一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料及其制备和应用
阅读说明：本技术 一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料及其制备和应用 (Chitosan microsphere-bacterial cellulose composite material and preparation and application thereof ) 是由 洪枫 韦昭 陈琳 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料及其制备和应用,所述复合材料具有三维网络结构,壳聚糖微球负载在纳米纤维的表面和网络中。本发明制备出的神经导管具备缓释NGF,体内可降解,促进神经细胞的增殖、黏附与分化和广谱抗菌等特性,引导受损神经的修复与再生。该材料制备方法简单,不引入有毒交联剂,复合均匀高效,为神经组织工程提供了一种新的材料和思路。(The invention relates to a chitosan microsphere-bacterial cellulose composite material, and a preparation method and an application thereof. The nerve conduit prepared by the invention has the characteristics of sustained release of NGF, in-vivo degradation, promotion of proliferation, adhesion and differentiation of nerve cells, broad-spectrum antibiosis and the like, and guides repair and regeneration of damaged nerves. The material has simple preparation method, does not introduce toxic cross-linking agents, is uniformly and efficiently compounded, and provides a new material and thought for nervous tissue engineering.)
技术领域
本发明属于神经导管材料及其制备和应用领域，特别涉及一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料及其制备和应用。
背景技术
神经组织结构复杂、功能多样，当发生缺损时，一方面严重影响机体的功能，降低了患者的生活质量，同时给社会经济造成巨大的负担。全球每年有大量的周围神经损伤患者，周围神经损伤的修复一直是临床和科研关注的热点。当前，神经损伤修复临床上常用治疗方法是自体神经移植的方法。然而自体移植必然伴随着供区功能的受损和可移植供体来源不足等问题。近年来，随着神经组织工程的发展，使用人工制造的神经导管能够提供合适的微环境，促进神经再生，为受损神经的修复提供了一种新途径。
神经导管需要具备选择透过性、体内可降解、生物相容性，易于加工和成型等特点，因此其材料的选择和制备方式尤其重要。
CN101711893A公开了细菌纤维素神经导管的制备方法，其首先将细菌纤维素溶解制备成溶液，然后通过静电纺丝的方法形成管状材料。静电纺丝流程复杂，制备过程中引入了大量试剂，且破坏了细菌纤维素天然的三维纳米纤维网络结构。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料及其制备和应用，克服现有技术制备过程复杂且会破坏细菌纤维素天然结构的缺陷。
本发明的一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料，所述复合材料以二醛氧化细菌纤维素或细菌纳米纤维素为基质，基质内嵌原位成型的壳聚糖微球。
本发明的一种壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料的制备方法，包括：
(1)将细菌纤维素(Bacterial Nano-Cellulose,BNC)置于高碘酸钠水溶液中，反应，然后浸入乙二醇水溶液中静置，清洗，得到二醛氧化细菌纤维素；
(2)将高温高压处理的壳聚糖(Chitosan,CS)溶液扩散进细菌纤维素或二醛氧化细菌纤维素的内部网络，然后浸渍在硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液中5-30min，清洗干净，得到壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中细菌纤维素BNC为管状或膜状均可；所述高碘酸钠水溶液的浓度为0.05～0.2M，pH＝2.0-5.0；乙二醇水溶液的体积百分浓度为1％。
所述细菌纤维素BNC为纯化后的纯BNC材料。
进一步，所述细菌纤维素BNC膜为市售产品。
