靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法
阅读说明：本技术 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 (Method for inhibiting HIV virus replication by targeting reverse transcription primer binding site ) 是由 杨鹏 王译萱 杨博 房璐 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于基础研究领域,尤其涉及一种靶向逆转录引物结合位点从而抑制HIV病毒复制的方法。首先公开了一种从数据库中筛选出HIV抑制因子的方法,包括：S1：从数据库提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据文件；S2：整理HIV靶点序列,利用MEME工具获得靶点基序Motif；获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息；S3：将锌指蛋白ChIPseq结合峰文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息文件进行比对,得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白。本发明提供了一种寻找HIV限制因子的方法,找到了HIV的两个限制性锌指蛋白ZNF417和ZNF587,填补了人体对于HIV的天然免疫作用这一领域的空白。(The invention belongs to the field of basic research, and particularly relates to a method for inhibiting HIV virus replication by targeting reverse transcription primer binding sites. First, a method for screening HIV inhibitors from a database is disclosed, comprising: s1: extracting a record data file of a zinc finger protein ChIP binding peak from a database; s2: arranging HIV target sequences, and obtaining a target Motif Motif by utilizing a MEME tool; obtaining positional information of HIV targets contained on a human genome; s3: and comparing the zinc finger protein ChIPseq binding peak file with a position information file of an HIV target on a human genome to obtain the potential HIV target-inhibited zinc finger protein. The invention provides a method for searching HIV restriction factors, finds two restrictive zinc finger proteins ZNF417 and ZNF587 of HIV, and fills the gap of the field of natural immunity of human bodies to HIV.)
技术领域
本发明属于基础研究领域，尤其涉及一种靶向逆转录引物结合位点从而抑制HIV病毒复制的方法。
技术背景
逆转录病毒(retrovirus)长期依附于人类及其他高等动物，与其共同存活进化，并与各种生物学现象息息相关。逆转录病毒根据其与宿主的关系可以分为内源性和外源性。内源性病毒(endogenous retrovirus,ERV)来源于古外源性逆转录病毒对哺乳动物生殖细胞的入侵，在长期进化中逐渐积累下来成为基因组的一部分。小鼠和人类基因组中约有10％序列属于ERVs，这些ERVs大部分处于转录沉默状态，以维持基因组的稳定。与ERVs相比，外源性逆转录病毒则具有更强的致病性。例如较为熟知的逆转录病毒人类免疫缺陷病毒HIV(human immunodeficiency virus)，作为获得性人体免疫缺陷综合征(艾滋病，acquired immune deficiency syndrome，AIDS)致病原，仍是公共健康安全的重要威胁之一。
