一种用于富集糖肽的磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备方法
阅读说明：本技术 一种用于富集糖肽的磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备方法 (Preparation method of magnetic amphiphilic metal organic framework material for enriching glycopeptides ) 是由 苏萍 王震 李梦 宋佳一 杨屹 于 2021-05-17 设计创作，主要内容包括：一种用于富集糖肽的磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备方法,属于蛋白质及多肽富集领域。本发明步骤：首先合成羟基化的Fe-3O-4@SiO-2磁性纳米粒子；然后通过Zr～(4+)与羟基之间的络合作用将UiO-66-NH-2生长在Fe-3O-4@SiO-2纳米粒子表面；最后通过植酸替换UiO-66-NH-2中部分配体的方式对其进行后合成修饰,得到磁性双亲水性金属有机骨架材料。基于植酸的超高的亲水性以及MOFs中剩余配体的亲水性,材料表现出双亲水性可用于糖肽的富集。本发明的磁性双亲水性金属有机骨架材料制备简单、糖肽富集效率高、灵敏度优异、易于从反应体系中分离、且具有良好的重复使用性,在实际样的检测中也得到了较好的效果。(A preparation method of a magnetic amphiphilic metal organic framework material for enriching glycopeptides belongs to the field of protein and polypeptide enrichment. The method comprises the following steps: first of all hydroxylated Fe is synthesized 3 O 4 @SiO 2 Magnetic nanoparticles; then passing through Zr 4+ Complexation with hydroxyl groups will be UiO-66-NH 2 Grown on Fe 3 O 4 @SiO 2 The surface of the nanoparticle; finally replacing UiO-66-NH by phytic acid 2 And carrying out post-synthesis modification on the ligand in a way of partial ligand to obtain the magnetic amphiphilic metal organic framework material. Ultra-high hydrophilicity based on phytic acid and hydrophilicity of residual ligands in MOFsThe material shows that the double hydrophilicity can be used for enriching glycopeptides. The magnetic amphiphilic metal organic framework material disclosed by the invention is simple to prepare, high in glycopeptide enrichment efficiency, excellent in sensitivity, easy to separate from a reaction system, and good in reusability, and has a good effect in detection of an actual sample.)
技术领域
本发明属于蛋白质及多肽富集
技术领域
，具体涉及一种富集糖肽的磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备和应用。背景技术