进一步地，所述细菌纤维素BNC管由下列方法制备：
将含有木葡糖酸醋杆菌DHU-ATCC-1，或者ATCC-23770的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，静置培养，得到管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴2-4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。
所述步骤(1)中反应为水浴震荡条件下反应，其中温度为40-60℃，振荡转速为60-100rpm，振荡反应时间为1-6h；所述静置时间为5-60min。
所述步骤(2)中壳聚糖溶液的浓度为0.01-5％(w/v)，其中壳聚糖的分子量为5-800万，粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度为80-95％；壳聚糖溶液的溶剂为醋酸，浓度为0.5-5％(v/v)。
所述步骤(2)中高温高压处理具体为：温度50-125℃，优选100-125℃，时间20-180min，压力0-0.15MPa；
步骤(2)中利用振荡浸渍或者压力注射或抽滤的方法将经高温预处理的壳聚糖水溶液均匀扩散进氧化细菌纤维素或者细菌纳米纤维素的内部网络。
进一步，所述振荡浸渍的工艺参数为：温度20-35℃，转速100-200rpm，时间24-48h；
所述压力注射的工艺参数为：当BNC材料为管状时，则可通过0.01-0.1MPa的压力缓慢均匀地向管腔内注入壳聚糖溶液，保持1-5min。
所述步骤(2)中硫酸盐为可溶性硫酸盐，优选地为硫酸钠、硫酸镁、硫酸铁中的一种或几种；磷酸盐为可溶性磷酸盐，优选地为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中一种或几种；硫酸盐和磷酸盐水溶液浓度为0.1-20％(w/v)，pH值为0-7。
本发明提供一种载药壳聚糖微球-细菌纤维素神复合材料，所述壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料中的壳聚糖微球内包封药物或壳聚糖微球表面共价键接枝药物；其中药物为神经生长因子NGF。
进一步地，所述神经导管为具有3D纤维网络结构，壳聚糖微球在纤维网络内部和纤维表面形成；NGF包封于壳聚糖微球内部或共价接枝在壳聚糖微球表面。
本发明提供一种载药壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料的制备方法，包括：
将神经生长因子NGF溶于高温高压处理的壳聚糖溶液中，得到NGF-CS溶液，然后扩散进氧化细菌纤维素的内部网络，浸渍在硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液中，清洗，得到载药壳聚糖微球-细菌纤维素复合材料；其中NGF-CS溶液中NGF浓度为10-200ng/ml。
进一步，所述利用振荡浸渍或者压力注射的方法均匀扩散进氧化细菌纤维素的内部网络。
所述振荡浸渍的工艺参数为：温度20-35℃，转速100-200rpm，时间24-48h；
所述压力注射的工艺参数为：当BNC材料为管状时，则可通过0.01-0.1MPa的压力缓慢均匀地向管腔内注入壳聚糖溶液，保持1-5min。
本发明提供一种所述载药壳聚糖微球-细菌纤维素神复合材料作为经导管在制备神经修复与再生材料中的应用。
当细菌纤维素BNC为管状时得到的载药壳聚糖微球-细菌纤维素神复合材料直接作为神经导管，当细菌纤维素BNC为膜状时，得到的载药壳聚糖微球-细菌纤维素神复合材料可直接作为敷料，或者通过卷曲，缝合后作为神经导管。
本发明提供的技术先让壳聚糖高分子均匀分散于BNC材料的三维网络结构，然后通过硫酸根等离子降低壳聚糖溶解度的作用，在纤维网络内部和表面原位形成粒径均匀的壳聚糖微球。并可通过CS微球物理包封或共价接枝NGF并进行缓释，对神经细胞具备良好的生物相容性，能够促进受损神经的再生。
本发明提供了一种新的壳聚糖与细菌纤维素的复合方式，其优点在于充分保留了两种材料的功能，壳聚糖微球(chitosan microsphere,CSMS)或者壳聚糖纳米颗粒(chitosan nano-particles,CSNPs)不仅具备广谱抗菌作用，同时能够根据需要包封或共价接枝药物长效缓释。基于其优秀的广谱抗菌性和载药能力，获得的复合材料不仅可以用于组织工程，也可以用于止血材料和伤口敷料等用于皮肤组织的修复。本方法操作简单高效，无有害交联剂的引入。
有益效果
(1)本发明制备得到管壁均匀分散了缓释型壳聚糖微球的氧化细菌纤维素复合管或复合膜，通过硫酸根、磷酸根等离子降低壳聚糖溶解度，原位形成微球，复合均匀，方法简单高效，易推广。
(2)本发明通过离子凝胶法使壳聚糖原位形成微球的方法充分保留壳聚糖和细菌纤维素二者的功能，包括细菌纤维素的纳米纤维网络结构、力学性能和生物相容性，以及壳聚糖的抗菌性能。
(3)本发明中形成的壳聚糖微球可包封不同的药物，实现缓释以及不同的功能和应用。
(4)本发明制备得到的NGF缓释型壳聚糖微球-细菌纤维素神经导管有利于神经细胞的增长和黏附，可促进受损神经的修复。
