具有治疗2型糖尿病作用的一组合化合物
阅读说明：本技术 具有治疗2型糖尿病作用的一组合化合物 (Combination compound with function of treating type 2 diabetes ) 是由 吴巍 焦丽丽 李慧 陈长宝 刘淑莹 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本专利本发明属于一种具有治疗2型糖尿病作用的人参皂苷组合物制备方法。其特征在于以五年生晒干人参,通过对药材原料的处理、提取、中空纤维素系统过滤、SB-C18分离纯化,收集80%乙醇洗脱组分。得成分稳定的人参皂苷组合物。其特征在于12种人参皂苷组合物配比为noto-R-(1：)Rg-1:Re:Rf:Rg-2:Rh-1(s):Rb-1:Rc:Rb-2:Rb-3:Rd:Rg-3为0.32：1.00：0.94：1.35：1.15：0.54：0.54：0.81：0.94：0.66：1.52：0.89。对患2型糖尿病大鼠肝组织及血清样品进行脂质代谢及氧化应激水平检测,具有调节脂质代谢,提高氧化应激水平的作用。该方法成本低、简便快捷、高效、易操作,所得提取物成分明确,治疗2型糖尿病活性好。(The invention belongs to a preparation method of a ginsenoside composition with the function of treating type 2 diabetes. The method is characterized in that five-year-old sun-dried ginseng is subjected to treatment, extraction, hollow cellulose system filtration and SB-C18 separation and purification of medicinal materials, and 80% ethanol elution components are collected. Obtaining the ginsenoside composition with stable components. It is characterized in that the mixture ratio of 12 ginsenoside compositions is noto-R 1： Rg 1 :Re:Rf:Rg 2 :Rh 1 (s):Rb 1 :Rc:Rb 2 :Rb 3 :Rd:Rg 3 Is 0.32: 1.00: 0.94: 1.35: 1.15: 0.54: 0.54: 0.81: 0.94: 0.66: 1.52: 0.89. the lipid metabolism and the oxidative stress level detection are carried out on liver tissue and serum samples of rats with type 2 diabetes, and the lipid metabolism and the oxidative stress level detection have the effects of regulating the lipid metabolism and improving the oxidative stress level. The method has low cost, simple operation, high efficiency, and easy operation, and the obtained extract has definite components and activity for treating type 2 diabetesGood results are obtained.)
技术领域
本发明属于一种从人参中提取的具有治疗2型糖尿病作用的一组合化合物。
背景技术
人参，五加科植物人参(Panax ginseng C.A. Meyer)的干燥根及根茎，是我国名贵中药材，吉林省主要的道地药材。临床和实验研究均表明，人参及其主要活性成分具有调节糖脂代谢、抗糖尿病和肥胖的作用，效果较为显著，且耐受性好。在古代，人参被广泛的应用于糖尿病的治疗。在中药学科中描述的人参的药用价值中，“消渴”作用即是其中重要一项。
据报道多种单体人参皂苷具有降低血糖，治疗糖尿病的作用，包括：人参皂苷Re、Rh2、Rg3、Rb1、Rc和Rg1。Xie [Xie, J.T., Biochim. Biophys. Acta, 2005, 1740(3):319-25.]等利用ob/ob小鼠模型研究了人参皂苷Re的抗糖尿病效果，结果表明人参皂苷Re能有效降低糖尿病小鼠的血糖水平。Zhang等[Zhiguo Zhang，Molecular Endocrinology.2007, 22(1):186-195.]在3T3-L1小鼠脂肪细胞模型和大鼠模型中研究了人参皂苷Re在胰岛素信号通路中的作用，发现人参皂苷Re能够通过抑制JNK和NF-κB的活化来减轻胰岛素抵抗。Hwang等[J.T. Hwang, Phytother. Res. 2009, 23(2): 262-266.]