逆转录病毒的逆转录过程是其复制周期的核心。逆转录病毒的基因组上有一段序列，与宿主的tRNA 3’端匹配。因此，逆转录病毒可以利用tRNA作为引物，以基因组RNA为模板合成DNA完成逆转录过程。这一段与tRNA结合的序列就是PBS(primer binding site，引物结合位点)。不同病毒的PBS匹配着不同的tRNA，人类免疫缺陷病毒HIV利用赖氨酸(Lys)tRNA。目前，逆转录酶的作用机理已有初步研究。其结构已在2018年被初步解析，证实tRNA可以直接与PBS结合，起始逆转录病毒的逆转录过程。因此，PBS对于逆转录病毒的复制非常重要，而且其序列相对保守，适合作为靶点研究。
KRAB-ZFPs是C2H2串联型锌指蛋白(ZFP)家族中最大的亚群，是小鼠和人类基因组中最大的转录因子家族。KRAB-ZFPs含有两个结构域：N端KRAB结构域和C端C2H2锌指串联结构域。KRAB结构域介导招募TRIM28(也称为KAP1,Tif1β或KRIP-1)，从而作为组蛋白修饰复合体的支架结构，这个复合体包括组蛋白H3K9me3甲基转移酶——SETDB1、组蛋白脱乙酰酶HDAC和异染色质蛋白1(HP1)，催化异染色质形成和转录抑制。在早期胚胎发育过程中，KRAB/TRIM28诱导的基因沉默也可以通过诱导DNA甲基化来促进可遗传的表观遗传沉默，这种甲基化甚至可以在TRIM28耗竭消逝后维持。此外，在某些情况下，KRAB/TRIM28诱导的异染色质沉默可以沿着染色体在较长的基因组距离上传播，这可能是由H3K9me3识别蛋白HP1促进的，H3K9me3可以通过SETDB1的招募而进一步传播。
已有研究报道，KRAB-ZFPs参与许多生物学过程，包括胚胎发育、基因组印记、细胞分化、代谢控制和性别决定。分子生物学研究发现，KRAB-ZFPs在基因组范围内的结合位点多为ERVs。敲除与KRAB结构域相互作用的支架蛋白TRIM28或其伴侣组蛋白甲基转移酶SETDB1可激活包括小鼠和人类胚胎干细胞(ESCs)中特异表达的多种ERVs。在抑制ERVs表达的KRAB-ZFPs中，研究比较深入的是基因ZFP809。通过分析小鼠白血病病毒(MuLV)脯氨酸引物结合序列(PBS-Pro)的结合蛋白，首次鉴定出ZFP809和TRIM28，发现这两个蛋白可以在小鼠胚胎干细胞中抑制具有PBS-Pro元件的ERVs表达。然而锌指蛋白是否对HIV病毒以及其引物结合序列PBS-Lys有何作用，作用机理如何还未见报道。
发明内容
发明人在近期的研究中，通过大规模分析文献中已发表的锌指蛋白数据库，从中找到了潜在的结合赖氨酸Lys tRNA的引物结合位点PBS-Lys的锌指蛋白，该发现对于进一步探究锌指蛋白抑制HIV病毒的作用提供了研究基础。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种从数据库中筛选出HIV抑制因子的方法，包括：
S1：从GEO数据库获取人类KRAB-ZFPs家族锌指蛋白的ChIPseq数据，并提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据BED文件；
S2：整理HIV靶点序列，输出FASTA文件；根据FATSA文件利用MEME工具获得靶点基序Motif；利用FIMO工具在人类基因组寻找包含该motif的位置，并与人类内源性逆转录病毒的注释信息BED文件比对；获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息，输出为BED文件；
S3：将锌指蛋白ChIPseq结合峰BED文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息BED文件利用BEDTools工具进行比对，得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白，即HIV抑制因子。
优选的，在S1中，通过GEO数据库的GSE78099，GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据，从中整理出人类KRAB-ZFPs结合位点信息文件。
优选的，在S2-S3中，确定HIV靶点PBS-Lys，获得PBS-Lys的motif以及在基因组上的定位信息；
将PBS-Lys位点信息和KRAB-ZFPs的数据比对，得到了潜在的HIV抑制因子锌指蛋白ZNF417(NP_689688.2)和ZNF587(NP_116217.1)。
更优选的，还包括步骤S4：验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。
较佳的，步骤S4包括：
S41：构建ZNF417和ZNF587表达载体，通过ChIP实验和报告基因实验确定了ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用；
S42：运用CRSPR-cas9系统构建ZNF417和ZNF587敲除的细胞系，在该细胞系中感染HIV假病毒；或
在过表达ZNF417和ZNF587的细胞中感染HIV假病毒，验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。
