一种烟草包衣种子活力的检测方法
阅读说明：本技术 一种烟草包衣种子活力的检测方法 (Method for detecting activity of tobacco coated seeds ) 是由 周向平 胡日生 杨全柳 彭曙光 肖钦之 王锡春 麻浩 李清 刘卉 张洪波 于 2021-01-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种烟草包衣种子活力的检测方法。在对不同烟草品种包衣种子以及同一烟草品种不同包衣种子批的活力进行检测时,对需要检测的包衣种子首先进行低温胁迫试验,之后再进行标准发芽试验；与此同时对包衣种子处理和标准发芽过程中的萌发指标、活力指标以及生理指标进行测定,并通过对这些指标进行综合分析判断包衣种子活力的高低。本方法简便易操作,对试验条件要求简单,且能准确的鉴定出不同烟草品种包衣种子以及同一烟草品种不同包衣种子批的活力,可为后续的烟草育苗以及优质高效生产提供保障。(The invention discloses a method for detecting the activity of tobacco coated seeds. When the vitality of different coated seeds of different tobacco varieties and different coated seed batches of the same tobacco variety is detected, firstly, a low-temperature stress test is carried out on the coated seeds to be detected, and then, a standard germination test is carried out; meanwhile, the germination index, the vitality index and the physiological index in the coating seed treatment and standard germination processes are measured, and the vitality of the coating seeds is judged by comprehensively analyzing the indexes. The method is simple and easy to operate, has simple requirements on test conditions, can accurately identify the coated seeds of different tobacco varieties and the vitality of different coated seed batches of the same tobacco variety, and can provide guarantee for subsequent tobacco seedling culture and high-quality and high-efficiency production.)
技术领域
本发明涉及一种烟草包衣种子活力的检测方法，属于种子质量检测领域。
背景技术
“一粒种子可以改变一个世界”。烟草种子是烟叶生产中特殊的、不可替代的生产资料，是优良品种的载体。优良的烟草种子可以提高播种品质和幼苗素质、从而提高烟叶的产量、品质，达到增加经济效益的目的。种子活力对烟草的实际生产有至关重要的作用，高活力种子适于早播，缩短种子萌发，有利于烟草种子避开低温发芽时期，进一步的缩短种子的苗期生长时间；同时由于高活力种子具有抵御不良环境条件的优点，在干旱条件下将高活力种子进行深播，有利于吸水且具有足够的顶土能力，而低活力种子在深播的条件下无力顶出土面；高活力的种子成苗率高，能减少播种量，低活力种子不仅田间出苗率低，而且往往苗期缺苗断垄，因此高活力种子不仅节约用种，更节省了人工成本，省时省工。实验室条件下对烟草种子活力的测定方式已经非常全面且普遍，但在实际生产中，通过人工加速老化的方法筛选和鉴定烟草裸种的种子活力的方法，仍未得到大面积的推广和使用，而针对烟草包衣种种子活力的测定方法更是少之又少，因此有必要建立科学、实用的烟草包衣种子活力的检测方法，准确的预估其在低温的环境中的萌发和生长状况，这对于烟草实际生产具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足，提供一种烟草包衣种子活力的检测方法，能准确的鉴定出不同烟草品种包衣种子以及同一烟草品种不同包衣种子批的活力高低。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种烟草包衣种子活力的检测方法，其特征在于对烟草品种包衣种子，取样在14℃～18℃，湿度100％，光照11～13h、黑暗11～13h条件下进行低温胁迫试验，设置3～5个重复；胁迫6～8天后，转到24℃～25℃，湿度90％～100％，光照11～13h、黑暗11～13h条件下，进行6～8天的标准发芽试验，使其一共生长14～16天，同时对包衣种子发芽过程中的萌发指标、活力指标以及生理指标进行测定，并通过对这些指标进行综合分析判断包衣种子活力的高低。