报道了在3T3-L1细胞中人参皂苷Rg3能有效地抑制脂肪细胞分化并且有效活化AMPK，这种活化具有时间依赖性。Shang等利用3T3-L1脂肪细胞模型研究发现，人参皂苷Rb1能够通过类胰岛素信号通路刺激葡萄糖摄取[Shang W, Journal of endocrinology. 2008, 198(3): 561-569.]。Park等 [Sunmin Park，Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008, 72(11): 2815-2823.]研究发现人参皂苷Rb1在3T3-L1脂肪细胞中能抑制甘油三酯的积累，他们还发现在Min6细胞中人参皂苷Rb1能通过PKA依赖的通路增强β细胞胰岛素分泌和生存能力。Lee等[Wen-KungLee，Horm Metab Res. 2007, 39(5): 347-354.]利用大鼠模型研究了人参皂苷Rh2增加胰岛素分泌，降低血糖水平以及改善胰岛素敏感性，减轻胰岛素抵抗的作用。在Lee等的研究中[Myoung-Su Lee，J Ethnopharmacol. 2010, 127(3): 771-776.]，人参皂苷Rc在C2C12肌管细胞中通过一个AMPK依赖的机制刺激了葡萄糖摄取。Huang等[Chuan Huang，J.Agric.Food Chem. 2010, 58(10): 6039-6047.]的研究表明，人参皂苷Rg1在3T3-L1小鼠脂肪细胞中能刺激葡萄糖摄取。
本专利将人参通过水蒸气蒸制处理，再进行提取纯化，得到一组人参皂苷组合物。通过高脂高糖饲料喂养，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠生化指标的检测筛选，对人参皂苷组合物中对2型糖尿病具有治疗作用的皂苷成分进行筛选分析。糖尿病及其并发症的发生与氧化及抗氧化系统失衡密切相关，高血糖使得自由基产生增多，抗氧化系统活性下降。SOD、GSH-Px、CAT三者一起构成了机体主要的抗氧化防御系统，抗氧化（SOD、GSH-Px、CAT）水平降低，可能导致糖尿病发病。糖尿病常伴随血脂异常，主要表现为胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平升高，高密度脂蛋白水平降低，会导致高血压、动脉粥样硬化及心脑血管疾病的发生，从而致死的严重后果。对体内甘油三酯和总胆固醇测定，并分析药物降低血清甘油三酯和总胆固醇水平的能力，会在一定程度上调节糖尿病患者体内脂质代谢，减少糖尿病并发症的发生。故而本专利利用2型糖尿病大鼠肝组织及血清样品进行脂质代谢及氧化应激水平检测对化合物进行筛选。实验结果表明，组合物中12中含量明确的人参皂苷有调节脂质代谢，提高氧化应激水平的作用，确定这组皂苷组合物对2型糖尿病具有治疗作用。
发明内容
本发明目的是制备一种具有治疗2型糖尿病作用的人参皂苷组合物。
1. 取五年生晒干人参，在温度为120℃的条件下，在高压水蒸气蒸锅中蒸制8小时，取出冷却至室温，放入烘箱70℃烘干，粉碎备用。
2. 用8-10倍量（W/V）水100℃水浴加热回流提取3次，每次1小时，，3KDa中空纤维素系统过滤取上清，后合并滤液，冻干得粗皂苷。
3. 用5倍量水溶解，通过SB-C18分离纯化，先用蒸馏水洗6-8倍柱体积，然后用20%乙醇除杂，80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱组分，蒸干溶剂，冻干既得成分稳定的人参皂苷组合物。
4. 12种人参皂苷组合物配比为noto-R1：Rg1: Re: Rf: Rg2: Rh1(s): Rb1: Rc:Rb2: Rb3: Rd: Rg3为0.32：1.00：0.94：1.35：1.15：0.54：0.54：0.81：0.94：0.66：1.52：0.89。
二、含量测定
1. 优化得到色谱、质谱条件。采用超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用技术，Thermo C-18色谱柱（100mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；采用二元线性梯度洗脱：流动相0.1%甲酸水溶液（A），乙腈（B）；洗脱梯度，0~5 min (19%B)，5~25min (19% ~28%B)，25~70min (28% ~49%B)，70~77 min (49%~90%B)，77~80 min (90%B)，80~83 min (90%~19%B)、83~88 min (19%B)，流速为0.2 mL·min-1，样品进样量为5 μL。电喷雾离子源（ESI），雾化气温度为300℃，离子传输管温度为350 ℃ ，鞘气压力35Arb，辅助器压力10Arb，喷雾电压为2.5kV，选择负离子模式扫描，扫描范围m/z 100-1500。
2. 精密称取人参皂苷组合物适量，80%色谱甲醇定容至5mL，过0.22μm滤膜进样分析。
