二芳基脲类化合物及其制法和药物用途
阅读说明：本技术 二芳基脲类化合物及其制法和药物用途 (Diaryl urea compound and its preparation method and medicinal use ) 是由 肖志艳 杨亚军 杨颖� 景连栋 张浩超 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物化学领域,公开了式(I)化合物所示新的二芳基脲类化合物及其生理上可接受的盐,溶剂化物以及结晶形式,所述化合物的制备方法,含有所述化合物的药物制剂,以及所述化合物在治疗CDK8相关疾病如肿瘤等临床上的应用。(The invention belongs to the field of pharmaceutical chemistry, and discloses a novel diaryl urea compound shown as a compound in a formula (I), and a physiologically acceptable salt, solvate and crystal form thereof, a preparation method of the compound, a pharmaceutical preparation containing the compound, and clinical application of the compound in treatment of CDK8 related diseases such as tumors and the like.)
技术领域
本发明涉及通式(I)的新型二芳基脲类化合物及其生理上可接受的盐。这些化合物在与制备细胞周期蛋白依赖性激酶8(Cyclin dependent kinase 8,CDK8)抑制剂与治疗肿瘤药物中的用途，以及含有所述化合物的药物组合物。
背景技术
恶性肿瘤已成为危害人民生命健康的常见疾病，进入21世纪以来，恶性肿瘤仍为严重威胁人类健康的重大疾病之一，且随着人们生活习惯、饮食、生活环境等因素改变，恶性肿瘤的发病也发生了显著改变，但总的发病趋势仍不容乐观。研究显示，2000年全球新发恶性肿瘤患者1010万，死亡620万，已被诊断发病患者2240万。2012年世界卫生组织公布的最新全球肿瘤患者数据显示，全球新增肿瘤人群1410万，死亡820万，其中，中国新增肿瘤患者居全球之首。
CDK8是中介体复合物的重要组成部分，对于中介体功能的发挥起到关键作用。CDK8被认为涉及到多条调控通路中，其高表达被发现存在很多的结直肠癌样本中，同时在一些腺癌中也发现了CDK8的异常表达。CDK8被认为是治疗结直肠癌，乳腺癌以及一些腺癌的潜在靶点。因此，以CDK8激酶为靶点的抗癌药物已成为制药公司和生物技术公司极为关注和研究的对象。
CDK8早期的研究大都与结直肠癌相关，近年来关于CDK8与癌症的关系也有新进展。其中最突出的当属乳腺癌。CDK8被发现在乳腺癌中表达量升高，与乳腺癌的进展密切相关，高表达的CDK8以及与之相互作用的蛋白质被认为与病人较短的无进展生存期相关。研究者认为CDK8抑制剂未来可能将作为一线用药与选择性雌激素受体下调剂或芳香酶抑制剂联用，用于提高治疗效果，降低激素疗法的耐药性。在其他方面，CDK8还可能涉及到胃癌、卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤，但是相关研究还不够深入。
目前，虽然已有CDK8激酶抑制剂小分子报道，但由于药代动力学性质、激酶选择性较差还没有药物成功上市。鉴于此，本申请的发明人拟提供新的安全有效的分子靶向的小分子抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通式(I)所示的新型二芳基脲类化合物。
本发明的另一目的在于提供一种制备通式(I)所示的二芳基脲类化合物及其类似物的方法。
本发明的又一目的在于提供通式(I)所示的化合物在制备CDK8抑制剂中的应用，以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。
为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
其中，
X选自CH2或氧原子；
Y选自2H或氧原子；
R1选自氢、单取代或多取代的卤素、单取代或多取代的三氟甲基；
R2选自氢、单取代或多取代的C1-C3烷基、单取代或多取代的卤素；
R3选自以下结构：
n为1、2或3。
本发明的又一技术方案在于提供通式(IA)所示的化合物及其生理上可接受的盐：
Y选自2H或氧原子；
R1选自氢、单取代或多取代的卤素、单取代或多取代的三氟甲基；
R2选自氢、单取代或多取代的C1-C3烷基、单取代或多取代的卤素；
R3选自以下结构：
本发明的又一技术方案在于提供通式(IAa)所示的化合物及其生理上可接受的盐：
R1选自氢、单取代或多取代的卤素、单取代或多取代的三氟甲基；
R2选自氢、单取代或多取代的C1-C3烷基、单取代或多取代的卤素。