进一步，对萌发14～16天期间以及14～16天后的幼苗的萌发指标、活力指标以及生理指标进行测定和计算方法如下：
(1)萌发指标：从放入包衣种子起至第14～16天终止，统计发芽包衣种子粒数占供试包衣种子总数的百分率，记为发芽率；从开始试验放入包衣种子后的第7或8天(属于标准发芽期间)，统计发芽包衣种子粒数占供试包衣种子总数的百分率，记为发芽势；发芽第14～16天，取50株幼苗用自来水冲洗干净，吸干表面水分后在80℃下烘干至恒重后称量，精确到mg，取平均值，记为干重(S)；随机取10个正常生长的幼苗，用直尺分别测幼苗全长(cm)，取平均值，记为芽长；
(2)活力指标：GI＝∑(Gt/DT)，其中GI为发芽指数，式中Gt为第t天的发芽数，Dt为发芽日数。VI＝S×GI，其中VI为活力指数，GI为发芽指数，S为幼苗干重(mg/株)。MGT＝∑(Gt×Tt)/∑Gt。其中MGT为平均发芽时间，Gt是时间Tt中新发芽包衣种子的数量；
(3)生理指标：
过氧化物歧化酶(SOD)酶活力测定：
①称取生长14～16天后的包衣种子幼苗0.500g(W样品)于已经过灭菌处理的研磨管中，分别加入2mL提前经过预冷处理的磷酸缓冲液(50mmol/L，pH 7.8)，并迅速研磨成匀浆(冰上进行)，继续加入磷酸缓冲液至终体积为5mL，于4℃条件下10000rpm离心15min，小心吸取管中上清液至另一个新的1.5mL离心管，量其体积(VT)后作为SOD粗酶液备用；
②取7支质地相同、透明度较好的5mL试管，其中3支作为测定管，4支为对照管(其中3支为最大光还原管，另一支为参比管)，按表1依次加入所有溶液或试剂；
③充分混匀所有反应体系后，将1支对照管置于暗处，其他各管(另3支对照管作为最大光还原管)置于4000lux光照下反应20min；
④遮住试管，以终止反应。以不照光的对照管做参比，分别在560nm波长下测定其他各管的吸光度值(A)；
⑤结果计算：
已知SOD活性单位以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50％为一个酶活单位(Unit，U)表示，按下列公式计算SOD活性：
注：VQ为测定时样品用量(mL)；
表1 SOD活性测定反应体系
丙二醛(MDA)含量的测定：
①称取对照组和各处理的生长14～16天后的包衣种子幼苗新鲜叶片各0.500g于已预冷的研钵中，加入5mL三氯乙酸(TCA，5％)后立即进行研磨，待研磨充分，将该匀浆转移至另一个新的离心管中，室温，离心10min(5000rpm)；
②小心吸取2mL上清液，加入等体积浓度为0.67％的硫代巴比妥酸(TBA)(用10％三氯乙酸配制)，混匀完全后进行沸水浴，持续30min，待其冷却后离心；
③利用分光光度计，分别测定每管在450nm、532nm和600nm处的吸光度，计算MDA含量(μmol g-1·鲜重)：
MDA含量(μmol g-1·鲜重)＝6.45×(A532–A600)–0.56×A450
(4)对测定的相关指标进行方差分析，通过差异水平综合判断该烟草品种包衣种子活力的高低。
进一步对发芽培养皿中的水分控制，培养皿中不能见明水，但也不能使滤纸变干。
进一步用于包衣的裸种生产过程、裸种的品质以及包衣过程均符合GB/T 2138—2019《烟草种子》国家标准中对包衣种的发芽率≥92％，含水量≤3％，单籽率≥98％，有籽率≥99％，裂解度≥99％，粒径符合度≥95％，抗压强度符合度≥90％的要求。
本方法可以应用于对不同烟草品种包衣种子以及同一烟草品种不同包衣种子批的活力检测。
本发明检测方法至少具有如下有益效果：
对烟草包衣种子活力检测的方法较少，不能较好的区分不同包衣种子的活力，导致部分包衣种出苗慢、出苗差、浪费人力物力最终影响经济效益。针对这一问题，本发明提出了(1)一种在低温条件下检测烟草包衣种子活力的方法，可以准确地鉴定出不同烟草品种包衣种子以及同一烟草品种不同包衣种子批的活力(活力的高低)，从而保障烟草包衣种萌发、齐苗壮苗，提高产量和品质；(2)本方法在不测定生理指标情况下，仅只需要冰箱和发芽箱就能进行，因此特别适合基层进行烟草包衣种的活力鉴定；(3)本发明方法简单、可操作性强、成本低，无环境污染。
具体实施方式
实施例1：
1、供试烟草品种及其包衣种子：采用两种包衣材料包衣的湘烟5号包衣种子，均由湖南省永州市烟草技术中心提供，A为湘烟5号采用滑石粉作为包衣剂的包衣种子，B为湘烟5号采用以凹凸棒粉为主要粉料的包衣种子；湘烟5号为湖南永州的当地品种，能较好的适应当地的生产环境，但面对低温条件时生长较为缓慢。
2、对湘烟5号包衣种子进行低温胁迫处理，在温度为16℃的条件下胁迫处理7天后转到24℃条件下进行标准发芽试验7天。
3、实验处理
2019年10月20日开始布种，在每个培养皿中放入湿润的滤纸，然后在滤纸上均匀的放上100粒包衣种子，然后放入16℃、湿度100％、光照12小时、黑暗12小时的光照培养胁迫处理中，记录好放入时间，第二天开始记录逐日发芽数。2019年10月27日，将光照培养箱的温度调整为24℃，其余条件不变，继续培养并记录相关数据。2019年11月3日，将培养皿取出，测定萌发指标(表2)、活力指标(表2)以及生理指标(表3)等，并进行方差分析。
4、实验结果分析：