(5)本发明复合管具备三维网络结构，壳聚糖微球(chitosan microsphere,CSMS)负载在纳米纤维的表面和网络中，药物可包封在壳聚糖微球内或通过共价键接枝在壳聚糖微球表面。当该复合管或复合膜用于神经导管时，药物可为神经生长因子(nerve growthfactor，NGF)。复合管制备方法包括：将NGF溶解在高温高压预处理过的壳聚糖溶液中，使该溶液均匀扩散进氧化细菌纤维素(dialdehyde oxidized bacterial cellulose,DABC)的纳米纤维网络内，再浸渍于硫酸盐水溶液中，通过硫酸根离子降低壳聚糖分子溶解度，使其析出，原位形成微球，得到具备NGF缓释效果的壳聚糖微球-细菌纤维素神经导管。本发明制备出的神经导管具备缓释NGF，体内可降解，促进神经细胞的增殖、黏附与分化和广谱抗菌等特性，引导受损神经的修复与再生。该材料制备方法简单，不引入有毒交联剂，复合均匀高效，为神经组织工程提供了一种新的材料和思路。
附图说明
图1为本发明实施例和对比例中使用的硅胶管反应装置，其中a为外硅胶管反应器，b为双硅胶管反应器，c为内硅胶管反应器。
图2中a为制备工艺示意图，b为实施例1中所使用的经过高压处理后不同浓度的壳聚糖溶液外观图，c为使用不同浓度壳聚糖溶液的制备的CSMS-BNC神经导管产品图。
图3为实施例1中得到的BNC和CSMS-BNC样品的红外光谱图。使用全反射傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)仪检测，扫描波长范围为500～4000cm-1。
图4为实施例1中得到的CSMS-BNC样品的场发射扫描电镜图。
图5为实施例1中得到的BNC和CSMS-BNC样品的力学性能；其中A为应力应变曲线，B为杨氏模量，C为拉伸强度，D为断裂伸长率。使用万能拉力试验机测试导管的力学性能。使用50N的探头在室温下以25mm/min的速度沿轴向拉伸长度为30mm的样品。到样品完全断裂后停止拉伸。测试参数包括应力-应变曲线，杨氏模量，断裂伸长率和拉伸强度。
图6为实施例2中得到的BNC,DABC和CSMS-DABC降解曲线。将50mg(W0)的冻干样品浸泡在装有10mL PBS(pH 7.4)的离心管中。离心管在60rpm/37℃的水浴震荡锅中反应。分别在第2，4，8，12周时取出离心管，冻干后称重(Wt)，按公式ΔW％＝(W0-Wt)/W0×100％计算样品的质量损失率。
图7为缓释型壳聚糖微球-氧化细菌纤维素神经导管的产品图；其中，a为实施例2中得到的二醛氧化细菌纤维素(DABC)，b为实施例2得到的壳聚糖微球-氧化细菌纤维素神经导管(CSMS-DABC)，c为实施例3得到包封NGF的氧化细菌纤维素-壳聚糖微球神经导管([email protected])。
图8为壳聚糖微球-氧化细菌纤维素缓释型神经导管的场发射扫描电镜图。其中，a为实施例2中的DABC神经导管，b为实施例2中的CSMS-DABC神经导管，c为实施例3中的[email protected]神经导管；其中标尺为10μm。
图9是实施例2得到的CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]导管对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果图，DABC为对照组。图9a为菌落与材料接触后经过稀释平板涂布后菌落生长情况，图上方的数字是菌液稀释倍数。图9b为根据9a所计算得到的活菌落数的log值。实验方法：根据ISO20743-2007，使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌评估CSMS-DABC和[email protected]的抗菌性能。将试管切成直径为1.6厘米的圆膜，并放置在24孔板，其内表面朝上。每个样品的表面涂上100μL细菌接种液(1×107至9×107cfu/mL)，在37℃培养箱中培养4小时。培养结束后，将样品转移至PBS缓冲液中，并通过涡旋混合器摇动以洗脱样品表面的细菌。连续稀释后，通过平板涂布法定量活细菌的数量。
图10为实施例3中得到的[email protected]中NGF的缓释曲线。实验方法：取2cm长的[email protected]神经导管置于离心管中，加入5mL的PBS溶液(含0.1mg/mL叠氮化钠)，每个样品三个平行。然后置于恒温水浴振荡锅中缓释NGF，反应条件为37℃，100rpm。分别于1、2、3、5、7、10、14和20天取0.5mL至EP管中，取样结束补充等量的PBS溶液后放回水浴锅继续缓释。对于取出的缓释液，使用NGF检测试剂盒检测检测不同时间对应的NGF浓度。
图11为雪旺细胞在实施例2得到的DABC、CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]导管上的增殖数据(CCK-8)。
图12为雪旺细胞在实施例2得到的DABC，CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]得到的导管上的形态，a为雪旺细胞在DABC上的形态，b为雪旺细胞在CSMS-DABC上的形态，c为雪旺细胞在[email protected]上的形态。
