成石灰乳，加入浸泡液中，置于磁力搅拌器中搅拌40min，冷藏静置沉淀24h，倒出滤液，得粗靛，将粗靛加水调制成浓度为2.5％粗靛浆，滤膜过滤后1000r/min离心脱水，60℃干燥10h，直到水分含量小于7.0％，粉碎过100目筛，即得；
(2)青黛中提取靛蓝、靛玉红：取青黛成品，加入4倍质量当量95％乙醇搅拌，超声波处理30min，抽滤，提取三次，合并三次滤液，旋转蒸发浓缩回收乙醇溶剂，浓缩至原体积1/3，后加入与乙醇等量的蒸馏水，浓缩回收1/2的水后冷却过滤，滤渣即为靛蓝、靛玉红粗品；
(3)靛蓝、靛玉红粗品除杂：取上述提取靛蓝、靛玉红的烘干滤渣，加6倍重量当量95％乙醇提取，提取完毕倒出溶液，减压浓缩，回收乙醇，得红棕色膏状物，加入3倍量水，加入盐酸使溶液呈酸性，pH值为3-4，冷藏静置沉淀24h，过滤，并将溶液回调为弱碱性PH 7-9，将此滤液过大孔树脂柱，先用6倍量水洗至近无色，然后用乙酸乙酯、乙醇洗脱，将此洗脱液减压浓缩。
(4)靛蓝、靛玉红分离纯化层析柱分离纯化：将粗品靛蓝、靛玉红与粉末等量的碱性氧化铝混合拌匀，将粉末10倍重量当量的氧化铝装柱，加样后上层覆盖1CM厚氧化铝，上层加塞一层脱脂棉。。先以乙酸乙酯：80％乙醇＝3:1展开，分离出蓝、紫红色两个色带，当展开剂第一滴流出时，收集蓝色带，即为靛蓝，收集完蓝色色带后改用100％乙醇：乙酸乙酯＝3:2洗脱，流速1.5d/s，收集紫红色色带。将收集蓝色洗脱液、紫红色洗脱液减压浓缩，用甲乙醇重结晶，减压过滤，回收乙醇，用少量水冲洗掉一些杂质，干燥得蓝色结晶即为靛蓝，紫红色结晶即为靛玉红；
(5)靛蓝衍生物食用靛蓝制备：称取靛蓝、靛玉红提取时抽滤的滤渣烘干粉碎，将细粉加入2-3倍量细粉的浓硫酸中，加热搅拌1h，冷却后加入10倍浓硫酸量的水稀释，加入碳酸氢钠将pH值调节至4，加入12％氯化钠盐析，缓慢搅拌全部溶解后静置30min，过滤，滤渣水清洗，烘干即得食用靛蓝。
作为优选，所述的马蓝鲜叶为原料制备靛蓝的方法，步骤(1)中所述浸泡液pH为3.5，所述发酵过程为微氧发酵，氧含量控制为20％。作为优选，所述步骤(1)打靛工艺为用强碱氢氧化钠或氢氧化钾调浸泡液pH至10.5，加热液至60℃，通气搅拌40min。
作为优选，所述步骤(2)从青黛成品中提取靛蓝靛玉红，采用超声辅助提取提取法，青黛中加入4倍青黛体积量的95％乙醇，搅拌均匀，250W超声处理30min，过滤，滤渣用95％乙醇重提取，超声辅助提取三次。
本发明的有益效果
(1)青黛制备过程简单，成本低，青黛产量高，同时靛蓝、靛玉红含量较高。
(2)食用靛蓝的生产，变废为用，增加效益，减少浪费。
(3)整个工艺流程简单，一体化，连续化，综合利用率高，青黛、靛蓝、靛玉红制备得率较高。而且把提取过程产生的未能提取残留于废渣的靛蓝磺化生产食用靛蓝，变废为宝。
具体实施方式
实施例1
称取新鲜马蓝叶1kg，切制成1cm左右的段，冲洗干净后置于干净器皿。加30倍量的清水，30℃浸泡48h，2小时搅拌一次，发酵一段时间后，浸泡液先通过10目的筛网，然后再通过40目的筛网滤过除杂。称取6％石灰，加适量水搅拌均匀成石灰乳，加入浸泡液中。置于搅拌器中通气搅拌40min，冷藏静置沉淀24h，倒出滤液(留用检测回收)，得粗靛。将粗靛加水调制成浓度为2.5％粗靛浆，滤膜过滤(1000r/min离心)脱水，60℃干燥10h(水分不超过7.0％)，粉碎过100目筛，即得青黛225.46g,靛蓝、靛玉红含量分别为7.31％、1.68％。
实施例2
称取实施例1中方法制取一定量的青黛成品500g，加入4倍量95％乙醇搅拌，超声波处理30min，抽滤(滤渣保留另存制备食用靛蓝)，提取三次。合并三次滤液，旋转蒸发浓缩回收乙醇溶剂，达到一定浓度后加入与乙醇等量的蒸馏水。浓缩回收1/2的水后冷却过滤，滤渣即为靛蓝、靛玉红粗品89.36g,靛蓝、靛玉红含量分别为35.84％、12.69％。
层析柱分离纯化：将粗品靛蓝、靛玉红与适量碱性氧化铝混合拌匀，将相当于粉末10倍量的氧化铝装柱，加样后上层覆盖少量氧化铝，加少量脱脂棉。先以乙酸乙酯：80％乙醇＝3:1展开，分离出蓝、紫红色两个色带。当展开剂第一滴流出时，收集蓝色带，即为靛蓝。收集完蓝色色带后改用100％乙醇：乙酸乙酯＝3:2洗脱，流速1.5d/s，收集紫红色色带。将收集蓝色洗脱液、紫红色洗脱液减压浓缩，用甲乙醇重结晶，减压过滤，回收乙醇，用少量水冲洗掉一些杂质，干燥得蓝色结晶和紫红色结晶。得靛蓝28g,靛蓝纯度为97.5％。得靛玉红8g,纯度高于98％。
实施例3
1kg马蓝鲜叶按实施例1中方法制备青黛后，收集用乙醇从青黛中提取靛蓝、靛玉红时抽滤的滤渣，烘干滤渣粉碎，将细粉加入一定量的浓硫酸中，加热搅拌1h，冷却后加入10倍浓硫酸量的水稀释，加入碳酸氢钠将pH值调节至4，加入12％氯化钠盐析，缓慢搅拌全部溶解后静置30min，过滤，滤渣水清洗3遍，烘干最后得食用靛蓝12g,纯度为98％。
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