具体实施方式

本发明提供了用于防治或治理由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号小种(Foc TR4)引起的香蕉镰刀菌枯萎病的方法和组合物。一般而言，这些方法涉及将包括茶树油的组合物施用于香蕉植株或植株的生长介质。

目前已发现茶树油(TTO)能够保护香蕉植株免受真菌病原体Foc TR4的损害。因此，根据本发明的组合物能够在植株感染真菌之前或之后有效地充当天然杀菌剂。虽然本说明书具体提到了TTO，这是这方面的黄金标准，但技术人员将理解，TTO的组成部分，包括其成分和/或不同比例的成分，对真菌也具有不同程度的效力。因此，每当提及“TTO”时，应将其理解为还包括本领域公知的包括TTO成分，以及还包括选自下表1中所列成分的组合物：

表1

发明人惊讶地发现，将包括TTO的组合物喷洒在香蕉叶片上能有效地抑制土壤中产生的Foc TR4病原菌，即使组合物与病原菌之间没有直接接触。

还发现，通过喷洒、灌溉、浇灌或任何这些施用方式组合的方式施用TTO的各种溶液或组合物，均可有效地控制FocTR4在香蕉植株中诱发的枯萎病。

在一个方面中，本发明提供了一种治理或防治由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号小种(Foc TR4)引起的香蕉植株镰刀菌枯萎病的方法，其包括将包括茶树油(TTO)的组合物施用于植株、其一部分(例如，施用于叶片或透过土壤施用于根部)或植株的生长介质。

在本发明一些实施方式中，在病害侵染的初期阶段施用TTO组合物，从而在实验室、温室、苗圃或田间进行初步控制。经发现，初期治理可以防止枯萎病发展。

本发明方法允许在病害发展之前或在病害症状首次出现时施用包括TTO的组合物。有利的是，还发现根据本发明的TTO组合物在真菌枯萎病定植后也能有效控制枯萎病。更具体地说，结果表明，本发明方法可抑制严重程度达100％的病害。

术语“控制枯萎病”是指减少香蕉宿主植株上病害的严重程度、发病率或症状。该术语还包含抑制病害的病原菌，即真菌病原体Foc TR4。

除非另有说明，否则本文所用的术语“治理”包括植株的预防性治理和治疗性治理两种。应当理解，预防性治理包括防止FocTR4感染以及延迟这种感染的发生，治疗性治理包括抑制或消灭现有的真菌以及延迟或防止现有感染的恶化。

本发明提供了一种包括TTO的组合物，其中基于组合物的总重量，TTO浓度为约5％至约70％(重量百分比)。

除活性剂外，根据本发明的组合物可包含任何合适的溶剂、表面活性剂、乳化剂以及中和剂。一般而言，根据本发明的组合物可包括5％至70％按重量计的活性剂TTO，40％至95％的溶剂、0％至10％的表面活性剂、0％至10％的中和剂和0％至50％的乳化剂。

具体地说，本发明所包含的TTO为无毒乳液，例如，油包水乳液或水包油乳液。

根据一个实施例方式，用于治理香蕉的TTO组合物为油包水乳液，其中基于处理体积的总重量，所施用的TTO浓度为0.05ppm至500ppm(w/w)。在一些实施方式中，当施用于田间时，例如通过喷洒或浇灌土壤时，所述组合物中的TTO的含量为50ppm至500ppm。在其他实施方式中，其中将包括TTO的组合物施用于生长介质中，TTO浓度为0.05ppm至0.2ppm。发现包括这种浓度TTO的组合物可以完全消除真菌枯萎病或减轻真菌枯萎病的严重程度，而不会在治理的组织中引起植株毒性。相反，用生长培养基配制浓度高于0.2ppm的TTO，并用于治理在组织培养中生长的植株时，植株表现出毒性症状。