烟草品种湘烟5号包衣种子B的发芽指数、芽长、干重、SOD活性、活力指数等指标显著(P<0.05)高于包衣种子A，而MDA含量显著(P<0.05)低于包衣种子A，说明湘烟5号包衣种子B的活力显著高于包衣种子A。表明采用本发明方法能较好的判别湘烟5号不同类型包衣种子活力的高低。
表2湘烟5号不同类型包衣种子的萌发指标和活力指标
注：干重为50株幼苗的平均干重，LSD＝0.05
表3湘烟5号不同类型包衣种子的生理指标
实施例2：
1、供试烟草品种及其包衣种子：采用烟草品种GX-8两种种子批的包衣种子，均由湖南省永州市烟草技术中心提供。A为GX-8一个种子批的包衣种子，B为GX-8另一个种子批的包衣种子。GX-8为湖南永州的当地品种，能较好的适应当地的生产环境，但面对低温条件时生长较为缓慢
2、对两个种子批的GX-8包衣种子进行低温发芽处理，在温度为16℃的条件下胁迫处理7天后转到24℃条件下标准发芽试验7天。
3、实验处理过程：
2019年10月20日开始布种，在每个培养皿中放入湿润的滤纸，然后在滤纸上均匀的放上100粒包衣种种子，然后放入16℃、湿度100％、光照12小时、黑暗12小时的光照培养中，记录好放入时间，第二天开始记录逐日发芽数。2019年10月27日，将光照培养箱的温度调整为24℃，其余条件不变，继续培养并记录相关数据。2019年11月3日，将培养皿取出，测定萌发指标(表4)、活力指标(表4)以及生理指标(表5)等，并进行方差分析。
4、实验结果分析：
烟草品种GX-8包衣种子B的发芽率、发芽势、发芽指数、芽长、干重、SOD活性、活力指数等指标显著(P<0.05)高于包衣种子A，而MDA含量显著(P<0.05)低于包衣种子A，说明GX-8包衣种子B的活力显著高于包衣种子A。表明采用本发明方法能较好的判别GX-8不同种子批的包衣种子活力的高低。
表4 GX-8不同种子批包衣种的萌发指标和活力指标
注：干重为50株幼苗的平均干重，LSD＝0.05
表5 GX-8不同种子批包衣种子的生理指标
在上述两个实施例中，
(1)萌发指标：从试验开始放入包衣种子起至第14天终止，统计发芽包衣种子粒数占供试包衣种子总数的百分率，记为发芽率；从试验开始放入包衣种子后的第8天，统计发芽包衣种子粒数占供试包衣种子总数的百分率，记为发芽势；发芽第14天，取50株幼苗用自来水冲洗干净，吸干表面水分后在80℃下烘干至恒重后称量，精确到mg，取平均值，记为干重(S)；随机取10个正常生长的幼苗，用直尺分别测幼苗全长(cm)，取平均值，记为芽长；
(2)活力指标：GI＝∑(Gt/DT)，其中GI为发芽指数，式中Gt为第t天的发芽数，Dt为发芽日数。VI＝S×GI，其中VI为活力指数，GI为发芽指数，S为幼苗干重(mg/株)。MGT＝∑(Gt×Tt)/∑Gt。其中MGT为平均发芽时间，Gt是时间Tt中新发芽包衣种子的数量；
(3)生理指标：
过氧化物歧化酶(SOD)酶活力测定：
①称取生长14天后的包衣种子幼苗0.500g(W样品)于已经过灭菌处理的研磨管中，分别加入2mL提前经过预冷处理的磷酸缓冲液(50mmol/L，pH 7.8)，并迅速研磨成匀浆(冰上进行)，继续加入磷酸缓冲液至终体积为5mL，于4℃条件下10000rpm离心15min，小心吸取管中上清液至另一个新的1.5mL离心管，量其体积(VT)后作为SOD粗酶液备用；
②取7支质地相同、透明度较好的5mL试管，其中3支作为测定管，4支为对照管(其中3支为最大光还原管，另一支为参比管)，按表1依次加入所有溶液或试剂；
③充分混匀所有反应体系后，将1支对照管置于暗处，其他各管(另3支对照管作为最大光还原管)置于4000lux光照下反应20min；
④遮住试管，以终止反应。以不照光的对照管做参比，分别在560nm波长下测定其他各管的吸光度值(A)；
⑤结果计算：
已知SOD活性单位以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50％为一个酶活单位(Unit，U)表示，按下列公式计算SOD活性：
注：VQ为测定时样品用量(mL)；
表1 SOD活性测定反应体系
丙二醛(MDA)含量的测定：
①称取对照组和各处理的生长14天后的包衣种子幼苗新鲜叶片各0.500g于已预冷的研钵中，加入5mL三氯乙酸(TCA，5％)后立即进行研磨，待研磨充分，将该匀浆转移至另一个新的离心管中，室温，离心10min(5000rpm)；
②小心吸取2mL上清液，加入等体积浓度为0.67％的硫代巴比妥酸(TBA)(用10％三氯乙酸配制)，混匀完全后进行沸水浴，持续30min，待其冷却后离心；
③利用分光光度计，分别测定每管在450nm、532nm和600nm处的吸光度，计算MDA含量(μmol g-1·鲜重)：
MDA含量(μmol g-1·鲜重)＝6.45×(A532–A600)–0.56×A450
(4)对测定的相关指标进行方差分析，通过差异水平综合判断该烟草品种包衣种子活力的高低。
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明专利原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明专利的保护范围。
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