本发明的又一技术方案在于提供通式(IAb)所示的化合物及其生理上可接受的盐：
R1选自氢、单取代或多取代的卤素、单取代或多取代的三氟甲基；
R2选自氢、单取代或多取代的C1-C3烷基、单取代或多取代的卤素。
本发明的又一技术方案在于提供通式(IAc)所示的化合物及其生理上可接受的盐：
R1选自氢、单取代或多取代的卤素、单取代或多取代的三氟甲基；
R2选自氢、单取代或多取代的C1-C3烷基、单取代或多取代的卤素。
本发明的又一技术方案在于提供所述的化合物及其生理上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自：
本发明的又一技术方案在于提供通式(I)所示的化合物的合成方法，包括以下步骤：
X、Y、n、R1、R2、R3的定义同权利要求1-7任意一项。
为了制成药剂，可将通式(I)化合物及其生理上可接受的盐按已知方法与合适的制药载体物质、芳香剂、调味剂和颜料用已知的方法混合，并被制成片剂或包衣的片剂，或者将其与其它的附加物质悬浮或溶解在水或油中。
本发明还涉及一种含有药物有效剂量的如通式I所述的化合物及其生理上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明化合物可用口服方法或非肠胃道用药。口服用药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，非经肠用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉，明胶，阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如有水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等。
本发明的又一技术方案提供了本发明化合物及其生理上可接受的盐在制备CDK8抑制剂中的应用，以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。
有益技术效果：
作用特异性差是目前CDK8抑制剂研究面临的主要挑战之一。本发明化合物具有特异性抑制CDK8的特点和优势，有望提供新的安全有效的CDK8抑制剂作为小分子抗肿瘤药物
附图说明
图1.化合物对CDK8的选择性抑制作用(目标化合物对激酶的单浓度抑制率(10μM))。
具体实施方式
以下结合实施例对发明作进一步的说明，但这些实施例并不限制本发明的范围。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)或高分辨质谱(HRMS)来确定的。NMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。m.p.是以℃给出的熔点，温度未加校正。柱层析一般使用200～300目硅胶为载体。NMR测定是用INOVA-300，测定溶剂为CDCl3、DMSO-D6，内标为TMS，化学位移是以ppm作为单位给出。MS的测定用Agilent LC/MSD TOF液质联用仪。
实施例1：化合物1的合成
1)合成对硝基苯氧乙酰吗啉
称取对硝基苯氧乙酸(788mg，4mmol)，吗啉(348.5mg，4mmol)，HATU(1672mg，4.4mmol)，DIEA(1548mg，12mmol)溶于10mL二氯甲烷中，在室温下搅拌反应过夜，次日产生大量固体物质，直接过滤得到黄色固体，用二氯甲烷洗涤数次，大量黄色褪去，得到偏白色的固体物质，即为37a，约900mg，产率78％。
2)合成对氨基苯氧乙酰吗啉
称对硝基苯氧乙酰吗啉(440mg，1.53mmol)溶于5mL甲醇中，加入Pd/C(44mg，10％)，加上常压氢气球，置换瓶内气体三次，随后在室温下搅拌反应约3h。反应完毕后由硅藻土滤除钯碳，甲醇洗涤滤饼数次，滤液减压浓缩得到对氨基苯氧乙酰吗啉(空气中农放置后变为浅黄色)，约390mg，产率为99％。
3)合成1-(3,4-二氯苯基)-3-(4-(2-吗啉-2-氧代乙氧基)苯基)脲
将3,4-二氯苯异氰酸酯(94mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入对氨基苯氧乙酰吗啉(118mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为64％。mp:236-238℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.91(s,1H),8.61(s,1H),7.86(d,J＝2.4Hz,1H),7.49(d,J＝8.8Hz,1H),7.32(d,J＝8.9Hz,2H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),4.76(s,2H),3.55-3.59(m,4H),3.45(s,4H)；HR-ESI-MS:m/z＝424.0826[M+H]+,calcd for C19H20Cl2N3O4:424.0825.