糖基化是蛋白质最基本和重要的翻译后修饰之一，与细胞生长、识别、通讯等多种生理过程息息相关。因此，在各种疾病尤其是癌症的发生发展过程中，往往伴随着糖基化的异常变化，比如支链N-聚糖的表达增加和末端唾液酸聚糖的异常表达等。而目前美国食品药品监督管理局发布的大多数肿瘤标志物也均为糖蛋白。因此，研究蛋白质的糖基化具有重大的生物学研究意义。现今基于生物质谱的糖蛋白研究策略主要有两种，即“自上而下”法(Top-down)和“自下而上”法(Bottom-up)，但由于“自上而下”法研究的主要对象为完整的糖蛋白，其分离富集十分困难，因此“自下而上”法在糖蛋白分析领域应用更广，主要先将糖蛋白酶解成肽段，再对其中的糖肽进行质谱分析。但由于酶解后的混合物中糖肽的含量一般仅占总体的2-5％，一些非糖肽、脂质、无机盐会对糖肽的分析鉴定产生巨大干扰。因此，在进行质谱分析之前，对糖肽的分离富集是十分必要的。
目前，对糖肽的分离富集方法主要有酰肼化学法、凝集素亲和作用法、硼酸亲和法以及亲水相互作用法等。其中，亲水相互作用法由于其富集条件温和、通用性强、在富集之后不会损失糖链结构和重现性好等诸多优点，在糖肽富集领域应用最广。而金属有机骨架材料(MOFs)作为一种具有大比表面积的多孔材料，在分离富集方面具有天然优势，其中部分金属有机骨架材料配体含有亲水基团本身便可用于富集糖肽，但由于配体的亲水基团有限，对糖肽的富集效率较低，所以需要对金属有机骨架材料进行一些合后合成改性提高其亲水性。同时，近年来磁分离技术在分离富集领域应用很广，能够依靠外部磁场将材料用体系中分离出来简化整个富集流程。因此，通过后合成改性的方式制备一种具有超高亲水性的磁性金属有机骨架材料来实现糖肽的高效富集是本领域仍需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是制备一种能够用于糖肽富集的磁性双亲水性金属有机骨架材料的方法，以克服金属有机骨架材料本身亲水性有限使得富集糖肽效率较低的缺点。同时该材料还具有良好的磁性，能够凭借磁场将材料从体系中分离，简化糖肽富集流程，更方便其重复使用。本发明的磁性双亲水性金属有机骨架材料制备简单、条件温和、对糖肽的富集效率高、重复使用性好，且易于从反应体系中分离出来。
该发明首先通过溶胶凝胶法合成Fe3O4@SiO2，将其表面羟基化之后将UiO-66-NH2修饰在磁性载体表面，然后将植酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、与上述材料共同孵育，凭借植酸与Zr4+之间的络合作用替换部分原始配体，得到具有双亲水性的磁性金属有机骨架材料。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:
一种用于富集糖肽的磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取Fe3O4纳米粒子1.0g于三口烧瓶中，加入50mL去离子水和150mL无水乙醇并超声15min使之分散均匀。然后加入5mL NH3·H2O在碱性条件下反应10min。最后滴入2mL原硅酸四乙基酯和50mL无水乙醇的混合溶液，并在常温下搅拌8h。在超声辅助下通过以下步骤对得到Fe3O4@SiO2的进行洗涤：水(2次，每次用量100mL，时间5min，除NH3·H2O)、1M HCl溶液(3次，每次用量50mL，时间5min，羟基化)、水(4次，每次用量100mL，时间5min，除酸)、乙醇(1次，100mL，5min，方便溶剂挥发)。之后在60℃真空烘箱中烘6h，得到Fe3O4@SiO2纳米粒子。
(2)称取Fe3O4@SiO2纳米粒子0.20g，ZrCl4 0.489g，2-氨基对苯二甲酸0.380g于45mL DMF溶剂中并分散均匀，并在120℃油浴中搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离所得产物，并用DMF和无水乙醇在超声辅助下依次洗涤三次(每次DMF和无水乙醇的用量为100mL，时间为5min)，之后在60℃真空烘箱中烘6h。
(3)称取MUiO-66-NH2 0.15g，PVP 0.3g使之分散于30mL无水乙醇中，并在室温下搅拌60min。然后加入植酸乙醇溶液(v/v，1/40)20mL，并在室温下搅拌6h。反应结束后，将得到的产物用去离子水和无水乙醇在超声辅助下依次洗涤三次(每次去离子水和无水乙醇的用量为100mL，时间为5min)，之后置于60℃真空烘箱中烘6h，得到所需的磁性双亲水性金属有机骨架材料MUiO-66-NH2/PA。