图13为大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC12)在实施例2和3得到的导管上轴突的生长情况的激光共聚焦照片：a为DABC神经导管上的细胞，b为CSMS-DABC神经导管上的细胞，c为[email protected]神经导管上的细胞。
图14为实施例2得到的CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]神经导管用于修复大鼠坐骨神经缺损模型的效果宏观图。A为大鼠缺损模型的建立和桥接，B为植入四周后再生神经宏观图，C为植入九周时再生神经宏观图。
图15为实施例2得到的CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]得到的神经导管引导的再生神经的免疫荧光染色照片。A和B分别为两种神经导管在植入四周和九周时引导的再生神经免疫荧光染色。
图16为实施例2得到的CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]得到的神经导管引导的再生神经的的组织学染色照片。A,B,C分别为第九周时再生神经的HE，TB，LFB染色照片。
图17为实施例2得到的CSMS-DABC和实施例3所得到的[email protected]得到的神经导管引导的再生神经的TEM照片。A和B分别为两种神经导管在植入四周和九周时引导的再生神经TEM图。
图18为实施例4中利用不同浓度壳聚糖制备的壳聚糖微球-氧化细菌纤维素神经导管的场发射扫描电镜图。其中，a是壳聚糖浓度为0.5％(w/v)的CSMS-DABC神经导管；b是壳聚糖浓度为1％(w/v)的CSMS-DABC神经导管；c是壳聚糖浓度为2％(w/v)CSMS-DABC神经导管。
图19是实施例5中不同性质的壳聚糖制备的CSMS-DABC神经导管的宏观形貌。其中，a中使用的壳聚糖为分子量10w，粘度50-200mPa·s，脱乙酰度80-90％；b中使用的壳聚糖为粘度＜200mPa·s，脱乙酰度大于85％；c中使用的壳聚糖为粘度＞400mPa·s；d中使用的壳聚糖为粘度50-100mPa·s，脱乙酰度＞95％。
图20是实施例5中不同性质的壳聚糖制备的CSMS-DABC神经导管的场发射扫描电镜图。其中，a中使用的壳聚糖为分子量10w，粘度50-200mPa·s，脱乙酰度80-90％；b中使用的壳聚糖为粘度＜200mPa·s，脱乙酰度大于85％；c中使用的壳聚糖为粘度＞400mPa·s；d中使用的壳聚糖为粘度50-100mPa·s，脱乙酰度＞95％。
图21是对比例3中使用三聚磷酸钠溶液制备的导管的场发射扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)参照专利201810585866.1的信息将含有木葡糖酸醋杆菌DHU-ATCC-1或者ATCC-23770的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为3mm、外径为8mm、长度为100mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。这里使用的外硅胶管反应器将一根3mm的玻璃棒固定在一根内径为8mm，外径为9mm的硅胶管中，长度均为100mm。
(2)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，别分将0.1、0.2、0.5、1和2g的壳聚糖溶解于上述醋酸水溶液中。制备了不同浓度的壳聚糖溶液，壳聚糖为分子量10w，粘度50-200mPa·s，脱乙酰度80-90％。将上述得到的CS溶液至于灭菌锅中115℃，处理30min。得到分子量和粘度更低的CS溶液。溶液外观如图2中b所示。
(3)将步骤1中得到的BNC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的BNC管，将干的BNC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤2得到的CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，直到干的BNC管膨胀，CS溶液均匀分布在BNC网络内。最后浸渍于1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)中10min，得到由不同浓度壳聚糖溶液制备的CSMS-BNC神经导管。
(4)图2为(a)制造CSNPs-BNC导管的工艺示意图；(b)高压处理后不同浓度CS溶液的外观；(c)不同CS浓度下产生的CSNPs-BNC导管的宏观形态。
(5)对步骤3中得到的CSMS-BNC神经导管进行如下表征
如图3所示为BNC和CSMS-BNC导管的红外光谱图，在CSMS-BNC的光谱中有酰胺键的特征峰，表明了CS成功地与BNC结合。
如图4所示为使用场发射扫描电镜拍摄的CSMS-BNC导管微观形貌照片。从图中可以看出，由壳聚糖形成的颗粒附着在BNC的纤维上。证明了这种复合方法成功制备了壳聚糖微球-细菌纳米纤维素复合材料。