实施例2：化合物2的合成
将3,5-二三氟甲基苯异氰酸酯(127mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入对氨基苯氧乙酰吗啉(118mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为70％。mp:240-242℃；1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ8.77(s,1H),8.26(s,1H),8.20(s,2H),7.58(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,2H),6.93(d,J＝9.2Hz,2H),4.79(s,2H),3.53-3.66(m,8H)；HR-ESI-MS:m/z＝492.1352[M+H]+,calcd forC21H20F6N3O4:492.1353.
实施例3：化合物3的合成
1)合成1-(3-氯苯基)-3-(4-羟基-2-甲基苯基)脲
称取间氯苯异氰酸酯(1.535g，10mmol)，溶于20mL无水二氯甲烷中，向体系中加入4-氨基-3-甲基苯酚(1.23g，10mmol)，在室温下搅拌反应1h，反应完毕，体系产生了大量白色絮状固体物质。将白色固体物质过滤，滤饼抽干得到白色固体，约2.8g，产率为86％。
2)合成1-(3-氯苯基)-3-(2-甲基-4-(2-吗啉-2-氧代乙氧基)苯基)脲
1-(3-氯苯基)-3-(4-羟基-2-甲基苯基)脲(80mg，0.3mmol)，2-氯乙酰吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mL DMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，约50mg，产率为41％。mp:108-110℃；1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ8.40(s,1H),7.81(t,J＝2.0Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.39(s,1H),7.30-7.34(m,1H),7.25(t,J＝8.0Hz,1H),6.96-6.99(m,1H),6.76-6.83(m,2H),4.78(s,2H),3.50-3.69(m,8H),2.23(s,3H)；HR-ESI-MS:m/z＝404.1366[M+H]+,calcdforC20H23ClN3O4:404.1372.
实施例4：化合物4的合成
1-(3-氯苯基)-3-(2-氟-4-羟基苯基)脲(84.2mg，0.3mmol)，2-氯乙酰吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mL DMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，约50mg，产率为40％。mp:216-218℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,1H),8.33(d,J＝1.2Hz,1H),7.80(t,J＝9.2Hz,1H),7.70(t,J＝2.0Hz,1H),7.28(t,J＝8.0Hz,1H),7.20-7.23(m,1H),6.98-7.02(m,1H),6.91(dd,J＝12.8,2.8Hz,1H),6.72-6.76(m,1H),4.82(s,2H),3.54-3.60(m,4H),3.42-3.45(m,4H)；HR-ESI-MS:m/z＝408.1115[M+H]+,calcd for C19H20ClFN3O4:408.1121.
实施例5：化合物5的合成
1-(3-氯苯基)-3-(3,5-二氯-4-羟基苯基)脲(99.5mg，0.3mmol)，2-氯乙酰吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mL DMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，约50mg，产率为58％。mp:174-176℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.06(s,1H),9.01(s,1H),7.65-7.68(m,1H),7.58(s,2H),7.25-7.32(m,2H),7.03(dt,J＝6.8,2.0Hz,1H),4.63(s,2H),3.56-3.60(m,4H),3.46-3.52(m,4H)；HR-ESI-MS:m/z＝458.0433[M+H]+,calcd for C19H19Cl3N3O4:458.0436.
实施例6：化合物6的合成
1-(3-氯苯基)-3-(4-羟基萘-1-基)脲(93.8mg，0.3mmol)，2-氯乙酰吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mL DMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，产率为51％。mp:170-172℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.80(s,1H),8.24-8.26(m,1H),8.10-8.13(m,1H),7.73-7.75(m,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.53-7.62(m,2H),7.28-7.30(m,2H),6.97-7.01(m,1H),6.92(d,J＝8.4Hz,1H),5.01(s,2H),3.48-3.61(m,8H)；HR-ESI-MS:m/z＝440.1371[M+H]+,calcdforC23H23ClN3O4:440.1372.