本发明第二个方面公开了一种锌指蛋白ZNF417和ZNF587在制备治疗HIV药物中的应用。
优选的，所述药物为抑制HIV病毒复制的药物。
本发明第三个方面公开了一种锌指蛋白ZNF417和ZNF587在制备靶逆转录HIV引物结合位点药物中的应用。
本发明第四个方面公开了一种抑制HIV病毒复制的方法，通过锌指蛋白结合HIVPBS-Lys，从而抑制HIV病毒的复制。
本发明第五个方面公开了一种抑制HIV病毒复制的药物，所述药物包含锌指蛋白ZNF417和/或ZNF587。
在本发明的一些优选实施例中，一种可以鉴定出HIV抑制因子的方法，该方法包括以下步骤：
1.从GEO数据库(Gene Expression Omnibus https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取人类KRAB-ZFPs家族锌指蛋白的ChIPseq数据，并提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据BED文件。
2.整理HIV靶点序列，输出FASTA文件。根据FATSA文件利用MEME(http://meme-suite.org/)工具获得靶点基序Motif。利用FIMO(http://meme-suite.org/)工具在人类基因组寻找包含该motif的位置，并与人类内源性逆转录病毒(HERV)的注释信息BED文件比对。获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息，输出为BED文件。
3.将锌指蛋白ChIPseq结合峰BED文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息BED文件利用BEDTools(http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq033)工具进行比对。得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白。
在本发明的另一些优选实施例中，根据上述方法鉴定出的锌指蛋白ZNF417和ZNF587抑制HIV的方法，包括以下步骤：
1.通过GEO数据库的GSE78099,GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据，从中整理出人的KRAB-ZFPs结合位点信息文件。
2.通过确定HIV靶点——PBS-Lys，获得PBS-Lys的motif以及在基因组上的定位信息。
3.将PBS-Lys位点信息和KRAB-ZFPs的数据比对，得到了潜在的靶向HIV的PBS的锌指蛋白ZNF417和ZNF587。
4.构建ZNF417和ZNF587表达载体，通过ChIP实验和报告基因实验确定了ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用。
5.运用CRISPR-cas9系统构建ZNF417和ZNF587敲除的细胞系，在该细胞系中感染HIV假病毒；或者在过表达ZNF417和ZNF587的细胞中感染HIV假病毒，验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。并进一步验证本发明中第一方面提供的鉴定HIV的限制性因子的方法的正确性和实用性。
本发明的创新点在于：1)首创性地着眼于逆转录病毒的PBS这一调控元件，以及锌指蛋白特异性识别DNA序列的特点，筛选锌指蛋白作为潜在的HIV病毒的抑制因子。2)目前，HIV如何被宿主细胞识别并抵御的机制仍不清楚。本发明从内源性逆转录病毒入手，结合全基因组水平的二代以上的深度测序以及生物信息学分析手段，从锌指蛋白与内源性逆转录病毒相互作用的数据库中筛选出靶向HIV的PBS的锌指蛋白。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)提供了一种寻找HIV限制因子的方法，找到了HIV的两个限制性锌指蛋白ZNF417和ZNF587。为锌指蛋白靶向逆转录引物结合位点抑制逆转录病毒的机制又提供了一例佐证。
(2)本发明有助于填补人体对于逆转录病毒，尤其是HIV的天然免疫作用这一领域的空白。
(3)本发明为探究锌指蛋白作为哺乳动物进化而来的抑制逆转录病毒的转录因子家族，对于HIV这一近数十年来威胁人类生命健康的病毒，其发挥的作用机制提供了一块重要内容；提供了一种新的可能的抑制HIV病毒的方法。
附图说明
图1中A表示GEO数据库中锌指蛋白与PBS-Lys位点吻合的结合峰数量统计。B表示荧光素酶报告基因验证ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用。图中“peak counts”指“ChIP结合峰计数”；“relative luciferase activity”指“相对荧光素酶活性”。