进一步，上述步骤(1)中所描述的原硅酸四乙基酯与无水乙醇的体积比为1:25。
进一步，步骤(1)中使用1M HCl溶液进行洗涤的目的是将表面暴露的Si羟基化，使得在进行UiO-66-NH2修饰时可以先将Zr4+与羟基发生络合作用，进而将UiO-66-NH2长在Fe3O4@SiO2表面。
进一步，上述步骤(2)中采取2-氨基对苯二甲酸与对苯二甲酸相比，羧基邻位的氨基使得MOFs本身的亲水性更高，对糖肽富集也更具优势。
进一步，上述步骤(3)中MUiO-66-NH2与PVP的质量比为1:2。
采取上述进一步添加PVP的作用和必要性在于其可以保护MUiO-66-NH2的晶体结构，使其不易坍塌。
进一步，步骤(3)中所用植酸乙醇溶液的配制方式为：将植酸水溶液(50％)在超声辅助下边搅拌边滴加入到无水乙醇中，植酸水溶液(50％)与乙醇的体积比为1:40。
进一步，发明的磁性双亲水性金属有机骨架材料保持了良好的磁饱和强度，在磁场的控制下易于从反应体系中分离。
本发明的优点在于：
(1)该材料依靠修饰的植酸和MOFs中残余配体的2-氨基对苯二甲酸表现出的双亲水性用于富集糖肽。这种方法进行糖肽富集时反应条件温和、富集前后不会损失糖肽的糖基化信息，具有较高的通用性。
(2)MOFs本身即具有较高的稳定性，用植酸替换配体后合成修饰之后，使得此材料的稳定性进一步增加，在较强酸的环境中依然能够保持稳定的结构。
(3)植酸通过替换配体的方式对材料进行后合成修饰，而不是直接接枝在MOFs表面，这种方式不会堵塞MOFs的孔道。研究发现，在植酸修饰之后材料的孔径基本保持不变，但孔容增大，比表面积有所增加，这更有助于将材料用在糖肽富集领域。
(4)与其他糖肽富集材料相比，本发明制备的磁性双亲水性金属有机骨架材料在磁场的控制下易于从反映体系中分离，可大大简化糖肽富集流程，并显著提高材料的重复使用性。
(5)本发明可成功应用于人血清酶解液中糖肽的富集鉴定，其也可广泛应用于不同基质中糖肽的富集，是一种通用的糖肽富集材料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：应用磁性双亲水性金属有机骨架材料富集HRP和IgG酶解液中的糖肽
(1)磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备过程
(a)Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备过程：称取Fe3O4纳米粒子1.0g于三口烧瓶中，加入50mL去离子水和150mL无水乙醇并超声15min使之分散均匀。然后加入5mL NH3·H2O在碱性条件下反应10min。最后滴入2mL原硅酸四乙基酯和50mL无水乙醇的混合溶液，并在常温下搅拌8h。在超声辅助下通过以下步骤对得到Fe3O4@SiO2的进行洗涤：水(2次，每次用量100mL，时间5min，除NH3·H2O)、1M HCl溶液(3次，每次用量50mL，时间5min，羟基化)、水(4次，每次用量100mL，时间5min，除酸)、乙醇(1次，100mL，5min，方便溶剂挥发)。之后在60℃真空烘箱中烘6h，得到Fe3O4@SiO2纳米粒子。
(b)MUiO-66-NH2的制备过程：称取Fe3O4@SiO2纳米粒子0.20g，ZrCl40.489g，2-氨基对苯二甲酸0.380g于45mL DMF溶剂中并分散均匀，并在120℃油浴中搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离所得产物，并用DMF和无水乙醇在超声辅助下依次洗涤三次(每次DMF和无水乙醇的用量为100mL，时间为5min)，之后在60℃真空烘箱中烘6h。
(c)MUiO-66-NH2/PA的制备过程：称取MUiO-66-NH2 0.15g，PVP 0.3g使之分散于30mL无水乙醇中，并在室温下搅拌60min。然后加入植酸乙醇溶液(v/v，1/40)20mL，并在室温下搅拌6h。反应结束后，将得到的产物用去离子水和无水乙醇在超声辅助下依次洗涤三次(每次去离子水和无水乙醇的用量为100mL，时间为5min)，得到所需的磁性双亲水性金属有机骨架材料MUiO-66-NH2/PA。