实施例7：化合物7的合成
1)合成1-(3-氯苯基)-3-(4-苯氧乙酸乙酯基)脲
1-(3-氯苯基)-3-(4-羟基苯基)脲(1310mg，5mmol)，溴乙酸乙酯(1670mg，10mmol)，碳酸钾(1380mg，10mmol)，碘化钾(415mg，2.5mmol)溶于10mL DMF中，加热至80℃反应约5h。反应完毕，向反应液中加入饱和食盐水，利用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯有机层，得到含部分杂质的固体，用乙酸乙酯洗涤固体物质，得到白色固体，约800mg，产率为46％。
2)合成1-(3-氯苯基)-3-(4-苯氧乙酸基)脲
1-(3-氯苯基)-3-(4-苯氧乙酸乙酯基)脲(348mg，1mmol)，溶于3mL乙醇和3mL四氢呋喃中，向体系中加入3mL 1N的氢氧化钠水溶液，在室温下搅拌反应约1h。反应完毕，蒸除多余的溶剂，加入蒸馏水2mL，用乙酸乙酯萃取，收集水层，用1N的盐酸水溶液调节水溶液的pH至弱酸性。体系中析出大量固体物质，过滤干燥得到白色固体，约260mg，产率为81％。mp:218-220℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.97(s,1H),8.95(s,1H),8.70(s,1H),7.68-7.70(m,1H),7.31-7.36(m,2H),7.22-7.29(m,2H),6.97(dt,J＝6.8,2.0Hz,1H),6.81-6.86(m,2H),4.58(s,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝321.0638[M+H]+,calcd for C15H14ClN2O4:321.0637.
实施例8：化合物8的合成
1-(3-氯苯基)-3-(4-苯氧乙酸乙酯基)脲(220mg，0.63mmol)，溶于7M的NH3的甲醇溶液中，在室温下搅拌反应过夜，反应完毕，蒸除溶剂，用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取反应液，有机层浓缩得到白色固体，约190mg，产率为94％。mp:242-244℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.56(s,1H),7.69(t,J＝2.0Hz,1H),7.47(s,1H),7.36(s,1H),7.32-7.36(m,2H),7.24-7.29(m,1H),7.21-7.25(m,1H),6.96-7.00(m,1H),6.86-6.91(m,2H),4.36(s,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝320.0796[M+H]+,calcd for C15H15ClN3O3:320.0796.
实施例9：化合物9的合成
将3-氯苯异氰酸酯(77mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入对氨基苯氧乙酰苯并吗啉(142mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为61％。mp:126-128℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.81(s,1H),8.57(s,1H),7.90(s,1H),7.70(s,1H),7.32-7.37(m,2H),7.23-7.30(m,2H),7.03-7.08(m,1H),6.98-7.01(m,1H),6.85-6.91(m,4H),5.00(s,2H),4.29(t,J＝4.0Hz,2H),3.88(t,J＝4.4Hz,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝438.1210[M+H]+,calcd forC23H21ClN3O4:438.1215.
实施例10：化合物10的合成
将3-氯苯异氰酸酯(77mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入2-(4-氨基苯氧基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙酰胺(128.6mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为63％。mp:206-208℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.71(t,J＝6.0Hz,1H),8.59(s,1H),8.45-8.47(m,2H),7.69(t,J＝2.0Hz,1H),7.34-7.39(m,2H),7.22-7.30(m,2H),7.20-7.22(m,2H),6.97-7.00(m,1H),6.91-6.95(m,2H),4.54(s,2H),4.35(d,J＝6.0Hz,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝411.1223[M+H]+,calcd for C21H20ClN4O3:411.1218.