如图5所示为BNC和CSMS-BNC导管的力学性能。从图中可以看出，壳聚糖提高了BNC的力学性能，且随着壳聚糖浓度的增加而提高。
实施例2
(1)参照专利201810585866.1的信息将含有木葡糖酸醋杆菌DHU-ATCC-1的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。这里使用的外硅胶管反应器将一根1.5mm的玻璃棒固定在一根内径为3.5mm，外径为4mm的硅胶管中，长度均为100mm。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠水溶液中，在水浴振荡锅中80rpm/min，50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，将0.2g的壳聚糖溶解于上述醋酸水溶液中。壳聚糖粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度大于85％。将上述得到的CS溶液至于灭菌锅中115℃，处理30min。得到小分子量的CS溶液。
(4)将步骤2中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤3得到的0.2％(w/v)CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，直到干的DABC管膨胀，CS溶液均匀分布在DABC网络内。最后浸渍于1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)中10min，得到CSMS-DABC神经导管。
(5)将上述得到的BNC、DABC、CSMS-DABC冻干后浸渍于无菌PBS溶液中，测定其三个样品降解速率，其降解曲线如图6所示，纵坐标表示质量损失率。由图可知，BNC降解非常缓慢，而被氧化后得到的DABC及CSMS-DABC在PBS中能够较快降解。这说明DABC及CSMS-DABC植入体内后可以降解。
实施例3
(1)将含有木葡糖酸醋杆菌的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。外硅胶反应器参数同实施例2。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠溶液中，在水浴震荡锅中80rpm/min,50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％的醋酸溶液100mL，将0.2g的壳聚糖溶解于上述醋酸溶液中。壳聚糖粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度大于85％。将上述得到的CS溶液至于灭菌锅中115℃，处理30min。得到小分子量的CS溶液。
(4)取步骤(3)中0.2％(w/v)CS溶液4mL于离心管中，向其中加入1mL 1μg/mL NGF溶液，得到NGF浓度为100ng/mL的NGF/CS混合溶液。
(5)将步骤(2)中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤(4)得到的NGF/CS混合溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入NGF/CS溶液，直到干的DABC管膨胀，NGF/CS溶液均匀分布在DABC网络内。最后浸渍于1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)中10min，得到[email protected]神经导管。
(6)对实施例2得到的DABC和CSMS-DABC，以及实施例3所得到的[email protected]进行如下表征。
如图7-a、7-b、7-c分别为DABC和CSMS-DABC和[email protected]的宏观形貌，携带壳聚糖微球的CSMS-DABC和[email protected]透明程度较DABC低，呈现乳白色。
如图4所示为场发射扫描电镜观察DABC和CSMS-DABC和[email protected]的微观形貌，分别如图8-a、8-b、8-c所示，CSMS-DABC和[email protected]中有微球，可以得知壳聚糖溶液成功的在DABC网络中形成了微球。
通过定时暴露法评价三种导管的抗菌性能，如图9所示，壳聚糖微球的引入为其提供了广谱抗菌性能。由9a可知，细菌接触CSMS-DABC和[email protected]后，活菌数量明显降低。由9b可知，其活菌数量远低于不具备抗菌性能的DABC，与DABC相比，CSMS-DABC和[email protected]抗菌率均达到90％以上。
[email protected]神经导管NGF的缓释曲线如图10所示，在持续20天的时间，能够检测出NGF，说明能够缓释NGF。
细胞毒性实验结果如图11所示，相比于DABC，壳聚糖微球有利于雪旺细胞的增殖，雪旺细胞在CSMS-DABC和[email protected]吸光度更高。