3. 经LC-MS检测分析，人参皂苷组合物中12种人参皂苷组合物分别为：noto-R1为0.32g-4·g-1、Rg1为1.00g-4·g-1、Re为0.94g-4·g-1、Rf为1.35g-4·g-1、Rg2为1.15g-4·g-1、Rh1(s)为0.54g-4·g-1、 Rb1为0.54g-4·g-1、Rc为0.81g-4·g-1、Rb2为0.94g-4·g-1、Rb3为0.66g-4·g-1、Rd 为1.52g-4·g-1、Rg3为0.89g-4·g-1。经方法学考察，此方法准确稳定可行。12种人参皂苷组合物配比为noto-R1：Rg1: Re: Rf: Rg2: Rh1(s): Rb1: Rc: Rb2: Rb3: Rd: Rg3为0.32：1.00：0.94：1.35：1.15：0.54：0.54：0.81：0.94：0.66：1.52：0.89。
二、皂苷组合物治疗2型糖尿病（T2DM）结果
选用雄性Wistar大鼠180-220g，每组10只，适应环境一周后，用高脂高糖饲料（猪油 18%，蔗糖20%，蛋黄3%，基础饲料59%） 经8周连续饲养后，其中30 只大鼠按照35 mg/kg 体 重的剂量腹腔注射新配制的链脲佐菌素（质量体积比为0.1%柠檬酸缓冲液，pH4.5），其余10 只大鼠注射相同剂量的柠檬酸缓冲液作为空白组。一周后，尾部采血测定空腹血糖浓度大 于16.7 mmol/L的大鼠即为成功的T2DM模型。分空白组，阳性对照组（二甲双胍），阴性对照 组，给药组，灌胃连续给药（按100mg/kg给药量）28天，末次给药空腹12h后，腹动脉取血， 3000转/10分钟离心取血清存于-80℃冰箱待用。取肝脏组织存于-80℃冰箱，用前4℃匀浆， 取上清待用。血清样品、肝组织样品用于试剂盒测定。运用SPSS23.0软件将计算所得结果进 行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，数据均用均数加减标准差（±S）表示。
2.4 结果
实验结果见如表1-4。
表1 灌胃皂苷组合物大鼠肝组织血脂指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
表2 灌胃皂苷组合物大鼠血清血脂指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
表3 灌胃皂苷组合物大鼠肝组织氧化应激指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
表4 灌胃皂苷组合物大鼠血清氧化应激指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
通过与空白对照组大鼠比较，阴性对照组血脂指标检测显示，肝组织中高密度脂蛋白（HDL-C）明显降低（P<0.01），低密度脂蛋白(LDL-C)明显升高（P<0.01），由血清血脂指标检测可知，血清中的胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白明显升高（P<0.01），高密度脂蛋白明显降低（P<0.01），表明患2型糖尿病大鼠会出现代谢异常、脂质代谢紊乱情况。与阴性对照组比较，阳性对照组与给药组血脂指标检测显示，肝组织中高密度脂蛋白明显升高（P<0.01）,低密度脂蛋白明显降低（P<0.01），由血清血脂指标检测可知，血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白明显降低（P<0.01）,阳性对照组高密度脂蛋白明显升高（P<0.01），给药组高密度脂蛋白升高（P<0.05）,结果表明在灌胃给药红参水提物之后，2型糖尿病大鼠脂质代谢趋于正常，说明红参水提得到的13种人参皂苷具有调节2型患糖尿病大鼠脂质代谢作用。
通过与空白对照组比较，阴性对照组氧化应激水平指标检测显示，肝组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）水平明显下降（P<0.01）血清中，氧化氢酶(CAT)水平下降（P<0.05）,超氧化物歧化酶（SOD）水平无明显变化、总抗氧化能力（T-AOC）水平明显降低（P<0.05）,说明患2型糖尿病会导致氧化应激水平降低。与阴性对照组比较，肝组织与血清样品中阳性对照组与给药组氧化应激水平均有升高。其中肝组织中阳性对照组总抗氧化能力及谷胱甘肽过氧化氢酶水平升高较为明显（P<0.05）,给药组总抗氧化能力及谷胱甘肽过氧化氢酶水平明显升高（P<0.01），过氧化氢酶水平升高较为明显（P<0.05）。血清样品阳性对照组过氧化氢酶水平升高较为明显（P<0.05）,给药组超氧化物歧化酶水平明显升高（p<0.01）,结果表明皂苷组合物具有提高2型糖尿病大鼠氧化应激水平的作用。
糖尿病及其并发症的发生与氧化及抗氧化系统失衡密切相关，高血糖使得自由基产生增多，抗氧化系统活性下降。SOD、GSH-Px、CAT三者一起构成了机体主要的抗氧化防御系统，抗氧化（SOD、GSH-Px、CAT）水平降低，可能导致糖尿病发病。糖尿病常伴随血脂异常，主要表现为胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平升高，高密度脂蛋白水平降低，会导致高血压、动脉粥样硬化及心脑血管疾病的发生，从而致死的严重后果。对体内甘油三酯和总胆固醇测定，并分析药物降低血清甘油三酯和总胆固醇水平的能力，会在一定程度上调节糖尿病患者体内脂质代谢，减少糖尿病并发症的发生。实验结果表明这一组皂苷组合物具有调节血脂，提高氧化应激水平的作用，对2型糖尿病的治疗具有治疗作用。
附图说明