实施例11：化合物11的合成
将间氯苯异硫氰酸酯(84.8mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入对氨基苯氧乙酰吗啉(118mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为20％。mp:154-156℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,2H),7.70(t,J＝2.0Hz,1H),7.37-7.41(m,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),7.28-7.32(m,2H),7.14-7.17(m,1H),6.88-6.93(m,2H),4.82(s,2H),3.55-3.61(m,4H),3.46(s,4H)；HR-ESI-MS:m/z＝406.0987[M+H]+,calcd for C19H21ClN3O3S:406.0987.
实施例12：化合物12的合成
将3,5-二三氟甲基苯异氰酸酯(127.6mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入2-(4-氨基苯氧基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙酰胺(128.6mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为55％。mp:205-207℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.37(s,1H),8.85(s,1H),8.72(t,J＝6.0Hz,1H),8.45-8.47(m,2H),8.12(s,2H),7.61(s,1H),7.37-7.42(m,2H),7.20-7.22(m,2H),6.92-6.97(m,2H),4.55(s,2H),4.35(d,J＝6.0Hz,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝513.1367[M+H]+,calcd forC23H19F6N4O3:513.1356.
实施例13：化合物13的合成
1-(3,5-双(三氟甲基)苯基)-3-(3,5-二氯-4-羟基苯基)脲(130mg，0.3mmol)，2-氯乙酰吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mLDMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，产率为50％。mp:148-150℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.58(s,1H),9.25(s,1H),8.13(s,2H),7.66(s,1H),7.62(s,2H),4.64(s,2H),3.56-3.62(m,4H),3.45-3.52(m,4H)；HR-ESI-MS:m/z＝560.0574[M+H]+,calcdfor C21H18Cl2F6N3O4:560.0573.
实施例14：化合物14的合成
将3,5-二三氟甲基苯异氰酸酯(127.6mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入2-(4-氨基-2,6-二氯苯氧基)-N-(吡啶-4-基甲基)乙酰胺(163mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为40％。mp:192-194℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(s,2H),8.84(s,1H),8.51-8.53(m,2H),8.15(s,2H),7.67(s,1H),7.65(s,2H),7.30(d,J＝5.6Hz,2H),4.47(s,2H),4.41(s,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝581.0578[M+H]+,calcd for C23H17Cl2F6N4O3:581.0576.
实施例15：化合物15的合成
将3,5-二三氟甲基苯异氰酸酯(127.6mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入3-(4-氨基苯基)-N-(吡啶-4-基甲基)丙酰胺(128mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为60％。mp:234-236℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),8.95(s,1H),8.38-8.43(m,3H),8.12(s,2H),7.62(s,1H),7.36-7.40(m,2H),7.10-7.16(m,2H),7.04-7.06(m,2H),4.25(d,J＝6.0Hz,2H),2.81(t,J＝7.6Hz,2H),2.46(t,J＝7.6Hz,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝511.1563[M+H]+,calcd for C24H21F6N4O2:511.1563.
实施例16：化合物16的合成
将3,5-二三氟甲基苯异氰酸酯(127.6mg，0.5mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入2-(4-氨基苯氧基)-N-苄基乙酰胺(128mg，0.5mmol)，在室温下搅拌反应2h。反应完毕，产生了大量白色固体，将固体过滤，用二氯甲烷洗涤数次，得到白色固体，产率约为67％。mp:182-184℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.91(s,1H),8.63(t,J＝6.0Hz,1H),8.12(s,2H),7.62(s,1H),7.37-7.41(m,2H),7.29-7.33(m,2H),7.20-7.26(m,3H),6.92-6.97(m,2H),4.52(s,2H),4.35(d,J＝6.0Hz,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝512.1401[M+H]+,calcdforC24H20F6N3O3:512.1403.
实施例17：化合物17的合成
1-(3-氯苯基)-3-(3-羟基苯基)脲(79mg，0.3mmol)，2-氯乙酰吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mL DMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，产率为69％。mp:164-166℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.87(s,1H),8.74(s,1H),7.70(t,J＝2.0Hz,1H),7.25-7.31(m,1H),7.22-7.25(m,1H),7.16(t,J＝8.0Hz1H),7.12(t,J＝2.0Hz,1H),6.99-7.02(m,1H),6.95-6.98(m,1H),6.53-6.56(m,1H),4.78(s,2H),3.55-3.61(m,4H),3.44-3.47(m,4H)；HR-ESI-MS:m/z＝390.1213[M+H]+,calcd for C19H21ClN3O4:390.1215.