如图12所示为雪旺细胞在不同导管上形态，a为雪旺细胞在DABC上的形态，b为雪旺细胞在CSMS-DABC上的形态，c为雪旺细胞在[email protected]上的形态。证明壳聚糖微球和NGF的引入有利于雪旺细胞的增殖和黏附。
如图13所示为大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC12)在导管上轴突的生长情况：a为氧化细菌纤维素的激光共聚焦照片，b为CSMS-DABC神经导管的激光共聚焦照片，c为[email protected]神经导管的激光共聚焦照片；可以发现[email protected]导管上的PC12细胞出现了轴突，且细胞骨架与细胞核的面积比增大，可以证实[email protected]可促进PC12细胞的分化。
如图14所示为CSMS-DABC组，[email protected]组和自体移植组(Autograft)植入后再生神经的宏观照片。A为大鼠缺损模型的建立和桥接。B为植入四周后再生神经宏观照片，C为植入九周时再生神经宏观照片。由图可知，两种神经导管均成功引导了神经再生，且含有NGF的神经导管再生的神经比不含NGF的粗壮，证实了[email protected]能够释放NGF，对神经再生有促进效果。其中作为临床上的金标准，自体移植组的神经最粗，形态最为饱满，含有NGF神经导管再生的神经已与它很接近。
如图15所示为CSMS-DABC组，[email protected]组和自体移植组(Autograft)植入后再生的神经的免疫学染色，为别对NF200和S100两种蛋白进行了染色。A和B分别为两种神经导管在植入四周和九周时引导的再生神经免疫荧光染色，C为自体移植组的免疫荧光染色结果。由图可知，[email protected]神经导管引导的再生神经中S100和NF200蛋白阳性面积显著高于CSMS-DABC，阳性面积接近于自体移植组，这证明了可释放NGF的[email protected]神经导管可有效修复受损神经。
如图16所示为CSMS-DABC组，[email protected]组和自体移植组(Autograft)植入九周后再生神经的组织学染色，A、B、C分别为HE、TB、LFB染色。由图可知，有大量的雪旺细胞和髓鞘在再生的神经内，这证明了两种导管成功引导了神经的再生。其中，自体移植组的髓鞘和雪旺细胞数量最多，而[email protected]接近于自体移植组。
如图17所示为CSMS-DABC组，[email protected]组和自体移植组(Autograft)植入第四和九周后再生神经超微结构TEM照片。A为三组四周时的超微结构，B为三组九周时的超微结构。由图可知，在第四周的时候，自体移植组中的有髓神经数量和髓鞘厚度均显著高于CSMS-DABC组和[email protected]组。随着修复时间的变长，CSMS-DABC和[email protected]神经导管引导再生神经的有髓神经的数量和髓鞘厚度都在显著增加；其次[email protected]组修复效果显著优于CSMS-DABC组，在第九周的时候接近于自体移植组。
实施例4
(1)将含有木葡糖酸醋杆菌的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠水溶液中，在水浴振荡锅中80rpm/min,50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，分别将0.5g，1g，2g的壳聚糖溶解于上述醋酸水溶液中。壳聚糖粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度大于85％。将上述得到的CS溶液至于灭菌锅中115℃，处理30min。得到小分子量的CS溶液。
(4)将步骤2中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤3得到的CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，直到干的DABC管膨胀，CS溶液均匀分布在DABC网络内。最后浸渍于1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)中10min，分别得到CS浓度为0.5％,1％,2％CSMS-DABC神经导管。
(5)对CS浓度为0.5％,1％,2％CSMS-DABC神经导管使用SEM观察其微观形貌，分别如图18中a、b、c所示。由图可知，随着壳聚糖浓度的增加，微球直径也增加。
实施例5
(1)将含有木葡糖酸醋杆菌的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠水溶液中，在水浴振荡锅中80rpm/min，50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，将四种不同粘度和分子量的壳聚糖1g溶解于上述醋酸水溶液中。四种壳聚糖分别命名为:a(分子量10w，粘度50-200mPa·s，脱乙酰度80-90％)；b(粘度＜200mPa·s，脱乙酰度大于85％)；c(粘度＞400mPa·s)；d(粘度50-100mPa·s，脱乙酰度＞95％)。将上述得到的CS溶液置于灭菌锅中115℃，处理30min。分别得到a,b,c,d四种CS溶液。