(2)HRP(IgG)酶解液的制备过程：称取1mg HRP(IgG)溶于400μL含有8M尿素的变性缓冲液(50mM NH4HCO3)中。加入200mM的DTT 10μL，并在56℃水浴中加热50min，待降至室温后，加入400mM的IAA 10μL，在30℃摇床中烷基化50min。随后，将反应混合物用50mM NH4HCO3水溶液稀释至5mL，加入胰蛋白酶(w/w＝1:25)在37℃下孵育18h。酶解完成后，加入2μL甲酸溶液将反应体系调至酸性终止酶解，将最后得到的肽段混合物置于-20℃冰箱中冷冻保存待用。
(3)MUiO-66-NH2/PA制备过程中植酸含量的确定
(a)在MUiO-66-NH2/PA的制备过程中，植酸的含量对材料的富集效果尤为重要，植酸含量的增加能够提高材料的亲水性，使其糖肽富集性能增加，但过多植酸会使MOFs材料的结构崩塌，导致糖肽富集性能的降低。首先配制植酸乙醇溶液：将2mL植酸水溶液(50％)在超声辅助下滴加到80mL无水乙醇中。
(b)在MUiO-66-NH2/PA的制备过程中，分别制备植酸乙醇溶液加入量为5、10、15、20和25mL条件下的MUiO-66-NH2/PA。然后分别称取各个合成条件下的磁性材料1mg并均匀分散在含有20μL HRP酶解液的上样缓冲液(200μL，ACN/TFA＝99:1，v/v)中(均作三组平行)，将此混合物涡旋35min；然后用磁铁分离材料，弃去上层液体。依次用200μL清洗缓冲液(ACN/H2O/TFA＝90:9:1，v/v/v)将所得产物清洗三次除去表面的非特异性吸附；最后用20μL洗脱液(H2O/TFA＝99:1，v/v)将得到的MUiO-66-NH2/PA涡旋10分钟。收集的洗脱液直接通过MALDI-TOF-MS进行检测。结果表明：当植酸乙醇溶液的加入量从5mL增加到20mL时，所能富集出糖肽种类相应增加，当植酸乙醇溶液加入量为20mL时，所能富集出的糖肽种类最多，共有21种。但当植酸乙醇溶液的量增加到25mL时，所能富集出糖肽的数量减少，仅富集出18种糖肽，并且非糖肽峰的信号有所增强。这说明，当植酸乙醇溶液的量为20mL时，对糖肽的富集效果最好。
(4)用于富集HRP酶解液中糖肽：称取制备的磁性材料MUiO-66-NH2/PA1mg并均匀分散在含有20μL HRP酶解液的上样缓冲液(200μL，ACN/TFA＝99:1，v/v)中，并将混合物涡旋35min；然后用磁铁分离材料，弃去上层液体。依次用200μL清洗缓冲液(ACN/H2O/TFA＝90:9:1，v/v/v)将所得产物清洗三次除去表面的非特异性吸附；最后用20μL洗脱液(H2O/TFA＝99:1，v/v)将得到的MUiO-66-NH2/PA涡旋10分钟。将得到含有糖肽的洗脱液直接作MALDI-TOF-MS分析(共作三组平行试验)。同时，将HRP酶解液直接用作MALDI-TOF-MS检测作为对比实验。结果表明：当HRP酶解液直接用作MALDI-TOF-MS检测时，几乎看不到糖肽信号。当用MUiO-66-NH2/PA进行糖肽富集后，能够富集出21种糖肽，并且所得到糖肽的信号也大大增强，这表明发明的MUiO-66-NH2/PA对HRP酶解液中糖肽具有优异的富集效果。
(5)用于富集IgG酶解液中糖肽：称取制备的磁性材料MUiO-66-NH2/PA1mg并均匀分散在含有20μL IgG酶解液的上样缓冲液(200μL，ACN/TFA＝99:1，v/v)中，并将混合物涡旋35min；然后用磁铁分离材料，弃去上层液体。依次用200μL清洗缓冲液(ACN/H2O/TFA＝90:9:1，v/v/v)将所得产物清洗三次除去表面的非特异性吸附；最后用20μL洗脱液(H2O/TFA＝99:1，v/v)将得到的MUiO-66-NH2/PA涡旋10分钟。将得到含有糖肽的洗脱液直接作MALDI-TOF-MS分析(共作三组平行试验)。同时，将IgG酶解液直接用作MALDI-TOF-MS检测作为对比实验。结果表明：当IgG酶解液直接用作MALDI-TOF-MS检测时，几乎看不到糖肽信号。当用MUiO-66-NH2/PA进行糖肽富集后，能够富集出34种糖肽，并且所得到糖肽的信号也大大增强，这表明MUiO-66-NH2/PA对IgG酶解液中糖肽也具有优异的富集效果。