图2中A表示ZNF417和ZNF587与GFP融合表达后的ChIPseq验证，ZNF417和ZNF587的结合基序motif与PBS-Lys吻合。B表示验证ChIPseq分析ZNF417和ZNF587结合在基因组上的位点热图。C和D表示两个ZNF417和ZNF587典型的结合靶点示意图。图中“PBS-Lys sites”指“PBS-Lys位点”。
图3表示通过双荧光素酶报告基因验证ZNF417和ZNF587对于HIV的LTR(启动子)转录能力的抑制作用。
图4中AB两图表示两种不同的HIV假病毒在锌指蛋白ZNF417/587过表达(上)或者敲除(下)的细胞中不同的感染程度。病毒感染情况以RFP的表达程度显示，由流式细胞术检测。图中“ZNFs overexpression”指“ZNFs过表达”。
图5表示在人的CD4+T细胞中敲除ZNF417和ZNF587后HIV感染情况。病毒感染以流式细胞术分析检测。
图6表示ZNF417和ZNF587在HIV一个复制周期中起到抑制作用的示意图。
具体实施方式
下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。
实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。
实施例1：结合锌指蛋白高通量测序数据库鉴定出ZNF417和ZNF587为潜在的结合PBS-Lys的锌指蛋白。
一、目的：鉴定出结合HIV靶点PBS-Lys的锌指蛋白
二、方法：
1.通过GEO数据库的GSE78099,GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据与PBS-Lys位点比较，筛选出候选的锌指蛋白。
2.通过在报告基因载体promoter前插入PBS-Lys位点，与锌指蛋白ZNF417、ZNF587表达质粒共同表达，检测报告基因活性验证ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合能力。
3.通过在HEK293T细胞过表达GFP-tag的ZNF417和ZNF587后进行ChIP实验并进行高通量测序，验证ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys位点的抑制作用。
三、结果与讨论
通过GEO的数据分析，我们得到了潜在的结合PBS-Lys的锌指蛋白ZNF417和ZNF587(图1A)。对其进行报告基因检测，我们观察到了ZNF417和ZNF587显著的结合PBS-Lys的能力(图1B)。对ZNF417和ZNF587进行再次的ChIPseq验证我们发现，ZNF417和ZNF587的结合基序与PBS-Lys吻合(图2A)，并且在含有PBS-Lys的人的内源性逆转录病毒位点上有显著的ZNF417和ZNF587的结合(图2B)，并且在这些位点，ZNF417和ZNF587可以招募抑制因子KAP1，并在此形成异染色质修饰H3K9me3来形成对于PBS-Lys的抑制作用(图2B-D)。
实施例2：HIV假病毒感染实验验证ZNF417和ZNF587对于HIV的抑制作用
一、目的：验证ZNF417和ZNF587抑制HIV的能力
二、方法：
1.通过HIV的LTR(类似启动子)驱动荧光素酶报告基因，与ZNF417和ZNF587共同表达，验证ZNF417和ZNF587抑制HIV转录的能力。
2.通过设计HIV假病毒(这里利用了HIV全长病毒pNL4.3以及骨架病毒pSicoR来表达RFP，以RFP表达情况指征HIV病毒感染效率)在ZNF417和ZNF587过表达或者基于CRSIPRcas9系统进行基因敲除的细胞中进行感染，以流式细胞术进行检测，来判断ZNF417和ZNF587是否可以抑制HIV感染。
3.通过在人的CD4+T细胞中敲除ZNF417和ZNF587后感染HIV假病毒，模拟在真实情况下HIV攻击宿主细胞时，ZNF417和ZNF587在其中发挥的作用。
三、结果与讨论
通过报告基因系统，ZFP961作为小鼠的结合PBS-Lys的锌指蛋白作为阳性对照，空载质粒(control)作为阴性对照，我们证实了ZNF417和ZNF587的靶向PBS-Lys抑制HIV转录的能力(图3)。通过在HEK293T中过表达ZNF417和ZNF587后感染HIV病毒，我们验证了ZNF417和ZNF587对于HIV的抑制作用(图4A、B上)并且在一系列的ZNF417和ZNF587基因敲除的细胞系中，体现出了更强的病毒感染效果(图4A、B下)。在ZNF417和ZNF587基因敲除的CD4+T细胞中，HIV更容易感染(图5)，证明了锌指蛋白ZNF417和ZNF587在机体面对HIV病毒感染时作为抑制因子的功能。图6表示ZNF417和ZNF587在HIV一个复制周期中起到抑制作用的示意图。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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