实施例18：化合物18的合成
1-(3-氯苯基)-3-(4-羟基苯基)脲(79mg，0.3mmol)，4-(3-氯丙基)-吗啉(54mg，0.33mmol)，碳酸钾(83mg，0.6mmol)，碘化钾(25mg，0.15mmol)，溶于2mL DMF中，加热至80℃反应约3h。反应完毕，利用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取反应液，合并有机层，浓缩得到固体粗产物，经硅胶柱层析得到白色固体，产率为40％。mp:186-188℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.78(s,1H),8.52(s,1H),7.69(t,J＝2.0Hz,1H),7.30-7.34(m,2H),7.25-7.29(m,1H),7.21-7.24(m,1H),6.95-6.99(m,1H),6.83-6.87(m,2H),3.95(t,J＝6.4Hz,2H),3.56(t,J＝4.8Hz 4H),2.40(t,J＝7.6Hz,2H),2.35(s,4H),1.80-1.87(m,2H)；HR-ESI-MS:m/z＝390.1568[M+H]+,calcd for C20H25ClN3O3:390.1579.
药理实验：
实验例1：体外激酶抑制活性测试
化合物对CDK8/cyclin C的分子水平活性评价经委托由美国ThermoFisherScientific公司(赛默飞)完成。化合物以DMSO溶液稀释100倍，与缓冲溶液(50mMHEPES pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA)，激酶和抗体的混合物以及Tracer混合，振摇30s，然后在室温下孵育60min。随后在酶标仪上读取Emission Ratio(ER，AF647Emission(665nm)与Europium Emission(615nm)的比值)并分析。IC50测试中，化合物以3倍梯度稀释，共测试10个浓度。测试中设置空白对照，阳性对照以sorafenib为参考。结果以“空白对照的ER与测试样品的ER之差”和“空白对照的ER与阳性对照的ER之差”的百分比给出，百分比越大说明化合物与激酶结合得越好。表1是本发明化合物的体外抑酶实验结果。
表1本发明化合物对CDK8/Cyclin C的抑制作用
实验例2：体外激酶选择性活性测试
本发明选取了8个具有代表性的有效抑制剂对12种激酶进行选择性测试。其中4种为CDK亚型，包括CDK2、CDK6、CDK7和CDK9；另外8种为AuroraA、BRAF、EGFR、FGFR1、FLT3、JAK1、PDGFRα和GSK3α。本发明所选的8个化合物的激酶选择性在10μM的浓度下测定。如图1和表2所示，本发明所述8个化合物均显示出对CDK8的选择性抑制作用。
表2本发明8个化合物对12种激酶的抑制作用
CDK:细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase)；BRAF:肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1(v-raf murine sarcomaviral oncogene homolog B1)；Aurora A:极光激酶A(Aurora kinase A)；EGFR:表皮生长因子受体(epithelial growth factorreceptor)；PDGFRα:血小板衍生生长因子受体α(Platelet-derived growth factorreceptorα)；JAK1:Janus激酶1(Janus kinase 1)；FGFR1:成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast Growth Factor Receptor-1)；GSK3α:糖原合酶激酶3α(glycogen synthasekinase 3α)；FLT3:FMS样的酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase)。
实验例3：体外抗肿瘤细胞增殖测试
目标物抗肿瘤活性的筛选以索拉非尼(Sorafenib)为对照品。通过SRB(Sulforhodamine B)方法测定了结构代表性目标物对KB(人鼻咽癌细胞)、KBvin(KB耐药株)、A549(人肺癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)的细胞生长半数抑制浓度IC50。
结果：
分别测定并计算几种本发明化合物的IC50(μM)值。结果如表3所示。
表3.受试化合物对多种肿瘤细胞的抑制作用
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