(4)将步骤2中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤3得到的a,b,c,d四种CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，直到干的DABC管膨胀，CS溶液均匀分布在DABC网络内。最后浸渍于1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)中10min，得到由a,b,c,d四种不同壳聚糖制备的CSMS-DABC神经导管。
(5)对其形貌进行表征，宏观形貌如图19所示，CSMS复合管的颜色与壳聚糖溶液的颜色相似。微观形貌如图20所示，壳聚糖性质不同对微球的形貌有影响。
对比例1
(1)参照专利201810585866.1的信息将含有木葡糖酸醋杆菌的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1a所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠水溶液中，在水浴振荡锅中80rpm/min,50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，将0.2g的壳聚糖溶解于上述醋酸水溶液中。壳聚糖粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度大于85％。将上述得到的CS溶液至于灭菌锅中115℃，处理30min。得到小分子量的CS溶液。
(4)将步骤2中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤3得到的0.2％(w/v)CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，直到干的DABC管膨胀，CS溶液均匀分布在DABC网络内。最后浸渍于1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝8.5)中10min，壳聚糖分子不能在DABC网络内部形成微球，且不具备抗菌效果。
对比例2
(1)将含有木葡糖酸醋杆菌的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠水溶液中，在水浴振荡锅中80rpm/min,50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，将1g的壳聚糖溶解于上述醋酸水溶液中，得到1％CS溶液。壳聚糖粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度大于85％。
(4)将步骤2中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤3得到的未经过高温高压处理的CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，未经高温高压处理的CS分子无法通过空隙进入DABC网络内部，使得DABC管无法恢复原来的状态，不能复胀，不能再DABC内部均匀的形成微球。
对比例3
(1)将含有木葡糖酸醋杆菌的培养基注入已灭菌的外硅胶管反应装置(如图1所示)的空腔中，30℃静置培养10天，获得内径为1.5mm、外径为3.5mm、长度为50mm的管状细菌纤维素，将管状细菌纤维素置于1％(w/v)的NaOH水溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复洗涤置换至中性得到纯的BNC管。
(2)将步骤1得到的BNC管浸渍于50mL 0.05M高碘酸钠水溶液中，在水浴振荡锅中80rpm/min,50℃反应2h，得到DABC神经导管。
(3)用去离子水配置浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液100mL，将0.2g的壳聚糖溶解于上述醋酸水溶液中。壳聚糖粘度为50-800mPa·s，脱乙酰度大于85％。将上述得到的CS溶液至于灭菌锅中115℃，处理30min。得到小分子量的CS溶液。
(4)将步骤2中得到的DABC管中的自由水用滤纸吸收除掉，得到干的DABC管，将干的DABC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内为步骤3得到的1％(w/v)CS溶液，以0.03MPa的径向压力缓慢均匀地向管腔内注入CS溶液，直到干的DABC管膨胀，CS溶液均匀分布在DABC网络内。最后浸渍于1％(w/v)三聚磷酸钠水溶液(pH＝10)中10min，使用SEM观察其微观形貌，可知壳聚糖分子能够在DABC网络中沉淀，使纤维直径变粗，但无法形成微球，且不具备抗菌效果，如图21所示。
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