值得注意的是，本发明的方法包括施用包括少量TTO的组合物，其中TTO的量足以在经治理的香蕉植株中诱导产生有益作用。

本发明的方法包括以任何频率(例如，每三天、每周一次、每月一次或每年一次)将包括TTO的组合物施用于待治理的香蕉植株。或者，可以只治理植株一次。根据一个具体实施方式，在不同的天数通过额外施用以作补充治理。在另一实施方式中，香蕉植株本身未经治理，并种植于在种植前暴露于包括TTO的组合物的介质或土壤中。在另一实施方式中，在种植香蕉之前用包括TTO的组合物治理介质或土壤，随后将包括TTO的组合物施用于植株、植株组织、植株部分、生长介质或土壤。

根据本发明，在香蕉组织或植株生命周期的任何阶段，包括组织培养、株苗在硬化前或硬化后、营养生长、开花和结果，将包括TTO的组合物施用于香蕉组织或植株。

因此，本发明的方法包括将TTO组合物施用于香蕉植株的任何部分或部位，包括叶片或根部，在种植前施用于分生组织，或施用于植株生长或将要种植植株的介质(例如土壤)。

根据本发明的包括TTO的组合物以液体溶液的形式通过浇灌土壤、空中灌溉或滴流灌溉、或叶面喷洒等方式施用。在具体实施方式中，将包括TTO的组合物直接施用于土壤或组织培养生长培养基。该组合物可进一步包括任何额外可接受的物质，包括但不限于肥料、杀虫剂、农药和/或抗微生物剂。

用于将有效量的包括TTO的组合物施用于土壤的典型装置包括重力流式施用器，例如凿、齿或柄型施用器；商用喷洒器、雾化器、曝气机、喷枪、低压管道；粉碎机等也可提供作为有用的施用器。灌溉装置，例如滴灌器、微型喷洒器、灌溉管、喷雾器等都是有用的施用器。在本发明方法中有用的其他输送方法包括封装、微封装或任何商用的流动材料的控制释放技术。

根据本发明TTO在有机农业和常规农业中的应用代表了在帮助控制由Foc TR4引起的枯萎病的发生和发展方面的一个重要步骤。

根据本发明可治理的植株为Musa acuminate组成员，通常称为卡文迪什(Cavendish)组香蕉。该组是最为重要的香蕉培育品种，也是香蕉栽培中最易受到FocTR4侵染的，给香蕉种植者造成了重大损害和经济损失。属于卡文迪什组的香蕉，如Nanica、和Grand Nain被认为对Foc真菌的1号和2号小种具有高度抗性，但对4号小种高度敏感。因此，本发明特别有益于治理和防治与该真菌病原体相关的枯萎病。本发明的方法和组合物也适用于其他品种对Foc-TR4的防治和治理，包括但不限于大麦克香蕉(Gros-Michel)、Silk、Pome、粉蕉(Pisang-awak)、饭蕉(Plantain)和东非高地香蕉(EAHB)。

目前，香蕉的商业化营养繁殖是以组织培养的方式进行的，由于组织培养确保了生产得到的是无病原种植材料，因此将组织培养作为优选的方法。营养繁殖的优点包括保留所需的性状，因为后代在遗传上是相同的，并且有利于培育不能产生可育性种子的作物，如香蕉。此外，可以在特定香蕉基因中引入点突变，以提高对诸如FocTR4等病原菌的抗性。通过组织培养生产香蕉植株的方法为本领域技术人员所周知。

本文所用的术语“营养繁殖”是指从香蕉植株的营养器官(如茎、根和叶)生产香蕉植株。在营养繁殖中，从母株分离出一部分并使其独立生长。

根据本发明的一个具体实施方式，通过体外诱变获得香蕉营养繁殖材料(即植株的一部分)或待治理的株苗，以改善植株特性。因此，本发明的方法和组合物包括对香蕉组织培养物进行治理，以控制香蕉植株将来暴露于Foc TR4下。

植株生长培养基是任何可接受的用于香蕉营养繁殖的组织培养基。合适培养基的非限制性示例是Murashige和Skoog(MSO)培养基。

应当注意，可以使用根据本发明包括TTO的组合物对植株进行任何所需时间段的治理。

现将参考具体实施例和材料来描述本发明。以下实施例以举例说明的方式进一步描述了本发明，而并不旨在以任何方式限制本发明。

实施例

材料与方法

香蕉植株

组织培养繁殖：从供体“卡文迪什”香蕉植株的球茎基部移去分生组织(即芽的主动生长光学部分)，进行表面消毒，置于人工营养培养基上启动培养。在无菌且受控的实验室环境中，经启动的组织能够生长和繁殖数倍。香蕉株苗从实验室放到气候受控的温室中适应环境，然后在1公升的盆中种植8至12周，以完成硬化过程。在硬化期结束时，植株处于4-5叶期，具有发达的根系。