附图 1 人参皂苷混合标准品的RRLC-TSQ -MS总离子流图
附图 2 人参皂苷组合物的RRLC-TSQ -MS总离子流图
附图2为经提取后的人参皂苷组合物的RRLC-TSQ-MS总离子流图。主要包括noto-R1、Rg1、Re、Rf、Rg2、Rh1(s)、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、gRg3 12中常见人参皂苷。
具体实施方式
实施例1：
一、人参皂苷组合物制备
取五年生晒干人参，在温度为120℃的条件下，在高压水蒸气蒸锅中蒸制8小时，取出冷却至室温，放入烘箱70℃烘干，粉碎备用。用8-10倍量（W/V）水100℃水浴加热回流提取3次，每次1小时， 3KDa中空纤维素系统过滤取上清，后合并滤液，冻干得粗皂苷。用5倍量水溶解，通过SB-C18分离纯化，先用蒸馏水洗6-8倍柱体积，然后用20%乙醇除杂，80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱组分，蒸干溶剂，冻干既得成分稳定的人参皂苷组合物。
二、含量测定
采用超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用技术，Thermo C-18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；采用二元线性梯度洗脱：流动相0.1%甲酸水溶液（A），乙腈（B）；流速为0.2 mL·min-1，样品进样量为5 μL。电喷雾离子源（ESI），雾化气温度为300℃，离子传输管温度为350 ℃ ，鞘气压力35Arb，辅助器压力10Arb，喷雾电压为2.5kV，选择负离子模式扫描，扫描范围m/z 100-1500。精密称取红参粗皂苷适量，80%色谱甲醇定容至5mL，过0.22μm滤膜进样分析。人参皂苷组合物中12种皂苷含量分别为noto-R1为0.32g-4·g-1、Rg1为1.00g-4·g-1、Re为0.94g-4·g-1、Rf为1.35g-4·g-1、Rg2为1.15g-4·g-1、Rh1(s)为0.54g-4·g-1、 Rb1为0.54g-4·g-1、Rc为0.81g-4·g-1、Rb2为0.94g-4·g-1、Rb3为0.66 g-4·g-1、Rd 为1.52g-4·g-1、Rg3为0.89g-4·g-1。12种人参皂苷配比为noto-R1: Rg1: Re: Rf: Rg2: Rh1(s): Rb1:Rc: Rb2: Rb3: Rd: Rg3:为0.32：1.00：0.94：1.35：1.15：0.54：0.54：0.81：0.94：0.66：1.52：0.89。
三、人参皂苷组合物治疗2型糖尿病生化指标测试
3.1 给药及血液样品、肝组织样品的采集和前处理
选用雄性Wistar大鼠180-220g，每组10只，适应环境一周后，用高脂高糖饲料（猪油18%，蔗糖20%，蛋黄3%，基础饲料59%） 经8周连续饲养后，其中30 只大鼠按照35 mg/kg 体重的剂量腹腔注射新配制的链脲佐菌素（质量体积比为0.1%柠檬酸缓冲液，pH4.5），其余10只大鼠注射相同剂量的柠檬酸缓冲液作为空白组。一周后，尾部采血测定空腹血糖浓度大于16.7 mmol/L的大鼠即为成功的T2DM模型。分空白组，阳性对照组（二甲双胍），阴性对照组，给药组，灌胃连续给药（按100mg/kg给药量）28天，末次给药空腹12h后，腹动脉取血，3000转/10分钟离心取血清存于-80℃冰箱待用。取肝脏组织存于-80℃冰箱，用前4℃匀浆，取上清待用。血清样品、肝组织样品用于试剂盒测定。
3.2统计分析
运用SPSS23.0软件将计算所得结果进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析， 数据均用均数加减标准差（±S）表示。
3.3 结果
实验结果见表1-4。
表1 灌胃皂苷组合物大鼠肝组织血脂指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
表2 灌胃皂苷组合物大鼠血清血脂指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
表3 灌胃皂苷组合物大鼠肝组织氧化应激指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
表4 灌胃皂苷组合物大鼠血清氧化应激指标
注：与正常组比较，* P<0.05；** P<0.01。
与阴性对照组比较，# P<0.05；## P<0.01。
实验通过对高脂高糖饲料饲养，链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠肝组织及血清样品生化指标的检测，表明2型糖尿病会导致胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白降低，氧化应激水平下降，从而引发高血压、动脉粥样硬化及心脑血管疾病，甚至致死。人参皂苷组合物到的12种人参皂苷混合物会在一定程度上调节糖尿病引发的脂质代谢紊乱，提高氧化应激水平，从而治疗2型糖尿病。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种单味低温真空干燥提取粉及其提取方法