(6)磁性双亲水性金属有机骨架材料灵敏度的考察：在实际复杂生物样本中，糖蛋白酶解之后糖肽的数量较少，通常仅占肽段混合物的2％–5％。因此，只有达到足够低的检出限，才能够满足实际的分析检测需求。为了考察MUiO-66-NH2/PA富集糖肽的灵敏度，先用去离子水将步骤(2)中HRP酶解液用去离子水分别稀释90倍、450倍和4500倍，分别得到浓度为到50、10和1fmol/μL的HRP酶解液。然后称取制备的磁性材料MUiO-66-NH2/PA(1mg×3)并均匀分散在200μL上样缓冲液(ACN/TFA＝99:1，v/v)中，之后分别加入浓度为50、10和1fmol/μL的HRP酶解液20μL，并将混合物涡旋35min；然后用磁铁分离材料，弃去上层液体。依次用200μL清洗缓冲液(ACN/H2O/TFA＝90:9:1，v/v/v)将所得产物清洗三次除去表面的非特异性吸附；最后用20μL洗脱液(H2O/TFA＝99:1，v/v)将得到的MUiO-66-NH2/PA涡旋10分钟。将得到含有糖肽的洗脱液直接作MALDI-TOF-MS分析。(每个HRP酶解液浓度均作三组平行试验)。结果表明：HRP酶解液浓度为50fmol/μL时，MUiO-66-NH2/PA能够富集出13种糖肽，5fmol/μL时能够富集出7种糖肽。即使浓度降至1fmol/μL，仍然可以检测出4种信噪比较高的糖肽信号，说明MUiO-66-NH2/PA富集糖肽时表现出较高的灵敏度。
(7)磁性双亲水性金属有机骨架材料重复使用性的考察：
(a)糖肽的富集过程：称取制备的磁性材料MUiO-66-NH2/PA 1mg并均匀分散在含有20μL HRP酶解液的上样缓冲液(200μL，ACN/TFA＝99:1，v/v)中，并将混合物涡旋35min；然后用磁铁分离材料，弃去上层液体。依次用200μL清洗缓冲液(ACN/H2O/TFA＝90:9:1，v/v/v)将所得产物清洗三次除去表面的非特异性吸附；最后用20μL洗脱液(H2O/TFA＝99:1，v/v)将得到的MUiO-66-NH2/PA涡旋10分钟。将得到含有糖肽的洗脱液直接作MALDI-TOF-MS分析。作三组平行实验。
(b)用磁铁收集(a)中洗脱液中的磁性材料MUiO-66-NH2/PA，分别用200μL洗脱液(TFA/ACN＝99:1，v/v)和200μL上样液(ACN/TFA＝99:1，v/v)在涡旋条件下清洗10min，弃去上清液后，再用作下一循环中富集HRP酶解液中糖肽的富集。此过程共循环5次，每次得到的洗脱液均用作MALDI-TOF-MS分析。
(c)磁性复合材料MUiO-66-NH2/PA具有良好的磁响应性，可利用磁铁将其从溶液中快速分离，更方便其进行重复使用。经考察，本发明制备的磁性双亲水性金属有机骨架材料具有很好的重复使用性。重复使用5次后富集出糖肽的个数没有减少，特征糖肽信号的平均信噪比仍可达到初始水平的90％以上；与其他封装多酶体系相比，本发明制备的磁性双亲水性金属有机骨架材料在磁场控制下易于从反应体系中分离，重复使用性及易回收的优势明显。
实施例2：磁性双亲水性金属有机骨架材料用于人血清酶解液中糖肽的富集
(1)磁性双亲水性金属有机骨架材料MUiO-66-NH2/PA的制备过程：同实施例1中(1)。
(2)人血清酶解液的制备：首先将10μL混合人血清用含有8M尿素的变性缓冲液(50mM NH4HCO3)稀释到100μL。之后分别用二硫苏糖醇(DTT，5μL，200mM)和碘代乙酰胺(IAA，20μL，400mM)处理上述混合物。随后将反应混合物用50mM NH4HCO3水溶液稀释至1mL，并加入胰蛋白酶(w/w＝1:25)在37℃下孵育18h。酶解完成后，加入2μL甲酸溶液将溶液调为酸性终止酶解，并置于-20℃冰箱中冷冻保存待用。
(3)称取制备的磁性材料MUiO-66-NH2/PA 1mg并均匀分散在含有20μL糖肽人血清酶解液的上样缓冲液(200μL，ACN/TFA＝99:1，v/v)中，并将混合物涡旋35min；然后用磁铁分离材料，弃去上层液体。依次用200μL清洗缓冲液(ACN/H2O/TFA＝90:9:1，v/v/v)将所得产物清洗三次除去表面的非特异性吸附；最后用20μL洗脱液(H2O/TFA＝99:1，v/v)将得到的MUiO-66-NH2/PA涡旋10分钟。得到的洗脱液置于-20℃冰箱中冷冻保存待用。
(4)将(3)中溶液于冷冻干燥机中冻干后，重新溶于17μL去离子水中，并加入10×GlycoBuffer 2缓冲液(2μL)和PNGase F糖苷酶(1μL)。在37℃摇床中孵育18h后，所得的酶解液直接用LC-MS进行检测。
(5)将得到的结果利用搜库软件搜索并筛选出可靠的糖肽信息。一共鉴定出101种糖肽，归属于48个不同的糖蛋白中，磁性复合材料MUiO-66-NH2/PA对能够用于复杂实际样本中糖肽的富集，在糖肽富集领域有着广阔的应用前景。