在温室进行试验的情况下，如下所述，在接种病原菌后，将植株转移到有利于病害发展的区域。

在香蕉种植园进行的试验包括在“热点”(即土壤高度感染Foc TR4的地区)种植的幼植株(6到8片叶子)。从育苗期(种植前)到收获期，根据相应的施用剂量和频率对这些植株进行试验性治理。植株接受所有必要的栽培和生产处理，包括施肥、控制杂草和钻头以及采摘树叶和清理落叶。

尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号小种(Foc TR4)

使用含1*10⁶孢子/mL的Foc TR4分生孢子悬浮液。接种方法是用铁锹创伤植株根部，然后施用200mL 1*10⁶孢子/mL的Foc TR4。

TTO治理

TTO组合物的治理由喷洒或浇灌土壤组成。对照植株用水处理，并保持与经治理植株相同的条件。

实施例1：

组合物A和B

组合物A含有23.8％w/w的活性成分茶树油，将其配制成可乳化浓缩物。

组合物B含有10％w/w的活性成分茶树油，将其配制成可乳化浓缩物。

实施例2：

组合物A在体外对尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号小种(FocTR4)的影响

在实验室进行体外试验是为了研究溶解于水中的3种稀释度的组合物A对在培养皿上的FocTR4的抑制和径向生长的影响。每种治理重复5次。

表2：组合物A对FocTR4的径向生长和抑制率百分比的影响。

*在同一列中带有不同字母的平均值具有显著性差异，根据Tukeys HSD检验，p<0.05。

结果表明，20ml/L和30ml/L的组合物A能完全抑制FocTR4的生长，孵育3、5和7天后抑制率为100％，径向生长为零。采用可接受的杀菌剂苯扎氯铵(Gentrol)作为阳性对照，上述结果与苯扎氯铵在30ml/L下的结果相当。组合物A的结果与未经治理的对照组具有显著性差异。

实施例3：

组合物A对在温室和田间的卡文迪什香蕉中由FocTR4引起的镰刀菌枯萎病的影响

本试验的目的是确定组合物A对在温室和田间的卡文迪什植株受到FocTR4侵袭是否具有积极效果。

本试验将香蕉幼苗(离体期后3～4个月)种植在温室，接种FocTR4，用组合物A治理，并评定枯萎病发病率。

香蕉突变体(200)是对品种“GAL”(耐Foc-TR4卡文迪什香蕉)的突变体进行硬化处理后选出的，证明了其对Foc-TR4具有一定耐受性。在接种Foc TR4之前或之后，用0.2％或0.4％组合物A通过叶面喷洒、土壤灌溉或两种方式处理所选的突变体：

-100株突变体在接种前2天进行处理。

-100株突变体在接种4天后进行处理。

采用几种营养体亲和群(CVG)的混合孢子接种FocTR4。由于香蕉品种“Gal”对FocTR4具有耐受性，接种量很大，同时采用喷洒接种和土壤接种(灌根)。

接种后，将植株移入温室，并在接种后3-6周评定枯萎症状。

表3所示的结果表明，在温室中用组合物A治理的香蕉植株均未表现出枯萎病症状，而40％-70％的未治理植株表现出枯萎病症状。所有经组合物A治理的植株均能完全控制FocTR4。在下表中，术语“前”和“后”分别是指在接种Foc TR4之前或之后施用组合物A。

表3：组合物A对在温室中的香蕉植株FocTR4枯萎病发病率(％)的影响。

在确认用组合物A治理可防止病原菌感染后，将香蕉植株送往菲律宾，并种植在“热点”地区，那里的土壤受到Foc TR4污染。这些植株在种植前用组合物A进行治理，并评定枯萎病症状。